Name: three and four-dimensional visualization and analysis approaches to study vertebrate axial elongation and segmentation
Uploaded: 2021-02-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation at JoVE.com

Vi vil takke Olivier Pourquié og Alexander Aulehla for LuVeLu-reporterstammen, SunJin-laboratoriet for RapiClear-testprøven, Hugo Pereira for hjelpen med å bruke BigStitcher, Nuno Granjeiro for å bidra til å sette opp live bildeapparatet, IGC-dyreanlegget og tidligere og nåværende medlemmer av Mallo-laboratoriet for nyttige kommentarer og støtte i løpet av dette arbeidet.
Vi takker den tekniske støtten til IGCs Advanced Imaging Facility, som støttes av portugisisk finansiering ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 og ref # PTDC / BII-BTI / 32375 / 2017, finansiert av Lisboa Regional Operational Programme (Lisboa 2020), i henhold til partnerskapsavtalen for Portugal 2020, gjennom European Regional Development Fund (FEDER) og Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugal). Arbeidet beskrevet i dette manuskriptet ble støttet av tilskudd LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, Portugal) og SCML-MC-60-2014 (Santa Casa da Misericórdia, Portugal) til M.M., forskningsinfrastrukturen Congento, prosjekt LISBOA-01-0145-FEDER-022170, og PhD fellowship PD/BD/128426/2017 til A.D.

Eksperimenter som involverte dyr fulgte den portugisiske (Portaria 1005/92) og europeiske (direktiv 2010/63/EU) lovgivning om bolig, husdyrhold og velferd. Prosjektet ble gjennomgått og godkjent av Etikkkomiteen i 'Instituto Gulbenkian de Ciência' og av den portugisiske nasjonale enheten Direcção Geral de Alimentação e Veterinária (lisensreferanse: 014308).
1. Prøvepreparering for 3D- og 4D-avbildning
MERK: Her gir vi en detaljert beskrivelse av hvordan du dis...

Aksial forlengelse og segmentering er to av de mest komplekse og dynamiske prosessene som oppstår under virveldyr embryonal utvikling. Bruk av 3D- og 4D-avbildning med encellet sporing har i noen tid blitt brukt til å studere disse prosessene i både sebrafisk og kyllingembryoer, der tilgjengelighet og kulturforhold letter komplekseavbildninger 19,44,45,46,47,48,49 <sup class="xref...

Virveldyr kroppsaksedannelse er en svært kompleks og dynamisk prosess som oppstår under embryonal utvikling. På slutten av gastrulation [i musen, rundt embryonal dag (E) 8.0], en gruppe epiblast forfedre celler kjent som nevromesodermale forfedre (NMPs) bli en nøkkeldriver for aksial forlengelse i et hode til hale sekvens, generere nevrale rør og paraksial mesodermal vev under nakke, stamme og hale formasjon 1,2,3,4 . Interessant nok synes posisjonen som disse NMPene okkuperer i kaudal epiblast å spille en nøkkelrolle i beslutningen om å differensiere til mesoderm eller neuroectoderm5. Selv om vi for tiden mangler et presist molekylært fingeravtrykk for NMPer, er disse cellene generelt antatt å være co-express T (Brachyury) og Sox2 5,6. De eksakte mekanismene som regulerer NMP-skjebnebeslutninger (dvs. om de tar nevrale eller mesodermale ruter) begynner bare å bli nøyaktig definert. Tbx6 uttrykk i den primitive streken regionen er en tidlig markør for NMP skjebne beslutning, som dette genet er involvert i induksjon og spesifikasjon av mesoderm 6,7. Interessant nok synes tidlige mesodermceller å uttrykke høye nivåer av Epha18, og Wnt / β-catenin signalering, samt Msgn1 ble også vist å spille viktige roller i paraksial mesoderm differensiering og somite formasjon 9,10. En komplett romlig-temporal analyse av NMPer på en encellet nivå vil sikkert være medvirkende til å forstå de molekylære mekanismene som kontrollerer mesoderm-spesifikasjonen fullt ut.
Dannelsen av somitter (ryggvirvler forløpere) er et sentralt trekk ved vertebrater. Under aksial forlengelse blir det paraksiale mesodermet segmentert i en rekke bilaterale repeterende enheter kjent som somitter. Antall somitter og tiden som kreves for dannelsen av nye segmenter varierer mellom art11,12. Somitogenese innebærer periodiske signaloscillasjoner (kjent som "segmenteringsklokken") som kan observeres av det sykliske uttrykket for flere gener av Notch, Wnt og Fgf signalveier i det presomitiske mesodermet (f.eks. Lfng)11,12. Den nåværende modellen av somitogenese postulerer også eksistensen av en "modningsbølgefront", en serie komplekse signalgradienter som involverer Fgf, Wnt og retinoinsyresignalering som definerer posisjonen til den bakre grensen til hver ny somite. En koordinert interaksjon mellom "segmenteringsklokken" og "modningsbølgefronten" er derfor grunnleggende for genereringen av disse ryggvirvlenes forløpermoduler, da perturbasjoner i disse viktige morfogenetiske prosessene kan resultere i embryonal dødelighet eller i dannelsen av medfødte misdannelser (f.eks. skoliose)13,14,15.
Til tross for betydelige nylige fremskritt innen avbildningsteknikker, bioimageanalysemetoder og programvare, er de fleste studier av aksial forlengelse og somitogenese fortsatt avhengige av enkle/ isolerte todimensjonale bildedata (f.eks. seksjoner), som ikke tillater full flerdimensjonal vevsvisualisering og kompliserer klar differensiering mellom patologiske misdannelser (dvs. på grunn av mutasjoner) vs normal morfologisk variasjon som oppstår under embryonisk utvikling16. . Imaging i 3D har allerede avdekket nye morfogenetiske bevegelser, tidligere ikke identifisert av standard 2D-metoder 17,18,19,20, fremhever kraften i toto avbildning for å forstå mekanismene for virveldyr somitogenese og aksial forlengelse.
3D- og 4D-mikroskopi av museembryoer, spesielt levende avbildning, er teknisk utfordrende og krever kritiske trinn under prøvepreparering, bildeinnhenting og forhåndsbehandling av data for å muliggjøre nøyaktig og meningsfull romlig-temporal analyse. Her beskriver vi en detaljert protokoll for levende avbildning og helmontert immunfluorescensfarging av museembryoer, som kan brukes til å studere både NMPer og mesodermale celler under aksial forlengelse og segmentering. I tillegg beskriver vi også en protokoll for optisk projeksjonstomografi (OPT) av eldre embryoer og fostre, som gjør det mulig for 3D i to visualisering og kvantifisering av patologiske abnormiteter som kan oppstå somitogenese (f.eks. benfusjon og skoliose)13,21,22. Til slutt illustrerer vi kraften i 3D-avbildningsrekonstruksjoner i studiet og undervisningen av virveldyrsegmentering og aksial forlengelse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose low gelling temperature</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Used to mounting embryos (e.g. for OPT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira software</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Brachyury (Goat polyclonal)</td>
			<td>R and D Systems</td>
			<td>AF2085 RRID:AB_2200235</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92494 RRID:AB_10585428</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tbx6 (Goat polyclonal)</td>
			<td>R and D Systems</td>
			<td>AF4744 RRID:AB_2200834</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9393 RRID:AB_477163</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-goat 488 (Donkey polyclonal)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11055 RRID:AB_2534102</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal)</td>
			<td>ThermoFisher &#160; Scientific</td>
			<td>A10042 RRID:AB_2534017</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Alcohol (99+%)</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to clear embryos (component of BABB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Benzoate (99+%)</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to clear embryos (component of BABB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>P6154</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x20 mm #0</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>100um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x20 mm #1</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>170um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x60 mm #1.5</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>To use as &#8220;slides&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8217;,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D3571</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drishti software</td>
			<td>(open source)</td>
			<td>-</td>
			<td>Free software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ED2SS</td>
			<td>For demineralization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ software</td>
			<td>(open source)</td>
			<td>-</td>
			<td>Free software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>NZYtech</td>
			<td>MB01401</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens software</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone defined fetal bovine serum</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#HYCLSH30070.03</td>
			<td>For live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution 30 %</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>1085971000</td>
			<td>For clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane / Oxford instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacers</td>
			<td>SunJin Lab</td>
			<td>(varies)</td>
			<td>Use as spacers for preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#25030&#8211;024</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low glucose DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11054020</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7167</td>
			<td>To dissect embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC20847.307</td>
			<td>For dehydration and rehydration steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl salicylate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6752</td>
			<td>Used to clear embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Used in solution to fix embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P0781</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline solution)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0615-500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear</td>
			<td>SunJin Laboratory</td>
			<td>RapiClear 1.52</td>
			<td>Used to clear embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secure-Sea hybridization chambers</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5474</td>
			<td>Use as spacers for preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>simLab software</td>
			<td>SimLab soft</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide, depression concave glass - 75x25 mm</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>To mount thick embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three and four-dimensional visualization and analysis approaches to study vertebrate axial elongation and segmentation

Somitogenese er et kjennetegn på virveldyr embryonal utvikling. I årevis har forskere studert denne prosessen i en rekke organismer ved hjelp av et bredt spekter av teknikker som omfatter ex vivo og in vitro tilnærminger. Imidlertid er de fleste studier fortsatt avhengige av analysen av todimensjonale (2D) bildedata, noe som begrenser riktig evaluering av en utviklingsprosess som aksial forlengelse og somitogenese som involverer svært dynamiske interaksjoner i et komplekst 3D-rom. Her beskriver vi teknikker som gjør det mulig for mus live bildeinnsamling, datasettbehandling, visualisering og analyse i 3D og 4D å studere cellene (f.eks. nevromesodermale forfedre) involvert i disse utviklingsprosessene. Vi tilbyr også en trinnvis protokoll for optisk projeksjonstomografi og helmontert immunfluorescensmikroskopi i museembryoer (fra prøvepreparering til bildeinnhenting) og viser en rørledning som vi utviklet for å behandle og visualisere 3D-bildedata. Vi utvider bruken av noen av disse teknikkene og fremhever spesifikke funksjoner i forskjellig tilgjengelig programvare (f.eks. Fiji/ImageJ, Drishti, Amira og Imaris) som kan brukes til å forbedre vår nåværende forståelse av aksial forlengelse og somittdannelse (f.eks. 3D-rekonstruksjoner). Til sammen understreker teknikkene her betydningen av 3D-datavisualisering og analyse i utviklingsbiologi, og kan hjelpe andre forskere til bedre å adressere 3D- og 4D-bildedata i sammenheng med virveldyraksial forlengelse og segmentering. Til slutt bruker arbeidet også nye verktøy for å lette undervisningen av virveldyr embryonal utvikling.

De representative resultatene vist i dette papiret for både levende og immunfluorescence imaging, ble oppnådd ved hjelp av et to-foton system, med en 20 × 1.0 NA vann mål, eksitasjon laser innstilt til 960 nm, og GaAsP fotodetektorer (som beskrevet i Dias et al. (2020)43. Optisk projeksjonstomografi ble gjort ved hjelp av en spesialbygd OPenT-skanner (som beskrevet i Gualda et al. (2013)28.
Levende bildebehandling (4D-analyse)</strong...

Watch this Scientific Journal Video about Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation at JoVE.com

Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation

Her beskriver vi beregningsverktøy og metoder som tillater visualisering og analyse av tre og firedimensjonale bildedata av museembryoer i sammenheng med aksial forlengelse og segmentering, oppnådd ved optisk totoprojeksjonstomografi, og ved levende avbildning og helmontert immunfluorescensfarging ved hjelp av multifotonmikroskopi.

Tre og firedimensjonale visualiserings- og analysetilnærminger for å studere vertebrataksial forlengelse og segmentering

Somitogenesis is a hallmark of vertebrate embryonic development. For years, researchers have been studying this process in a variety of organisms using a ...

Organogenesestadiene i museembryoene forblir dårlig studert delvis på grunn av den vanskelige visualiseringen av embryokompleksstrukturene. Denne protokollen beskriver teknikker som tillater 3D- og 4D-visualisering og analyse av museembryoer under aksial forlengelse og segmentering. Den største fordelen med denne teknikken er at den tillater forskere å studere og vise de komplekse strukturene til museembryoet som 3D-dynamiske objekter.Denne protokollen inneholder teknikker som kan brukes i studiet av medfødte misdannelser som påvirker ryggvirvlene og ryggmargen til pattedyr, for eksempel skoliose. Disse teknikkene kan også brukes med in vitro-modellsystemer, og dermed tillate studiet av menneskelig embryonal utvikling. For å forberede museembryoer mellom embryonal dag 8,25 og embryonal dag 10,5 for levende avbildning, disseker embryoene i forvarmet M2-medium ved 37 grader Celsius.Fjern eggeplommesekken forsiktig ved hjelp av rene tang og vask embryoet en gang med friskt M2-medium for å fjerne blod og rusk som produseres under disseksjonen. Under live imaging prosedyren, inkubere embryoer i lav glukose DMEM medium supplert med 10%HyClone definert FBS, to millimolar L-glutamin, og 1% penicillin streptomycin i en 37 grader Celsius oppvarmet kammer og en 65% oksygen med 5% karbondioksid miljø. For å forberede lignende scenemusembryoer for immunfluorescensmikroskopi, i stedet for å bruke oppvarmet M2, dissekerer embryoene i kald PBS og fikser i 4% paraformaldehyd.Etter å ha utført hele mount immunfluorescence farging protokollen som beskrevet i teksten manuskriptet, vev clearance kan oppnås ved hjelp av RapiClear. Først plasserer du embryoene i midten av en 75 x 25 millimeter depresjon konkav glasssklie, fjern all PBST i mikroskopdepresjonsglidningen og legg til 200 mikroliter clearingløsning, og dekk deretter glidepreparatet med en boks. Etter 10 minutter beskyttet mot lyset, når embryoer begynner å bli gjennomsiktige, erstatt ryddeløsningen og vent ytterligere 20 minutter.Topp embryoet med en dekslelip fra den ene siden og beveger seg forsiktig mot den andre. Eksemplet er nå klart for avbildning. For rydding ved bruk av metylsilisylat eller BABB, sørg for at embryoene er helt dehydrert i 100% metanol og start deretter serien babb og metanol med 20% påfølgende økning i konsentrasjon og en 20-minutters inkubasjon for hvert trinn.Når BABB-løsningen når 100%, gjør to ekstra endringer for en ny løsning. Forbered en 20 x 60 millimeter 1,5 dekselglasssklie for å montere embryoene for å unngå å komprimere prøven. Tilsett avstandsstykker laget av tynne metallskiver.Overfør de ryddede embryoene til mikroskopets lysbilder ved hjelp av en tannpirker, en fin bomullsspiss eller en Pasteur pipette. Tilsett deretter en dråpe monteringsmedium, dekk med et annet lignende dekselglass og tetning med smeltet parafin for bedre å stabilisere preparatet for å unngå bobler. Plasser dekslene på den ene siden og skyv den deretter gradvis og forsiktig sidelengs, og tilsett mer medium om nødvendig.Prøven er nå klar til å avbildes i mikroskopet. Bruk Fiji/ImageJ til å omplassere embryoet til en standardisert fremre bakre og dorsal-ventral akseposisjon etter avbildning. Reduser datasettstørrelsen i Fijis bilde, og skaler deretter og sett inn X-, Y- og Z-skaleringsverdiene som er nødvendige for å redusere datasettet til mindre enn 200 megabyte.Kontroller at det er merket av for Opprett nytt vindu . Gå deretter til plugins og åpne 3D Viewer. I 3D Viewer-vinduet klikker du over embryoet for å velge det, slik at en rød 3D-boks vises.Når du bruker denne modusen, kontrollerer du rotasjonen av datasettet med en mus. Etter å ha sikret den perfekte plasseringen av embryoet, velger du rediger, transformerer bildet og eksporterer transformert bilde i 3D Viewer-vinduet. Undersøk de forskjellige ortogonale planene, gå deretter til bildet, stable og velg ortogonale visninger.Når embryoet er riktig plassert, velger du menyen i 3D-visningsprogrammets vindu, og deretter redigerer, transformerer og lagrer du transformasjonsmatrisen i en tekstfil med en filtype. Åpne tekstfilen ved hjelp av Fiji/ImageJ, fjern de to første linjene og lagre på nytt. Dette oppretter en transformasjonsmatrisefil som er kompatibel med TransformJ-plugin-modulen.Bytt til datasettet med full oppløsning og utfør operasjonspluginene TransformJ og TransformJ affine. I det nye vinduet blar du gjennom for å søke etter matrisefilen som er lagret tidligere, velger den kubiske B-spline-interpoleringen og tar på nytt isotropisk, og deretter klikker du OK. Etter riktig omplassering av embryoet, trim det meste av det opprettede tomme rommet. For å utføre et fullstendig Z-projeksjonsbilde, klikk på stabler, Z Project, og velg maksimal intensitet.Tegn deretter minimum avkastning som inneholder hele embryoet i X og Y.Switch til de opprinnelige datasettbildevinduene ved å klikke på rediger, valg, gjenopprett markering og beskjæring ved å velge bilde. Trim sektorene i begynnelsen og slutten som ikke krysser embryovev ved å velge bilde- og åpningsstakker, klikk på verktøy, velg stykkefjerneren, og spesifiser den første og siste sektoren som skal fjernes, og sørg for å endre økningen til en. Utfør eventuelt videre analyse og 3D-rekonstruksjoner ved hjelp av instruksjonene i tekstmanuskriptet.For å utføre 3D-analyse av mer utviklede embryoer, disseker embryonal dag 18,5 fostre i kald PBS, fjern alle ekstra embryonale membraner, og vask deretter fostrene flere ganger i fersk PBS for å fjerne blod og rusk produsert under disseksjonsprosedyren. Fikse fostre i 4%PFA laget i PBS ved fire grader Celsius i fem til syv dager. Etter å ha vasket embryoet flere ganger i PBS, dehydrerer fostrene ved å inkubere i 10% 10 påfølgende økninger av metanolløsninger til 100% metanol er nådd.Utfør hver inkubasjon i 25 minutter på en shaker ved romtemperatur. Deretter inkuberer fostre separat på en shaker først i en dag i 5% hydrogenperoksid i metanol og deretter i 10% hydrogenperoksid i metanol i opptil tre dager til embryoene mister all naturlig pigmentering. Gradvis rehydrere embryoene i en omvendt metanolserie i demineralisert vann med hver inkubasjon i 20 minutter på en shaker ved romtemperatur, og vask deretter embryoene tre ganger i 30 minutter per vask i demineralisert vann.For å legge inn fostre i 1% agarose blokker, fyll et 50 milliliter plastrør eller sprøyte med smeltet agarose, plasser deretter fosteret i agarose i vertikal stilling og opprettholde denne posisjonen med tang under størkning av agarose. Plasser formen med blokken ved fire grader Celsius i 30 minutter for agarose å fullstendig geleide, fjern deretter agaroseblokken med fosteret fra formen og legg den i en beholder med demoralisert vann. Utfør fosterdehydrering gradvis med 10% økning i metanolkonsentrasjon fortynnet i demineralisert vann eller PBS, og hold prøven i metanolkonsentrasjon i minst 45 minutter ved romtemperatur på en shaker til 100% metanol er nådd.Fjern fostrene ved å flytte dem gjennom en serie BABB-løsning og metanol i 2,5 timer i hver konsentrasjon med 25% økning i BABB-konsentrasjon til den når 100% BABB. Bytt ut BABB-løsningen med en frisk hver dag til fosteret er helt gjennomsiktig. Denne prosessen kan ta tre til fem dager.Bruk lim til å feste den slettede agaroseblokken til motoraksen til OPT-skanneren, juster deretter optikken for å få et bilde av hele fosteret og fortsett å skaffe et fullstendig projeksjonsdatasett. 4D live bildeteknikk muliggjør dynamisk analyse av LuVeLu reporteruttrykk og embryonal dag 8,5 Snai1-betinget knockout embryoer. Sammen med det normale LuVeLu-signalet på det presomitiske mesodermet, viser Snai1-betingede knockout-embryoer LuVeLu-uttrykk i den ektopiske bulen som oppstår fra den primitive streken.Hele mount immunfluorescence analyser tillater påvisning av potensielle NMPs og viktige regulatorer av mesoderm differensiering. Hvite og gule piler fremhever forskjeller i mutant og vill type embryoer. 3D-gjengivelse av hele mount immunostainings muliggjør en bedre forståelse av vevet eller strukturen i studien.I dette tilfellet ble plasseringen av potensielle NMPer i haleknoppen undersøkt. 3D-vevsrekonstruksjoner er også viktige for å forstå og karakterisere morfologiske defekter i museembryoer. Interaktiv visualisering av 3D-rekonstruksjon kan også bygges i brukervennlige formater.For eksempel i en PDF-fil. Disse 3D embryo kaudale strukturer kan brukes til å illustrere kraften i 3D-modeller til et mer generelt publikum og for å hjelpe i studien i å undervise en virveldyraksial forlengelse og segmentering. Til slutt er 3D i toto visualisering av mer utviklede museembryoer mulig ved hjelp av OTP-mikroskopiteknikken.Animerte gjengivelser vises her, og fremhever viktige skiver av embryonal dag 18,5 fostre. Det viktigste å huske er at resultatet må forbli en trofast representasjon av det som observeres i embryoet. Forskere kan bruke disse metodene til å gå utover å presentere bare statisk for bildene, men inkluderer også videoer, tredimensjonale rekonstruksjoner og til og med interaktive 3D-modeller av dataene sine.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Differensiering av Human Neural Stem Cell Line on tredimensjonal kulturer, Analyse av mikroRNA og Antatte målgener

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex vivo Culture of Faryngeal Arches å studere Hjerte og Muscle stamfedre og deres nisje

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

Visualisering av chondrocyttransplantasjon innskyting og Directional spredning via Zebrabow Klonal Cell Analysis i Embryonic Meckels Brusk

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Real Time Kinetic Måling og visualisering av somatiske Omprogrammering

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Analyse av retinsyre-indusert Neural Differensiering av mus embryonale stamceller i to og tre-dimensjonale embryoidlegemer

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisering og kvantitativ analyse av embryonisk angiogenese i<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Bruke i Vivo og vev og celle Explant tilnærminger å studere Morphogenesis og patogenesen av embryonale og Perinatal Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Correlative super-oppløsning og elektronmikroskop løse Protein lokalisering i sebrafisk netthinnen

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Tredimensjonal gjengivelse og analyse av Immunolabeled, avklart menneskelige Placental Villous vaskulære nettverk

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Beregningsorientert analyse av Caenorhabditis elegans Germline å studere distribusjon av kjerner, proteiner og Cytoskeleton

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...