Name: three and four-dimensional visualization and analysis approaches to study vertebrate axial elongation and segmentation
Uploaded: 2021-02-28T14:00:00
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Gostaríamos de agradecer a Olivier Pourquié e Alexander Aulehla pela estirpe repórter da LuVeLu, o laboratório SunJin para a amostra de teste RapiClear, Hugo Pereira pela ajuda usando o BigStitcher, Nuno Granjeiro para ajudar a montar o aparelho de imagem ao vivo, a instalação animal do IGC e membros passados e presentes do laboratório Mallo para comentários e apoio úteis durante este trabalho.
Agradecemos o apoio técnico do Advanced Imaging Facility da IGC, que é apoiado pelo ref de financiamento português# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 e ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017, co-financiado pelo Lisboa Regional Operational Programme (Lisboa 2020), no âmbito do Acordo de Parceria Portugal 2020, por meio do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER) e fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT). O trabalho descrito neste manuscrito foi apoiado por subvenções LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, Portugal) e SCML-MC-60-2014 (Santa Casa da Misericórdia, Portugal) a M.M., a infraestrutura de pesquisa Congento, o projeto LISBOA-01-0145-FEDER-022170 e a bolsa de doutorado PD/BD/128426/2017 para A.D.

Experimentos envolvendo animais seguiram as legislações portuguesa (Portaria 1005/92) e europeia (Diretiva 2010/63/UE) relativas à habitação, à pecuária e ao bem-estar. O projeto foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética do Instituto Gulbenkian de Ciência e pela Entidade Nacional Portuguesa, 'Direcção Geral de Alimentação e Veterinária' (referência de licença: 014308).
1. Preparação da amostra para imagens 3D e 4D
NOTA: Aqui fornecemos uma descri...

Alongamento axial e segmentação são dois dos processos mais complexos e dinâmicos que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário vertebrado. O uso de imagens 3D e 4D com rastreamento unicelular tem sido aplicado, há algum tempo, para estudar esses processos tanto em embriões de zebrafish quanto de frango, para os quais as condições de acessibilidade e cultura facilitam imagens complexas 19,44,45,46,47,48,49</sup...

A formação do eixo do corpo vertebrado é um processo altamente complexo e dinâmico que ocorre durante o desenvolvimento embrionário. No final da gastruição [no camundongo, em torno do dia embrionário (E) 8.0], um grupo de células progenitoras epiblastos conhecidas como progenitores neuromesodérmicos (NMPs) tornam-se um driver chave de extensão axial em uma sequência cabeça a cauda, gerando o tubo neural e tecidos mesodérmicos paraxial durante a formação do pescoço, tronco e cauda 1,2,3,4 . Curiosamente, a posição que esses NMPs ocupam no epiblasto caudal parece desempenhar um papel fundamental na decisão de diferenciar-se em mesoderme ou neuroectoderme5. Embora atualmente não tenhamos uma impressão digital molecular precisa para NMPs, essas células são geralmente pensadas para co-expressar T (Brachyury) e Sox2 5,6. Os mecanismos exatos que regulam as decisões de destino do NMP (ou seja, se tomam rotas neurais ou mesodérmicas) estão apenas começando a ser precisamente definidos. A expressão tbx6 na região primitiva é um marcador inicial da decisão de destino NMP, pois este gene está envolvido na indução e especificação do mesoderme 6,7. Curiosamente, as primeiras células de mesoderme parecem expressar altos níveis de Epha18, e sinalização Wnt/β-catenin, bem como Msgn1 também foram mostrados para desempenhar papéis importantes na diferenciação paraxial de mesoderme e formação de somite 9,10. Uma análise espacial-temporal completa dos NMPs a um nível unicelular certamente será fundamental para entender completamente os mecanismos moleculares que controlam a especificação do mesoderme.
A formação de somites (precursores de vértebras) é uma característica fundamental dos vertebrados. Durante o alongamento axial, o mesoderme paraxial torna-se segmentado em uma série de unidades bilaterais repetitivas conhecidas como somites. O número de somites e o tempo necessário para a formação de novos segmentos variam entre as espécies11,12. A somitogênese envolve oscilações periódicas de sinalização (conhecidas como "relógio de segmentação") que podem ser observadas pela expressão cíclica de vários genes das vias de sinalização Notch, Wnt e Fgf no mesoderme presomático (por exemplo, Lfng)11,12. O modelo atual de somitogênese também postula a existência de uma "frente de onda de maturação", uma série de gradientes de sinalização complexos envolvendo fgf, Wnt e sinal de ácido retinóico que definem a posição da borda posterior de cada novo somite. Uma interação coordenada entre o "relógio de segmentação" e a "frente de onda de maturação" é, portanto, fundamental para a geração desses módulos precursores de vértebras, pois perturbações nesses principais processos morfogenéticos podem resultar em letalidade embrionária ou na formação de malformações congênitas (por exemplo, escoliose)13,14,15.
Apesar dos avanços recentes substanciais em técnicas de imagem, métodos de análise de bioimagem e software, a maioria dos estudos de alongamento axial e somitogênese ainda dependem de dados de imagem bidimensionais únicos/isolados (por exemplo, seções), o que não permite uma visualização completa do tecido multidimensional e complica a clara diferenciação entre malformações patológicas (ou seja, devido a mutações) versus variação morfológica normal ocorrendo durante o desenvolvimento embrionário16 . A imagem em 3D já descobriu novos movimentos morfogenéticos, anteriormente não identificados pelos métodos 2D padrão 17,18,19,20, destacando o poder do into imaging para entender os mecanismos da somitogênese vertebrado e extensão axial.
A microscopia 3D e 4D de embriões de camundongos, particularmente imagens vivas, são tecnicamente desafiadoras e requerem passos críticos durante a preparação da amostra, aquisição de imagens e pré-processamento de dados, a fim de permitir uma análise espátula-temporal precisa e significativa. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para imagens ao vivo e coloração de imunofluorescência de montagem total de embriões de camundongos, que podem ser usados para estudar tanto NMPs quanto células mesodérmicas durante a extensão e segmentação axiais. Além disso, descrevemos também um protocolo para tomografia de projeção óptica (OPT) de embriões e fetos mais antigos, que permite a visualização 3D em toto e quantificação de anormalidades patológicas que podem resultar de problemas durante a somitogênese (por exemplo, fusão óssea e escoliose)13,21,22. Por fim, ilustramos o poder das reconstruções de imagens 3D no estudo e ensino da segmentação de vertebrados e alongamento axial.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose low gelling temperature</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Used to mounting embryos (e.g. for OPT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira software</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Brachyury (Goat polyclonal)</td>
			<td>R and D Systems</td>
			<td>AF2085 RRID:AB_2200235</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92494 RRID:AB_10585428</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tbx6 (Goat polyclonal)</td>
			<td>R and D Systems</td>
			<td>AF4744 RRID:AB_2200834</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9393 RRID:AB_477163</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-goat 488 (Donkey polyclonal)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11055 RRID:AB_2534102</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal)</td>
			<td>ThermoFisher &#160; Scientific</td>
			<td>A10042 RRID:AB_2534017</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Alcohol (99+%)</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to clear embryos (component of BABB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Benzoate (99+%)</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to clear embryos (component of BABB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>P6154</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x20 mm #0</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>100um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x20 mm #1</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>170um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x60 mm #1.5</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>To use as &#8220;slides&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8217;,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D3571</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drishti software</td>
			<td>(open source)</td>
			<td>-</td>
			<td>Free software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ED2SS</td>
			<td>For demineralization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ software</td>
			<td>(open source)</td>
			<td>-</td>
			<td>Free software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>NZYtech</td>
			<td>MB01401</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens software</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone defined fetal bovine serum</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#HYCLSH30070.03</td>
			<td>For live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution 30 %</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>1085971000</td>
			<td>For clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane / Oxford instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacers</td>
			<td>SunJin Lab</td>
			<td>(varies)</td>
			<td>Use as spacers for preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#25030&#8211;024</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low glucose DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11054020</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7167</td>
			<td>To dissect embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC20847.307</td>
			<td>For dehydration and rehydration steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl salicylate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6752</td>
			<td>Used to clear embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Used in solution to fix embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P0781</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline solution)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0615-500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear</td>
			<td>SunJin Laboratory</td>
			<td>RapiClear 1.52</td>
			<td>Used to clear embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secure-Sea hybridization chambers</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5474</td>
			<td>Use as spacers for preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>simLab software</td>
			<td>SimLab soft</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide, depression concave glass - 75x25 mm</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>To mount thick embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three and four-dimensional visualization and analysis approaches to study vertebrate axial elongation and segmentation

A somitogênese é uma marca registrada do desenvolvimento embrionário vertebrado. Há anos, pesquisadores vêm estudando esse processo em uma variedade de organismos usando uma ampla gama de técnicas que englobam abordagens ex vivo e in vitro. No entanto, a maioria dos estudos ainda se baseia na análise de dados bidimensionais (2D) de imagem, que limita a avaliação adequada de um processo de desenvolvimento como extensão axial e somitogênese envolvendo interações altamente dinâmicas em um complexo espaço 3D. Aqui descrevemos técnicas que permitem a aquisição de imagens ao vivo do mouse, processamento de conjunto de dados, visualização e análise em 3D e 4D para estudar as células (por exemplo, progenitoras neuromesodérmicas) envolvidas nesses processos de desenvolvimento. Também fornecemos um protocolo passo-a-passo para tomografia de projeção óptica e microscopia de imunofluorescência de montagem total em embriões de camundongos (da preparação da amostra à aquisição de imagens) e mostramos um pipeline que desenvolvemos para processar e visualizar dados de imagem 3D. Estendemos o uso de algumas dessas técnicas e destacamos características específicas de diferentes softwares disponíveis (por exemplo, Fiji/ImageJ, Drishti, Amira e Imaris) que podem ser usados para melhorar nossa compreensão atual da extensão axial e da formação de somite (por exemplo, reconstruções 3D). Ao todo, as técnicas aqui descritas enfatizam a importância da visualização e análise de dados 3D na biologia do desenvolvimento, e podem ajudar outros pesquisadores a abordar melhor os dados de imagem 3D e 4D no contexto de extensão e segmentação axial vertebrados. Por fim, o trabalho também emprega novas ferramentas para facilitar o ensino do desenvolvimento embrionário dos vertebrados.

Os resultados representativos apresentados neste artigo tanto para a imagem de imunofluorescência ao vivo quanto para a imunofluorescência, foram obtidos utilizando-se um sistema de dois fótons, com um objetivo de água de 20 × 1.0 NA, o laser de excitação sintonizado em 960 nm, e os fotodetetores GaAsP (conforme descrito em Dias et al. (2020)43. A tomografia de projeção óptica foi feita utilizando um scanner OPenT construído sob medida (como descrito em Gualda et al. (2013)<sup class="x...

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Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation

Aqui, descrevemos ferramentas e métodos computacionais que permitem a visualização e análise de dados de imagem tridimensionais e quadridimensionais de embriões de camundongos no contexto de alongamento axial e segmentação, obtidos pela tomografia de projeção óptica toto, e por imagens vivas e coloração de imunofluorescência de montagem total usando microscopia multifoton.

Abordagens de visualização e análise tridimensional para estudar alongamento axial de vertebrados e segmentação

Somitogenesis is a hallmark of vertebrate embryonic development. For years, researchers have been studying this process in a variety of organisms using a ...

Os estágios de organogênese nos embriões do camundongo permanecem parcialmente mal estudados devido à difícil visualização das estruturas complexas do embrião. Este protocolo descreve técnicas que permitem visualização e análise 3D e 4D de embriões de camundongos durante a extensão e segmentação axiais. A principal vantagem dessa técnica é que permite aos pesquisadores estudar e mostrar as estruturas complexas do embrião do camundongo como objetos dinâmicos 3D.Este protocolo contém técnicas que podem ser utilizadas no estudo de malformações congênitas que afetam a vértebra e a medula espinhal dos mamíferos, como a escoliose. Essas técnicas também podem ser utilizadas com sistemas de modelos in vitro, permitindo assim o estudo do desenvolvimento embrionário humano. Para preparar embriões de camundongos entre o dia embrionário 8.25 e o dia embrionário 10.5 para imagens vivas, disseque os embriões em meio M2 pré-aquecido a 37 graus Celsius.Remova suavemente o saco de gema usando fórceps limpos e lave o embrião uma vez com meio M2 fresco para remover sangue e detritos produzidos durante a dissecção. Durante o procedimento de imagem ao vivo, incubar embriões em mamomicas de baixa glicose suplementadas com FBS 10% de hipclone definida, dois milimolar L-glutamina e estreptomicina de 1%penicilina em uma câmara aquecida de 37 graus Celsius e um oxigênio de 65% com 5% de gás. Para preparar embriões de camundongos de estágio semelhante para microscopia de imunofluorescência, em vez de usar M2 aquecido, disseque os embriões em PBS frio e fixe em 4%de paraformaldeído.Depois de executar todo o protocolo de coloração de imunofluorescência do montagem, conforme descrito no manuscrito do texto, a liberação de tecido pode ser alcançada usando o RapiClear. Primeiro, coloque os embriões no centro de um slide de vidro côncavo de depressão de 75 por 25 milímetros, remova todo o PBST no slide de depressão do microscópio e adicione 200 microlitros de solução de compensação, em seguida, cubra a preparação do slide com uma caixa. Após 10 minutos protegidos da luz, quando os embriões começarem a se tornar transparentes, substitua a solução de compensação e espere mais 20 minutos.Cubra o embrião com uma mancha de cobertura começando de um lado e movendo-se suavemente em direção ao outro. A amostra está pronta para a imagem. Para limpar o uso de saliciilato de metila ou BABB, certifique-se de que os embriões estejam completamente desidratados em 100% de metanol e, em seguida, inicie a série de BABB e metanol com aumentos sucessivos de 20% na concentração e uma incubação de 20 minutos para cada etapa.Quando a solução BABB atingir 100% faça duas mudanças adicionais para uma nova solução. Prepare uma lâmina de vidro de cobertura de 20 por 60 milímetros 1,5 para montar os embriões para evitar comprimir a amostra. Adicione espaçadores feitos de lavadoras de metal fina.Transfira os embriões limpos para os slides do microscópio usando um palito, uma ponta de algodão fino ou uma pipeta Pasteur. Em seguida, adicione uma gota de meio de montagem, cubra com outro vidro de cobertura semelhante e vedação com parafina derretida para estabilizar melhor a preparação para evitar bolhas. Coloque a mancha de cobertura de um lado e, em seguida, deslize-a gradualmente e suavemente para os lados, adicionando mais meio, se necessário.A amostra está pronta para ser imagem no microscópio. Use Fiji/ImageJ para reposicionar o embrião em uma posição padronizada do eixo anterior-posterior e dorsal-ventral após a imagem. Reduza o tamanho do conjunto de dados na imagem de Fiji e, em seguida, dimensione e insira os valores da escala X, Y e Z necessários para reduzir o conjunto de dados para menos de 200 megabytes.Certifique-se de que a nova opção de janela de criação esteja marcada. Em seguida, vá para plugins e abra o Visualizador 3D. Dentro da janela 3D Viewer, clique sobre o embrião para selecioná-lo, fazendo com que uma caixa 3D vermelha apareça.Ao usar este modo, controle a rotação do conjunto de dados com um mouse. Depois de garantir a posição perfeita do embrião, selecione editar, transformar a imagem e exportar imagem transformada na janela 3D Viewer. Inspecione os diferentes planos ortogonais e vá para a imagem, empilhe e selecione vistas ortogonais.Quando o embrião estiver corretamente posicionado, selecione o menu de janela 3D Viewer e, em seguida, edite, transforme e salve a matriz de transformação em um arquivo de texto com uma extensão de tapete. Abra o arquivo de texto usando Fiji/ImageJ, remova as duas primeiras linhas e re-salve. Isso cria um arquivo de matriz de transformação compatível com o plugin TransformJ.Mude para o conjunto de dados de resolução completa e execute os plugins de operação TransformJ e TransformJ affine. Na nova janela, navegue para procurar o arquivo de matriz previamente salvo, selecione a interpolação cúbica de spline B e resample isotropicamente e clique em OK. Depois de reposicionar adequadamente o embrião, corte a maior parte do espaço vazio criado. Para executar uma imagem completa de projeção Z, clique em stacks, Projeto Z e escolha a intensidade máxima.Em seguida, desenhe o ROI mínimo que contém todo o embrião em X e Y.Switch para as janelas de imagem original do conjunto de dados clicando em editar, selecionar, restaurar a seleção e cortar selecionando imagem. Corte as fatias no início e no final que não cruzem tecidos de embrião selecionando pilhas de imagem e abertura, clique em ferramentas, selecione o removedor de fatias e especifique a primeira e última fatia a ser removida, certificando-se de alterar o incremento para uma. Se desejar, realize uma análise mais aprofundada e reconstruções 3D usando as instruções no manuscrito do texto.Para realizar a análise 3D de embriões mais desenvolvidos, dissecar fetos embrionários no pbs frio, remover todas as membranas embrionárias extras e depois lavar os fetos várias vezes em PBS fresco para remover sangue e detritos produzidos durante o procedimento de dissecção. Fixar fetos em 4%PFA feito em PBS a quatro graus Celsius por cinco a sete dias. Depois de lavar o embrião várias vezes na PBS, desidrate os fetos incubando em 10%10 aumentos sucessivos de soluções de metanol até que 100% de metanol seja alcançado.Realize cada incubação por 25 minutos em um shaker à temperatura ambiente. Em seguida, incubar fetos separadamente em um shaker primeiro por um dia em peróxido de hidrogênio de 5% em metanol e, em seguida, em peróxido de hidrogênio de 10% em metanol por até três dias até que os embriões percam toda a pigmentação natural. Reidratar gradualmente os embriões em uma série de metanol reverso em água desmineralizada a cada incubação por 20 minutos em um agitador à temperatura ambiente, em seguida, lave os embriões três vezes por 30 minutos por lavagem em água desmineralizada.Para incorporar fetos em blocos de 1%agarose, encha um tubo plástico de 50 mililitros ou seringa com agarose derretida, em seguida, coloque o feto na ágarose em uma posição vertical e mantenha esta posição com fórceps durante a solidificação da agarose. Coloque o molde com o bloco a quatro graus Celsius por 30 minutos para que a agarose para gelatina completa, em seguida, remova o bloco de agarose com o feto do molde e coloque-o em um recipiente com água desmoralizada. Realize a desidratação do feto gradualmente com aumentos de 10% na concentração de metanol diluída em água desmineralizada ou PBS, mantendo a amostra na concentração de metanol por pelo menos 45 minutos em temperatura ambiente em um shaker até que 100% de metanol seja atingido.Limpe os fetos movendo-os através de uma solução babb série e metanol por 2,5 horas em cada concentração com aumentos de 25% na concentração de BABB até atingir 100% BABB. Substitua a solução BABB por uma nova todos os dias até que o feto esteja completamente transparente. Esse processo pode levar de três a cinco dias.Use cola para anexar o bloco de agarose desmatada ao eixo motor do scanner OPT, em seguida, ajuste a óptica para obter uma imagem de todo o feto e prossiga para adquirir um conjunto de dados de projeção completa. A técnica de imagem ao vivo 4D permite a análise dinâmica da expressão do repórter LuVeLu e embriões embriões de nocaute embrionários 8,5 Snai1-conditional. Juntamente com o sinal normal de LuVeLu no mesoderme presomótico, embriões de nocaute condicionais Snai1 exibem expressão LuVeLu na protuberância ectópica que surge da raia primitiva.Ensaios de imunofluorescência de montagem inteira permitem a detecção de potenciais NMPs e reguladores-chave da diferenciação do mesoderm. Setas brancas e amarelas destacam diferenças nos embriões mutantes e selvagens. A renderização 3D de imunostainings de montagem inteira permitem uma melhor compreensão do tecido ou estrutura no estudo.Neste caso, foi investigada a localização de potenciais NMPs no broto da cauda. Reconstruções de tecidos 3D também são importantes para entender e caracterizar defeitos morfológicos em embriões de camundongos. A visualização interativa da reconstrução 3D também pode ser construída em formatos fáceis de usar.Por exemplo, em um arquivo PDF. Essas estruturas caudais de embrião 3D podem ser usadas para ilustrar o poder dos modelos 3D para um público mais geral e para ajudar no estudo no ensino de um alongamento axial de vertebrados e segmentação. Finalmente, a visualização 3D em toto de embriões de camundongos mais desenvolvidos é possível usando a técnica de microscopia OTP.Renderizações animadas são mostradas aqui, destacando as principais fatias dos fetos embrionários do dia 18,5. O mais importante a se lembrar é que o resultado deve permanecer uma representação fiel do que é observado no embrião. Os pesquisadores podem usar esses métodos para ir além de apresentar apenas estática às imagens, mas também incluir vídeos, reconstruções tridimensionais e até modelos 3D interativos de seus dados.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Diferenciação de uma linha de células-tronco neurais em Três Culturas dimensionais, os genes Análise de microRNA e putativo alvo

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Biologia do Desenvolvimento

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Cultura Vivo de Pharyngeal Arcos para estudo do coração e do músculo Progenitores e seu nicho

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

Visualização de condrócitos Intercalation e Direcional Proliferação via Zebrabow Análise celular clonal na cartilagem de Meckel o Embryonic

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Kinetic Medição e visualização em tempo real de Reprogramação Somatic

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Análise do induzida por ácido retinóico Neural diferenciação de células estaminais embrionárias rato em corpos embrióides Dois e tridimensionais

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualização e Análise Quantitativa da Angiogênese Embrionária<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Usando In Vivo e tecido e célula explante abordagens para estudar a morfogênese e a patogênese da Aorta embrionária e Perinatal

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Correlativa Super-resolução e microscopia eletrônica para resolver a localização da proteína na Retina de Zebrafish

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Renderização tridimensional e análise de Immunolabeled, esclareceu humana da placenta vilosa redes vasculares

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Análise computacional do Germline Caenorhabditis elegans , para estudar a distribuição de núcleos, as proteínas e o citoesqueleto

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...