Name: three and four-dimensional visualization and analysis approaches to study vertebrate axial elongation and segmentation
Uploaded: 2021-02-28T14:00:00
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Nos gustaría agradecer a Olivier Pourquié y Alexander Aulehla por la cepa reportera LuVeLu, al laboratorio SunJin para la muestra de prueba RapiClear, a Hugo Pereira por la ayuda utilizando BigStitcher, a Nuno Granjeiro por ayudar a configurar el aparato de imágenes en vivo, a la instalación de animales IGC y a los miembros pasados y presentes del laboratorio Mallo por sus útiles comentarios y apoyo durante el curso de este trabajo.
Agradecemos el apoyo técnico del Advanced Imaging Facility del CIG, que cuenta con el apoyo de la financiación portuguesa ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 y ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017, cofinanciada por el Programa Operativo Regional de Lisboa (Lisboa 2020), en el marco del Acuerdo de Asociación Portugal 2020, a través del Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) y la Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugal). El trabajo descrito en este manuscrito fue apoyado por las subvenciones LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, Portugal) y SCML-MC-60-2014 (Santa Casa da Misericórdia, Portugal) a M.M., la infraestructura de investigación Congento, proyecto LISBOA-01-0145-FEDER-022170, y la beca de doctorado PD/BD/128426/2017 a A.D.

Los experimentos con animales siguieron las legislaciones portuguesa (Portaria 1005/92) y europea (Directiva 2010/63 / UE) sobre vivienda, cría y bienestar. El proyecto fue revisado y aprobado por el Comité de Ética del Instituto Gulbenkian de Ciência y por la Entidad Nacional Portuguesa, "Direcção Geral de Alimentação e Veterinária" (referencia de la licencia: 014308).
1. Preparación de muestras para imágenes 3D y 4D
NOTA: Aquí proporcionamos una descripc...

La elongación axial y la segmentación son dos de los procesos más complejos y dinámicos que ocurren durante el desarrollo embrionario de los vertebrados. El uso de imágenes 3D y 4D con seguimiento unicelular se ha aplicado, desde hace algún tiempo, para estudiar estos procesos tanto en embriones de pez cebra como de pollo, para lo cual la accesibilidad y las condiciones de cultivo facilitan la obtención de imágenes complejas 19,44,45,46,47,48,49 </su...

La formación del eje del cuerpo de los vertebrados es un proceso altamente complejo y dinámico que ocurre durante el desarrollo embrionario. Al final de la gastrulación [en el ratón, alrededor del día embrionario (E) 8.0], un grupo de células progenitoras de epiblastos conocidas como progenitores neuromesodérmicos (NMP) se convierten en un impulsor clave de la extensión axial en una secuencia de cabeza a cola, generando el tubo neural y los tejidos mesodérmicos paraxiales durante la formación del cuello, el tronco y la cola 1,2,3,4 . Curiosamente, la posición que ocupan estas NMPs en el epiblasto caudal parece jugar un papel clave en la decisión de diferenciarse en mesodermo o neuroectodermo5. Aunque actualmente carecemos de una huella molecular precisa para las NMP, generalmente se cree que estas células coexpresan T (Brachyury) y Sox2 5,6. Los mecanismos exactos que regulan las decisiones de destino de NMP (es decir, si toman rutas neuronales o mesodérmicas) solo están comenzando a definirse con precisión. La expresión de Tbx6 en la región de la raya primitiva es un marcador temprano de la decisión del destino de NMP, ya que este gen está involucrado en la inducción y especificación del mesodermo 6,7. Curiosamente, las células del mesodermo temprano parecen expresar altos niveles de Epha18, y la señalización Wnt /β-catenina, así como Msgn1 también se demostró que juegan un papel importante en la diferenciación del mesodermo paraxial y la formación de somita 9,10. Un análisis espacio-temporal completo de las NMP a nivel de una sola célula será sin duda fundamental para comprender completamente los mecanismos moleculares que controlan la especificación del mesodermo.
La formación de somitas (precursores de vértebras) es una característica clave de los vertebrados. Durante el alargamiento axial, el mesodermo paraxial se segmenta en una serie de unidades de repetición bilaterales conocidas como somitas. El número de somitas y el tiempo requerido para la formación de nuevos segmentos varía entre las especies11,12. La somitogénesis implica oscilaciones de señalización periódicas (conocidas como el "reloj de segmentación") que pueden observarse mediante la expresión cíclica de varios genes de las vías de señalización Notch, Wnt y Fgf en el mesodermo presómtico (por ejemplo, Lfng)11,12. El modelo actual de somitogénesis también postula la existencia de un "frente de onda de maduración", una serie de gradientes de señalización complejos que involucran señalización Fgf, Wnt y ácido retinoico que definen la posición del borde posterior de cada nuevo somita. Por lo tanto, una interacción coordinada entre el "reloj de segmentación" y el "frente de onda de maduración" es fundamental para la generación de estos módulos precursores de vértebras, ya que las perturbaciones en estos procesos morfogenéticos clave pueden resultar en letalidad embrionaria o en la formación de malformaciones congénitas (por ejemplo, escoliosis)13,14,15.
A pesar de los avances recientes sustanciales en técnicas de imagen, métodos de análisis de bioimagen y software, la mayoría de los estudios de alargamiento axial y somitogénesis todavía se basan en datos de imágenes bidimensionales individuales / aisladas (por ejemplo, secciones), lo que no permite una visualización completa del tejido multidimensional y complica la clara diferenciación entre malformaciones patológicas (es decir, debido a mutaciones) vs variación morfológica normal que ocurre durante el desarrollo embrionario16 . La imagen en 3D ya ha descubierto nuevos movimientos morfogenéticos, previamente no identificados por los métodos 2D estándar 17,18,19,20, destacando el poder de las imágenes in toto para comprender los mecanismos de la somitogénesis de vertebrados y la extensión axial.
La microscopía 3D y 4D de embriones de ratón, particularmente las imágenes en vivo, son técnicamente desafiantes y requieren pasos críticos durante la preparación de la muestra, la adquisición de imágenes y el preprocesamiento de datos para permitir un análisis espacio-temporal preciso y significativo. Aquí, describimos un protocolo detallado para imágenes en vivo y tinción de inmunofluorescencia de montaje completo de embriones de ratón, que se puede utilizar para estudiar tanto las NMP como las células mesodérmicas durante la extensión y segmentación axial. Además, también describimos un protocolo para la tomografía de proyección óptica (OPT) de embriones y fetos más viejos, que permite la visualización y cuantificación 3D de anomalías patológicas que pueden resultar de problemas durante la somitogénesis (por ejemplo, fusión ósea y escoliosis)13,21,22. Finalmente, ilustramos el poder de las reconstrucciones por imágenes 3D en el estudio y la enseñanza de la segmentación de vertebrados y el alargamiento axial.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose low gelling temperature</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Used to mounting embryos (e.g. for OPT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira software</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Brachyury (Goat polyclonal)</td>
			<td>R and D Systems</td>
			<td>AF2085 RRID:AB_2200235</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92494 RRID:AB_10585428</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tbx6 (Goat polyclonal)</td>
			<td>R and D Systems</td>
			<td>AF4744 RRID:AB_2200834</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9393 RRID:AB_477163</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-goat 488 (Donkey polyclonal)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11055 RRID:AB_2534102</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal)</td>
			<td>ThermoFisher &#160; Scientific</td>
			<td>A10042 RRID:AB_2534017</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Alcohol (99+%)</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to clear embryos (component of BABB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Benzoate (99+%)</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to clear embryos (component of BABB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>P6154</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x20 mm #0</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>100um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x20 mm #1</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>170um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x60 mm #1.5</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>To use as &#8220;slides&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8217;,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D3571</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drishti software</td>
			<td>(open source)</td>
			<td>-</td>
			<td>Free software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ED2SS</td>
			<td>For demineralization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ software</td>
			<td>(open source)</td>
			<td>-</td>
			<td>Free software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>NZYtech</td>
			<td>MB01401</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens software</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone defined fetal bovine serum</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#HYCLSH30070.03</td>
			<td>For live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution 30 %</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>1085971000</td>
			<td>For clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane / Oxford instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacers</td>
			<td>SunJin Lab</td>
			<td>(varies)</td>
			<td>Use as spacers for preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#25030&#8211;024</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low glucose DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11054020</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7167</td>
			<td>To dissect embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC20847.307</td>
			<td>For dehydration and rehydration steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl salicylate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6752</td>
			<td>Used to clear embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Used in solution to fix embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P0781</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline solution)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0615-500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear</td>
			<td>SunJin Laboratory</td>
			<td>RapiClear 1.52</td>
			<td>Used to clear embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secure-Sea hybridization chambers</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5474</td>
			<td>Use as spacers for preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>simLab software</td>
			<td>SimLab soft</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide, depression concave glass - 75x25 mm</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>To mount thick embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three and four-dimensional visualization and analysis approaches to study vertebrate axial elongation and segmentation

La somitogénesis es un sello distintivo del desarrollo embrionario de vertebrados. Durante años, los investigadores han estado estudiando este proceso en una variedad de organismos utilizando una amplia gama de técnicas que abarcan enfoques ex vivo e in vitro. Sin embargo, la mayoría de los estudios aún se basan en el análisis de datos de imágenes bidimensionales (2D), lo que limita la evaluación adecuada de un proceso de desarrollo como la extensión axial y la somitogénesis que involucra interacciones altamente dinámicas en un espacio 3D complejo. Aquí describimos técnicas que permiten la adquisición de imágenes en vivo con ratones, el procesamiento de conjuntos de datos, la visualización y el análisis en 3D y 4D para estudiar las células (por ejemplo, progenitores neuromesodérmicos) involucradas en estos procesos de desarrollo. También proporcionamos un protocolo paso a paso para la tomografía de proyección óptica y la microscopía de inmunofluorescencia de montaje completo en embriones de ratón (desde la preparación de la muestra hasta la adquisición de imágenes) y mostramos una tubería que desarrollamos para procesar y visualizar datos de imágenes 3D. Ampliamos el uso de algunas de estas técnicas y destacamos las características específicas de diferentes software disponibles (por ejemplo, Fiji / ImageJ, Drishti, Amira e Imaris) que se pueden utilizar para mejorar nuestra comprensión actual de la extensión axial y la formación de somita (por ejemplo, reconstrucciones 3D). En conjunto, las técnicas aquí descritas enfatizan la importancia de la visualización y el análisis de datos 3D en la biología del desarrollo, y podrían ayudar a otros investigadores a abordar mejor los datos de imágenes 3D y 4D en el contexto de la extensión y segmentación axial de vertebrados. Finalmente, el trabajo también emplea herramientas novedosas para facilitar la enseñanza del desarrollo embrionario de vertebrados.

Los resultados representativos mostrados en este trabajo tanto para la imagen viva como para la inmunofluorescencia, se obtuvieron utilizando un sistema de dos fotones, con un objetivo de agua de 20 × 1.0 NA, el láser de excitación sintonizado a 960 nm y fotodetectores GaAsP (como se describe en Dias et al. (2020)43. La tomografía de proyección óptica se realizó utilizando un escáner OPenT personalizado (como se describe en Gualda et al. (2013)28.
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Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation

Aquí, describimos herramientas y métodos computacionales que permiten la visualización y el análisis de datos de imágenes tridimensionales y cuatridimensionales de embriones de ratón en el contexto de la elongación y segmentación axial, obtenidos por tomografía de proyección óptica in toto, y por imágenes en vivo y tinción de inmunofluorescencia de montaje completo mediante microscopía multifotónica.

Enfoques de visualización y análisis tridimensionales y de cuatro dimensiones para estudiar la elongación y segmentación axial de vertebrados

Somitogenesis is a hallmark of vertebrate embryonic development. For years, researchers have been studying this process in a variety of organisms using a ...

Las etapas de organogénesis en los embriones de ratón permanecen poco estudiadas en parte debido a la difícil visualización de las estructuras complejas del embrión. Este protocolo describe técnicas que permiten la visualización y análisis 3D y 4D de embriones de ratón durante la extensión y segmentación axial. La principal ventaja de esta técnica es que permite a los investigadores estudiar y mostrar las complejas estructuras del embrión de ratón como objetos dinámicos en 3D.Este protocolo contiene técnicas que pueden ser utilizadas en el estudio de malformaciones congénitas que afectan a la vértebra y la médula espinal de los mamíferos, como la escoliosis. Estas técnicas también se pueden utilizar con sistemas modelo in vitro, lo que permite el estudio del desarrollo embrionario humano. Para preparar embriones de ratón entre el día embrionario 8.25 y el día embrionario 10.5 para imágenes en vivo, diseccionar los embriones en medio M2 precalentado a 37 grados centígrados.Retire suavemente el saco vitelino con fórceps limpios y lave el embrión una vez con medio M2 fresco para eliminar la sangre y los desechos producidos durante la disección. Durante el procedimiento de imágenes en vivo, incube embriones en medio DMEM de baja glucosa suplementado con FBS definido por HyClone al 10%, L-glutamina milimolar y estreptomicina de penicilina al 1% en una cámara calentada de 37 grados Celsius y un ambiente de oxígeno al 65% con 5% de dióxido de carbono. Para preparar embriones de ratón en etapa similar para microscopía de inmunofluorescencia, en lugar de usar M2 calentado, diseccione los embriones en PBS frío y fije en paraformaldehído al 4%.Después de realizar todo el protocolo de tinción de inmunofluorescencia de montaje como se describe en el manuscrito de texto, se puede lograr la eliminación de tejidos utilizando RapiClear. Primero, coloque los embriones en el centro de un portaobjetos de vidrio cóncavo de depresión de 75 por 25 milímetros, retire todo el PBST en el portaobjetos de depresión del microscopio y agregue 200 microlitros de solución de limpieza, luego cubra la preparación del portaobjetos con una caja. Después de 10 minutos protegidos de la luz, cuando los embriones comiencen a ser transparentes, reemplace la solución de limpieza y espere 20 minutos adicionales.Cubra el embrión con un cubrebocas que comienza desde un lado y se mueve suavemente hacia el otro. La muestra ya está lista para la obtención de imágenes. Para la limpieza con salicilato de metilo o BABB, asegúrese de que los embriones estén completamente deshidratados en 100% de metanol y luego comience la serie de BABB y metanol con aumentos sucesivos de concentración del 20% y una incubación de 20 minutos para cada paso.Cuando la solución BABB alcance el 100%, realice dos cambios adicionales para una solución nueva. Preparar un portaobjetos de vidrio de 20 por 60 milímetros y 1,5 para montar los embriones y evitar comprimir la muestra. Agregue espaciadores hechos de arandelas delgadas de metal.Transfiera los embriones aclarados a los portaobjetos del microscopio con un palillo de dientes, una punta de algodón fina o una pipeta Pasteur. Luego agregue una gota de medio de montaje, cubra con otra cubierta de vidrio similar y selle con parafina derretida para estabilizar mejor la preparación para evitar burbujas. Coloque el cubrecolchas en un lado y luego deslícelo gradual y suavemente hacia los lados, agregando más medio si es necesario.La muestra ya está lista para ser fotografiada en el microscopio. Utilice Fiji/ImageJ para reposicionar el embrión en una posición estandarizada del eje anterior-posterior y dorsal-ventral después de la toma de imágenes. Reduzca el tamaño del conjunto de datos en la imagen de Fiji, luego escale e inserte los valores de escala X, Y y Z necesarios para reducir el conjunto de datos a menos de 200 megabytes.Asegúrese de que la opción crear nueva ventana esté marcada. Luego vaya a los complementos y abra 3D Viewer. Dentro de la ventana del Visor 3D, haga clic sobre el embrión para seleccionarlo, haciendo que aparezca un cuadro 3D rojo.Cuando utilice este modo, controle la rotación del conjunto de datos con un mouse. Después de asegurar la posición perfecta del embrión, seleccione editar, transformar la imagen y exportar la imagen transformada en la ventana del Visor 3D. Inspeccione los diferentes planos ortogonales, luego vaya a la imagen, luego apile y seleccione vistas ortogonales.Cuando el embrión esté posicionado correctamente, seleccione el menú de la ventana Visor 3D y, a continuación, edite, transforme y guarde la matriz de transformación en un archivo de texto con una extensión mat. Abra el archivo de texto usando Fiji/ImageJ, elimine las dos primeras líneas y vuelva a guardar. Esto crea un archivo de matriz de transformación compatible con el complemento TransformJ.Cambie al conjunto de datos de resolución completa y realice la operación de los complementos TransformJ y TransformJ afines. En la nueva ventana, busque el archivo de matriz guardado anteriormente, seleccione la interpolación cúbica B-spline y vuelva a muestrear isotropicalmente, luego haga clic en Aceptar. Después de reposicionar correctamente el embrión, recorte la mayor parte del espacio vacío creado. Para realizar una imagen de proyección Z completa, haga clic en pilas, Proyecto Z y elija la intensidad máxima.A continuación, dibuje el ROI mínimo que contiene todo el embrión en X e Y.Cambie a las ventanas de imagen del conjunto de datos original haciendo clic en editar, seleccionar, restaurar selección y recortar seleccionando imagen. Recorte las rebanadas al principio y al final que no intersectan los tejidos embrionarios seleccionando las pilas de imagen y apertura, haga clic en las herramientas, seleccione el removedor de rebanadas y especifique la primera y la última rebanada que desea eliminar, asegurándose de cambiar el incremento a una. Si lo desea, realice más análisis y reconstrucciones en 3D utilizando las instrucciones del manuscrito de texto.Para realizar análisis 3D de embriones más desarrollados, diseccionar fetos embrionarios del día 18.5 en PBS frío, eliminar todas las membranas embrionarias adicionales, luego lavar los fetos varias veces en PBS fresco para eliminar la sangre y los desechos producidos durante el procedimiento de disección. Fije los fetos en 4% PFA hechos en PBS a cuatro grados Celsius durante cinco a siete días. Después de lavar el embrión varias veces en PBS, deshidrate a los fetos incubando en aumentos sucesivos del 10%10 de soluciones de metanol hasta alcanzar el 100% de metanol.Realice cada incubación durante 25 minutos en un agitador a temperatura ambiente. A continuación, incube los fetos por separado en un agitador primero durante un día en peróxido de hidrógeno al 5% en metanol y luego en peróxido de hidrógeno al 10% en metanol durante un máximo de tres días hasta que los embriones pierdan toda la pigmentación natural. Rehidrate gradualmente los embriones en una serie inversa de metanol en agua desmineralizada con cada incubación durante 20 minutos en un agitador a temperatura ambiente, luego lave los embriones tres veces durante 30 minutos por lavado en agua desmineralizada.Para incrustar fetos en bloques de agarosa al 1%, llene un tubo o jeringa de plástico de 50 mililitros con agarosa derretida, luego coloque al feto en la agarosa en una posición vertical y mantenga esta posición con fórceps durante la solidificación de la agarosa. Coloque el molde con el bloque a cuatro grados centígrados durante 30 minutos para que la agarosa se gelatilice completamente, luego retire el bloque de agarosa con el feto del molde y colóquelo en un recipiente con agua desmoralizada. Realice la deshidratación del feto gradualmente con aumentos del 10% en la concentración de metanol diluido en agua desmineralizada o PBS, manteniendo la muestra en concentración de metanol durante al menos 45 minutos a temperatura ambiente en un agitador hasta que se alcance el 100% de metanol.Limpie los fetos moviéndolos a través de una solución de BABB en serie y metanol durante 2,5 horas en cada concentración con aumentos del 25% en la concentración de BABB hasta alcanzar el 100% de BABB. Reemplace la solución de BABB por una fresca todos los días hasta que el feto sea completamente transparente. Este proceso puede tardar de tres a cinco días.Use pegamento para unir el bloque de agarosa despejado al eje motor del escáner OPT, luego ajuste la óptica para obtener una imagen de todo el feto y proceda a adquirir un conjunto de datos de proyección completo. La técnica de imagen en vivo 4D permite el análisis dinámico de la expresión del reportero LuVeLu y los embriones knockout condicionales de día 8.5 Snai1. Junto con la señal normal de LuVeLu en el mesodermo presómtico, los embriones knockout condicionales Snai1 muestran la expresión de LuVeLu en la protuberancia ectópica que surge de la raya primitiva.Los ensayos de inmunofluorescencia de montaje completo permiten la detección de posibles NMP y reguladores clave de la diferenciación del mesodermo. Las flechas blancas y amarillas resaltan las diferencias en los embriones mutantes y de tipo salvaje. La renderización 3D de inmunotinciones de montaje completo permite una mejor comprensión del tejido o la estructura en el estudio.En este caso, se investigó la ubicación de posibles NMP en el brote de la cola. Las reconstrucciones de tejidos en 3D también son importantes para comprender y caracterizar los defectos morfológicos en embriones de ratón. La visualización interactiva de la reconstrucción 3D también se puede construir en formatos fáciles de usar.Por ejemplo, en un archivo PDF. Estas estructuras caudales embrionarias 3D se pueden utilizar para ilustrar el poder de los modelos 3D a un público más general y para ayudar en el estudio en la enseñanza de la elongación y segmentación axial de un vertebrado. Finalmente, la visualización 3D en toto de embriones de ratón más desarrollados es posible utilizando la técnica de microscopía OTP.Las representaciones animadas se muestran aquí, destacando rebanadas clave de fetos embrionarios del día 18.5. Lo más importante a recordar es que el resultado debe seguir siendo una representación fiel de lo que se observa en el embrión. Los investigadores pueden usar estos métodos para ir más allá de presentar solo estática a las imágenes, sino también incluir videos, reconstrucciones tridimensionales e incluso modelos 3D interactivos de sus datos.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

La diferenciación de una línea de células madre neurales humanas en las Tres Culturas de dimensiones, Genes Análisis de microARN y putativo objetivo

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Cultura de faríngea Arcos para el Estudio de corazón y músculo Progenitores y su nicho

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

Visualización de condrocitos Intercalación y direccional proliferación a través de análisis celular clonal Zebrabow en el cartílago de la embrionaria Meckel

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Cinética Medición y visualización en tiempo real de la reprogramación somática

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Análisis de inducida por ácido retinoico Neural diferenciación de células madre embrionarias de ratón en cuerpos embrioides dos y tres dimensiones

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualización y análisis cuantitativo de la angiogénesis embrionaria<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Utilizan en Vivo y tejido y célula explante enfoques para el estudio de la morfogénesis y la patogenesia de la Aorta embrionaria y Perinatal

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Resolución súper correlativo y la microscopia electrónica para resolver la localización de la proteína en la Retina del pez cebra

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Representación tridimensional y análisis de Immunolabeled, aclaró redes vasculares vellosas placentarias humanas

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

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Análisis computacional de lo elegans de Caenorhabditis del Germline para estudiar la distribución de núcleos, proteínas y citoesqueleto

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...