Name: three and four-dimensional visualization and analysis approaches to study vertebrate axial elongation and segmentation
Uploaded: 2021-02-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation at JoVE.com

Vi vill tacka Olivier Pourquié och Alexander Aulehla för LuVeLu-reporterstammen, SunJin-laboratoriet för RapiClear-testprovet, Hugo Pereira för hjälpen med att använda BigStitcher, Nuno Granjeiro för att ha hjälpt till att sätta upp levande bildapparat, IGC-djuranläggningen och tidigare och nuvarande medlemmar i Mallo-laboratoriet för användbara kommentarer och stöd under detta arbete.
Vi tackar det tekniska stödet från regeringskonferensens Advanced Imaging Facility, som stöds av portugisisk finansiering ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 och ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017, medfinansierad av Lisboa Regional Operational Programme (Lisboa 2020), inom ramen för Portugals partnerskapsavtal 2020, genom Europeiska regionala utvecklingsfonden (Feder) och Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portugal). Arbetet som beskrivs i detta manuskript stöddes av bidrag LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, Portugal) och SCML-MC-60-2014 (Santa Casa da Misericórdia, Portugal) till M.M., forskningsinfrastrukturen Congento, projekt LISBOA-01-0145-FEDER-022170 och doktorandstipendiet PD/BD/128426/2017 till A.D.

Djurförsök följde den portugisiska (Portaria 1005/92) och europeiska (direktiv 2010/63/EU) lagstiftningen om boende, djurhållning och välbefinnande. Projektet granskades och godkändes av etikkommittén vid Instituto Gulbenkian de Ciência och av den portugisiska nationella enheten Direcção Geral de Alimentação e Veterinária (licensreferens: 014308).
1. Provberedning för 3D- och 4D-avbildning
OBS: Här ger vi en detaljerad beskrivning av hur man dissekerar ...

Axiell förlängning och segmentering är två av de mest komplexa och dynamiska processerna som förekommer under embryonal utveckling av ryggradsdjur. Användningen av 3D- och 4D-avbildning med encellsspårning har under en tid tillämpats för att studera dessa processer i både zebrafisk- och kycklingembryon, för vilka tillgänglighet och odlingsförhållanden underlättar komplex avbildning 19,44,45,46,47,48,49<...

Ryggradsdjurens kroppsaxelbildning är en mycket komplex och dynamisk process som sker under embryonal utveckling. I slutet av gastrulationen [i musen, runt embryonal dag (E) 8.0] blir en grupp epiblaststamceller som kallas neuromesodermala förfäder (NMP) en viktig drivkraft för axiell förlängning i en huvud-till-svans-sekvens, vilket genererar neuralröret och paraxial mesodermala vävnader under nacke, bål och svansbildning 1,2,3,4 . Intressant nog verkar den position som dessa NMP upptar i den kaudala epiblasten spela en nyckelroll i beslutet att differentiera till mesoderm eller neuroektoderm5. Även om vi för närvarande saknar ett exakt molekylärt fingeravtryck för NMP, anses dessa celler i allmänhet samuttrycka T (Brachyury) och Sox2 5,6. De exakta mekanismerna som reglerar NMP-ödesbeslut (dvs. om de tar neurala eller mesodermala vägar) börjar bara definieras exakt. Tbx6-uttryck i den primitiva streckregionen är en tidig markör för NMP-ödesbeslut, eftersom denna gen är involverad i induktionen och specifikationen av mesoderm 6,7. Intressant nog verkar tidiga mesodermceller uttrycka höga nivåer av Epha18, och Wnt / β-kateninsignalering, liksom Msgn1 visade sig också spela viktiga roller i paraxial mesodermdifferentiering och somitbildning 9,10. En fullständig rumslig-temporal analys av NMP på encellsnivå kommer säkert att vara avgörande för att fullt ut förstå de molekylära mekanismerna som styr mesodermspecifikationen.
Bildandet av somiter (ryggkotor) är en viktig egenskap hos ryggradsdjur. Under axiell förlängning segmenteras den paraxiella mesodermen i en serie bilaterala upprepande enheter som kallas somiter. Antalet somiter och den tid som krävs för bildandet av nya segment varierar mellan arter11,12. Somitogenes involverar periodiska signaloscillationer (känd som "segmenteringsklockan") som kan observeras genom det cykliska uttrycket av flera gener i Notch-, Wnt- och Fgf-signalvägarna i den presomitiska mesodermen (t.ex. Lfng)11,12. Den nuvarande modellen för somitogenes postulerar också förekomsten av en "mognadsvågfront", en serie komplexa signalgradienter som involverar Fgf, Wnt och retinsyrasignalering som definierar positionen för den bakre gränsen för varje ny somit. En samordnad interaktion mellan "segmenteringsklockan" och "mognadsvågfronten" är därför grundläggande för genereringen av dessa vertebrae-prekursormoduler, eftersom störningar i dessa viktiga morfogenetiska processer kan leda till embryonal dödlighet eller till bildandet av medfödda missbildningar (t.ex. skolios)13,14,15.
Trots betydande framsteg på senare tid inom bildteknik, biobildanalysmetoder och programvara förlitar sig de flesta studier av axiell töjning och somitogenes fortfarande på enstaka / isolerade tvådimensionella bilddata (t.ex. sektioner), vilket inte tillåter en fullständig flerdimensionell vävnadsvisualisering och komplicerar tydlig differentiering mellan patologiska missbildningar (dvs. på grund av mutationer) jämfört med normal morfologisk variation som inträffar under embryonal utveckling16 . Avbildning i 3D har redan avslöjat nya morfogenetiska rörelser, som tidigare inte identifierats med standard 2D-metoder 17,18,19,20, vilket belyser kraften i in toto-avbildning för att förstå mekanismerna för ryggradsdjur somitogenes och axiell förlängning.
3D- och 4D-mikroskopi av musembryon, särskilt levande avbildning, är tekniskt utmanande och kräver kritiska steg under provberedning, bildinsamling och förbehandling av data för att möjliggöra korrekt och meningsfull spatio-temporal analys. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för levande avbildning och helmonterad immunofluorescensfärgning av musembryon, som kan användas för att studera både NMP och mesodermala celler under axiell förlängning och segmentering. Dessutom beskriver vi också ett protokoll för optisk projektionstomografi (OPT) av äldre embryon och foster, som möjliggör 3D i totovisualisering och kvantifiering av patologiska abnormiteter som kan uppstå från problem under somitogenes (t.ex. benfusion och skolios)13,21,22. Slutligen illustrerar vi kraften i 3D-bildrekonstruktioner i studien och undervisningen av ryggradsdjurs segmentering och axiell förlängning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose low gelling temperature</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Used to mounting embryos (e.g. for OPT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira software</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Brachyury (Goat polyclonal)</td>
			<td>R and D Systems</td>
			<td>AF2085 RRID:AB_2200235</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92494 RRID:AB_10585428</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tbx6 (Goat polyclonal)</td>
			<td>R and D Systems</td>
			<td>AF4744 RRID:AB_2200834</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9393 RRID:AB_477163</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-goat 488 (Donkey polyclonal)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11055 RRID:AB_2534102</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal)</td>
			<td>ThermoFisher &#160; Scientific</td>
			<td>A10042 RRID:AB_2534017</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Alcohol (99+%)</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to clear embryos (component of BABB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Benzoate (99+%)</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to clear embryos (component of BABB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>P6154</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x20 mm #0</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>100um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x20 mm #1</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>170um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x60 mm #1.5</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>To use as &#8220;slides&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8217;,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D3571</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drishti software</td>
			<td>(open source)</td>
			<td>-</td>
			<td>Free software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ED2SS</td>
			<td>For demineralization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ software</td>
			<td>(open source)</td>
			<td>-</td>
			<td>Free software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>NZYtech</td>
			<td>MB01401</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens software</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone defined fetal bovine serum</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#HYCLSH30070.03</td>
			<td>For live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution 30 %</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>1085971000</td>
			<td>For clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane / Oxford instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacers</td>
			<td>SunJin Lab</td>
			<td>(varies)</td>
			<td>Use as spacers for preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#25030&#8211;024</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low glucose DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11054020</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7167</td>
			<td>To dissect embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC20847.307</td>
			<td>For dehydration and rehydration steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl salicylate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6752</td>
			<td>Used to clear embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Used in solution to fix embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P0781</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline solution)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0615-500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear</td>
			<td>SunJin Laboratory</td>
			<td>RapiClear 1.52</td>
			<td>Used to clear embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secure-Sea hybridization chambers</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5474</td>
			<td>Use as spacers for preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>simLab software</td>
			<td>SimLab soft</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide, depression concave glass - 75x25 mm</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>To mount thick embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three and four-dimensional visualization and analysis approaches to study vertebrate axial elongation and segmentation

Somitogenes är ett kännetecken för ryggradsdjurens embryonala utveckling. I åratal har forskare studerat denna process i en mängd olika organismer med hjälp av ett brett spektrum av tekniker som omfattar ex vivo- och in vitro-metoder. De flesta studier är emellertid fortfarande beroende av analys av tvådimensionella (2D) bilddata, vilket begränsar korrekt utvärdering av en utvecklingsprocess som axiell förlängning och somitogenes som involverar mycket dynamiska interaktioner i ett komplext 3D-utrymme. Här beskriver vi tekniker som gör det möjligt för mus live imaging acquisition, dataset bearbetning, visualisering och analys i 3D och 4D att studera cellerna (t.ex. neuromesodermala förfäder) som är involverade i dessa utvecklingsprocesser. Vi tillhandahåller också ett steg-för-steg-protokoll för optisk projektionstomografi och fullmonterad immunofluorescensmikroskopi i musembryon (från provberedning till bildförvärv) och visar en pipeline som vi utvecklat för att bearbeta och visualisera 3D-bilddata. Vi utökar användningen av några av dessa tekniker och belyser specifika egenskaper hos olika tillgängliga program (t.ex. Fiji / ImageJ, Drishti, Amira och Imaris) som kan användas för att förbättra vår nuvarande förståelse av axiell förlängning och somitbildning (t.ex. 3D-rekonstruktioner). Sammantaget betonar de tekniker som beskrivs här vikten av 3D-datavisualisering och analys i utvecklingsbiologi och kan hjälpa andra forskare att bättre ta itu med 3D- och 4D-bilddata i samband med ryggradsdjurs axiella förlängning och segmentering. Slutligen använder arbetet också nya verktyg för att underlätta undervisning i embryonal utveckling av ryggradsdjur.

De representativa resultaten som visas i detta dokument för både levande och immunofluorescensavbildning erhölls med användning av ett tvåfotonsystem, med ett 20 × 1.0 NA vattenmål, excitationslasern inställd på 960 nm och GaAsP-fotodetektorer (som beskrivs i Dias et al. (2020) 43. Optisk projektionstomografi gjordes med hjälp av en specialbyggd OPenT-skanner (som beskrivs i Gualda et al. (2013) 28.
Live imaging (4D-analys)</str...

Watch this Scientific Journal Video about Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation at JoVE.com

Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation

Här beskriver vi beräkningsverktyg och metoder som möjliggör visualisering och analys av tre- och fyrdimensionella bilddata för musembryon i samband med axiell förlängning och segmentering, erhållen genom in toto optisk projektionstomografi och genom levande avbildning och helmonterad immunofluorescensfärgning med hjälp av multifotonmikroskopi.

Tre- och fyrdimensionell visualiserings- och analysmetoder för att studera ryggradsdjurs axiella förlängning och segmentering

Somitogenesis is a hallmark of vertebrate embryonic development. For years, researchers have been studying this process in a variety of organisms using a ...

Organogenesstadierna i musembryon förblir dåligt studerade delvis på grund av den svåra visualiseringen av embryokomplexstrukturerna. Detta protokoll beskriver tekniker som möjliggör 3D- och 4D-visualisering och analys av musembryon under axiell förlängning och segmentering. Den största fördelen med denna teknik är att den tillåter forskare att studera och visa de komplexa strukturerna hos musembryot som 3D-dynamiska objekt.Detta protokoll innehåller tekniker som kan användas vid studier av medfödda missbildningar som påverkar ryggkotan och ryggmärgen hos däggdjur, såsom skolios. Dessa tekniker kan också användas med in vitro-modellsystem, vilket möjliggör studier av mänsklig embryonal utveckling. För att bereda musembryon mellan embryonal dag 8.25 och embryonal dag 10.5 för levande avbildning, dissekera embryona i förvärmt M2-medium vid 37 grader Celsius.Ta försiktigt bort äggula sac med rena pincett och tvätta embryot en gång med färskt M2-medium för att avlägsna blod och skräp som produceras under dissektion. Under den levande avbildningsproceduren inkuberar embryon i DMEM-medium med låg glukos kompletterat med 10% HyClone-definierad FBS, två millimolära L-glutamin och 1% penicillinstreptomycin i en 37 grader Celsius uppvärmd kammare och en 65% syre med 5% koldioxidmiljö. För att förbereda liknande stadium musembryon för immunofluorescensmikroskopi, istället för att använda uppvärmd M2, dissekera embryon i kall PBS och fixera i 4% paraformaldehyd.Efter att ha utfört hela mount immunofluorescensfärgningsprotokollet som beskrivs i textmanuskriptet kan vävnadsclearance uppnås med RapiClear. Placera först embryon i mitten av en 75 till 25 millimeter depression konkav glasglid, ta bort all PBST i mikroskopets depressionsglid och tillsätt 200 mikroliter rensningslösning och täck sedan glidberedningen med en låda. Efter 10 minuter skyddad från ljuset, när embryon börjar bli transparenta, byt ut rensningslösningen och vänta ytterligare 20 minuter.Toppa embryot med en täckglas som börjar från ena sidan och försiktigt rör sig mot den andra. Provet är nu klart för avbildning. För rensning med metylsalicylat eller BABB, se till att embryona är helt uttorkade i 100% metanol och starta sedan serien av BABB och metanol med 20% successiva koncentrationsökningar och en 20-minuters inkubation för varje steg.När BABB-lösningen når 100% gör du ytterligare två ändringar för en ny lösning. Förbered en 20 till 60 millimeter 1,5 täckglasskiva för att montera embryon för att undvika att komprimera provet. Lägg till distanser gjorda av tunna metallbrickor.Överför de rensade embryona till mikroskopglasen med en tandpetare, en fin bomullsspets eller en Pasteurpipett. Tillsätt sedan en droppe monteringsmedium, täck med ett annat liknande täckglas och försegla med smält paraffin för att bättre stabilisera preparatet för att undvika bubblor. Placera täckglaset på ena sidan och skjut det sedan gradvis och försiktigt i sidled, tillsätt mer medium om det behövs.Provet är nu redo att avbildas i mikroskopet. Använd Fiji / ImageJ för att omplacera embryot till en standardiserad främre-bakre och dorsal-ventral axelposition efter avbildning. Minska datauppsättningens storlek i Fijis bild, skala och infoga sedan de X-, Y- och Z-skalvärden som krävs för att minska datauppsättningen till mindre än 200 megabyte.Se till att alternativet Skapa nytt fönster är markerat. Gå sedan till plugins och öppna 3D Viewer. Inuti 3D Viewer-fönstret klickar du över embryot för att välja det, vilket får en röd 3D-ruta att visas.När du använder det här läget kontrollerar du datauppsättningens rotation med en mus. När du har säkerställt embryots perfekta position väljer du redigera, omvandlar bilden och exporterar transformerad bild i 3D Viewer-fönstret. Inspektera de olika ortogonala planen, gå sedan till bilden, stapla sedan och välj ortogonala vyer.När embryot är korrekt placerat väljer du fönstermenyn 3D Viewer och redigerar, omvandlar och sparar sedan transformationsmatrisen till en textfil med ett matttillägg. Öppna textfilen med Fiji / ImageJ, ta bort de två första raderna och spara igen. Detta skapar en transformationsmatrisfil som är kompatibel med Plugin-programmet TransformJ.Växla till datauppsättningen med fullständig upplösning och utför åtgärdsplugin-program TransformJ och TransformJ affine. I det nya fönstret bläddrar du för att söka efter matrisfilen som tidigare sparats, väljer kubisk B-splineinterpolering och omsampling isotropiskt och klickar sedan på OK. Efter korrekt ompositionering av embryot, trimma det mesta av det skapade tomma utrymmet. För att utföra en fullständig Z-projektionsbild, klicka på staplar, Z-projekt och välj maximal intensitet.Rita sedan den minsta avkastningen som innehåller hela embryot i X och Y.Växla till de ursprungliga datauppsättningsbildfönstren genom att klicka på redigera, markera, återställa markering och beskära genom att välja bild. Trimma skivorna i början och slutet som inte skär embryovävnader genom att välja bild och öppna staplar, klicka på verktyg, välj skivborttagaren och ange den första och sista skivan som ska tas bort, se till att ändra ökningen till en. Om så önskas, utför ytterligare analys och 3D-rekonstruktioner med hjälp av instruktionerna i textmanuskriptet.För att utföra 3D-analys av mer utvecklade embryon, dissekera embryonala dag 18,5-foster i kall PBS, ta bort alla extra embryonala membran och tvätta sedan fostren flera gånger i färsk PBS för att avlägsna blod och skräp som produceras under dissektionsproceduren. Fixa foster i 4% PFA gjord i PBS vid fyra grader Celsius i fem till sju dagar. Efter att ha tvättat embryot flera gånger i PBS, dehydrera fostren genom att inkubera i 10%10 på varandra följande ökningar av metanollösningar tills 100% metanol uppnås.Utför varje inkubation i 25 minuter på en shaker vid rumstemperatur. Därefter inkubera foster separat på en shaker först i en dag i 5% väteperoxid i metanol och sedan i 10% väteperoxid i metanol i upp till tre dagar tills embryon förlorar all naturlig pigmentering. Rehydrera embryon gradvis i en omvänd metanolserie i demineraliserat vatten med varje inkubation i 20 minuter på en shaker vid rumstemperatur och tvätta sedan embryon tre gånger i 30 minuter per tvätt i demineraliserat vatten.För att bädda in foster i 1% agarosblock, fyll i ett 50 ml plaströr eller spruta med smält agaros, placera sedan fostret i agarosen i vertikalt läge och behåll denna position med pincett under stelning av agarosen. Placera formen med blocket vid fyra grader Celsius i 30 minuter för att agarosen ska jellifiera helt, ta sedan bort agarosblocket med fostret från formen och placera det i en behållare med demoraliserat vatten. Utför fostrets uttorkning gradvis med 10% ökningar av metanolkoncentrationen utspädd i demineraliserat vatten eller PBS, håll provet i metanolkoncentration i minst 45 minuter vid rumstemperatur på en shaker tills 100% metanol uppnås.Rensa fostren genom att flytta dem genom en serie BABB-lösning och metanol i 2,5 timmar i varje koncentration med 25% ökningar av BABB-koncentrationen tills de når 100% BABB. Byt ut BABB-lösningen med en ny varje dag tills fostret är helt transparent. Den här processen kan ta tre till fem dagar.Använd lim för att fästa det rensade agarosblocket på OPT-skannerns motoraxel, justera sedan optiken för att få en bild av hela fostret och fortsätt att skaffa en fullständig projektionsdataset. 4D-tekniken för liveavbildning möjliggör dynamisk analys av LuVeLu-reporteruttryck och embryonala dag 8.5 Snai1-villkorliga knockout-embryon. Tillsammans med den normala LuVeLu-signalen på den presomitiska mesodermen visar Snai1-villkorliga knockout-embryon LuVeLu-uttryck i den ektopiska utbuktningen som härrör från den primitiva strimman.Hela mount immunofluorescensanalyser möjliggör detektion av potentiella NMP och viktiga regulatorer för mesodermdifferentiering. Vita och gula pilar markerar skillnader i mutanta och vilda embryon. 3D-renderning av hela bergets immunfärgningar möjliggör en bättre förståelse av vävnaden eller strukturen i studien.I detta fall undersöktes placeringen av potentiella NMP i svansknoppen. 3D-vävnadsrekonstruktioner är också viktiga för att förstå och karakterisera morfologiska defekter hos musembryon. Interaktiv visualisering av 3D-rekonstruktion kan också byggas i användarvänliga format.Till exempel i en PDF-fil. Dessa 3D-embryo kaudala strukturer kan användas för att illustrera kraften i 3D-modeller för en mer allmän publik och för att hjälpa till i studien för att undervisa en ryggradsdjur axiell förlängning och segmentering. Slutligen är 3D i totovisualisering av mer utvecklade musembryon möjlig med hjälp av OTP-mikroskopitekniken.Animerade återgivningar visas här och belyser viktiga skivor av embryonala dag 18,5 foster. Det viktigaste att komma ihåg är att resultatet måste förbli en trogen representation av vad som observeras i embryot. Forskare kan använda dessa metoder för att gå utöver att presentera bara statisk för bilderna, men också inkludera videor, tredimensionella rekonstruktioner och till och med interaktiva 3D-modeller av deras data.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Differentiering av en mänsklig Neural Stem Cell Line den Tredimensionell kulturer, Analys av MicroRNA och Förmodade målgenerna

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex vivo Kultur av Pharyngeal Arches att studera hjärta och muskelstamfäder och deras nisch

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

Visualisering av kondrocyttransplantation interkalering och riktnings spridning via Zebrabow Kloncellanalys i embryonala Meckels Brosk

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Kinetic Mätning och Real Time Visualisering av somatiska Omprogrammering

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Analys av retinsyra-inducerade Neural differentiering av Mouse embryonala stamceller i två och tre-dimensionella Embryoid organ

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisering och kvantitativ analys av embryonisk angiogenes i<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Med hjälp av In Vivo och vävnad och Cell Explant metoder att studera morfogenes och patogenes av embryonala och Perinatal Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Korrelat super-upplösning och elektronmikroskopi för att lösa Protein lokalisering i zebrafiskar näthinna

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Tredimensionell Rendering och analys av Immunolabeled, klargöras mänskliga placenta villösa vaskulär nätverk

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational analys av den Caenorhabditis elegans könsceller att studera fördelningen av atomkärnor, proteiner och cytoskelettet

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...