Name: three and four-dimensional visualization and analysis approaches to study vertebrate axial elongation and segmentation
Uploaded: 2021-02-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation at JoVE.com

LuVeLu muhabir suşu için Olivier Pourquié ve Alexander Aulehla'ya, RapiClear test örneği için SunJin laboratuvarına, BigStitcher'ı kullanma yardımı için Hugo Pereira'ya, canlı görüntüleme cihazının kurulmasına yardımcı oldukları için Nuno Granjeiro'ya, IGC hayvan tesisine ve Mallo laboratuvarının geçmiş ve şimdiki üyelerine bu çalışma sırasında yararlı yorumlar ve destek için teşekkür ederiz.
Portekiz Bölgesel Operasyonel Programı (Lisboa 2020) tarafından ortaklaşa finanse edilen Portekiz fonları ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 ve ref# PTDC/BII-BTI / 32375/2017 tarafından desteklenen IGC'nin Gelişmiş Görüntüleme Tesisi'nin, Portekiz 2020 Ortaklık Anlaşması kapsamında, Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu (FEDER) ve Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, Portekiz) aracılığıyla teknik desteğine teşekkür ederiz. Bu makalede açıklanan çalışmalar, M.M.'ye LISBOA-01-0145-FEDER-030254 (FCT, Portekiz) ve SCML-MC-60-2014 (Santa Casa da Misericórdia, Portekiz), araştırma altyapısı Congento, proje LISBOA-01-0145-FEDER-022170 ve doktora bursu PD / BD / 128426/2017 tarafından desteklenmiştir.

Hayvanları içeren deneyler, barınma, hayvancılık ve refah ile ilgili Portekiz (Portaria 1005/92) ve Avrupa (Direktif 2010/63/AB) mevzuatlarını takip etti. Proje, 'Instituto Gulbenkian de Ciência' Etik Komitesi ve Portekiz Ulusal Kuruluşu 'Direcção Geral de Alimentação e Veterinária' (lisans referansı: 014308) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. 3D ve 4D görüntüleme için numune hazırlama
NOT: Burada, canlı görüntüleme için ...

Eksenel uzama ve segmentasyon, omurgalı embriyonik gelişimi sırasında meydana gelen en karmaşık ve dinamik süreçlerden ikisidir. Tek hücreli izleme ile 3D ve 4D görüntülemenin kullanımı, erişilebilirlik ve kültür koşullarının karmaşık görüntülemeyi kolaylaştırdığı zebra balığı ve tavuk embriyolarında bu süreçleri incelemek için bir süredir uygulanmaktadır 19,44,45,46,47,48,49 <sup class="xr...

Omurgalı vücut ekseni oluşumu, embriyonik gelişim sırasında meydana gelen oldukça karmaşık ve dinamik bir süreçtir. Gastrulasyonun sonunda [farede, embriyonik gün (E) 8.0 civarında], nöromezodermal progenitörler (NMP'ler) olarak bilinen bir grup epiblast progenitör hücre, boyun, gövde ve kuyruk oluşumu sırasında nöral tüp ve paraksiyal mezodermal dokuları üreterek baştan kuyruğa sekansta eksenel genişlemenin önemli bir itici gücü haline gelir 1,2,3,4 . İlginçtir ki, bu NMP'lerin kaudal epiblastta işgal ettiği pozisyon, mezoderm veya nöroektoderm5'e farklılaşma kararında kilit bir rol oynamaktadır. Şu anda NMP'ler için kesin bir moleküler parmak izine sahip olmasak da, bu hücrelerin genellikle T (Brachyury) ve Sox2 5,6'yı birlikte eksprese ettiği düşünülmektedir. NMP kader kararlarını düzenleyen kesin mekanizmalar (yani, nöral veya mezodermal yollar alıp almadıkları) sadece kesin olarak tanımlanmaya başlanmaktadır. İlkel çizgi bölgesindeki Tbx6 ekspresyonu, NMP kader kararının erken bir belirtecidir, çünkü bu gen mezoderm 6,7'nin indüksiyonu ve spesifikasyonunda rol oynar. İlginç bir şekilde, erken mezoderm hücrelerinin yüksek düzeyde Epha18 eksprese ettiği görülmektedir ve Wnt / β-katenin sinyallemesinin yanı sıra Msgn1'in de paraksiyel mezoderm farklılaşmasında ve somit oluşumunda önemli rol oynadığı gösterilmiştir 9,10. NMP'lerin tek hücre düzeyinde tam bir mekansal-zamansal analizi, mezoderm spesifikasyonunu kontrol eden moleküler mekanizmaları tam olarak anlamak için kesinlikle etkili olacaktır.
Somitlerin (vertebra öncülleri) oluşumu omurgalıların önemli bir özelliğidir. Eksenel uzama sırasında, paraksiyel mezoderm, somitler olarak bilinen bir dizi iki taraflı tekrarlama biriminde bölümlere ayrılır. Somitlerin sayısı ve yeni segmentlerin oluşumu için gereken süre11,12 türleri arasında değişmektedir. Somitogenez, presomitik mezodermdeki (örneğin, Lfng) Notch, Wnt ve Fgf sinyal yollarının birkaç geninin döngüsel ekspresyonu ile gözlemlenebilen periyodik sinyal salınımlarını ("segmentasyon saati" olarak bilinir) içerir 11,12. Mevcut somitogenez modeli ayrıca, her yeni somitin arka sınırının konumunu tanımlayan Fgf, Wnt ve retinoik asit sinyalini içeren bir dizi karmaşık sinyal gradyanı olan bir "olgunlaşma dalga cephesinin" varlığını da varsaymaktadır. Bu nedenle, "segmentasyon saati" ve "olgunlaşma dalga cephesi" arasındaki koordineli bir etkileşim, bu omurların öncü modüllerinin üretilmesi için esastır, çünkü bu anahtar morfogenetik süreçlerdeki pertürbasyonlar embriyonik ölümcüllüğe veya konjenital malformasyonların oluşumuna (örneğin, skolyoz) neden olabilir13,14,15.
Görüntüleme teknikleri, biyogörüntü analiz yöntemleri ve yazılımlarındaki son zamanlardaki önemli ilerlemelere rağmen, eksenel uzama ve somitogenez ile ilgili çalışmaların çoğu, tam bir çok boyutlu doku görselleştirmesine izin vermeyen ve embriyonik gelişim sırasında meydana gelen normal morfolojik varyasyon ile patolojik malformasyonlar (yani mutasyonlar nedeniyle) arasındaki net farklılaşmayı zorlaştıran tek/izole iki boyutlu görüntü verilerine (örneğin, kesitler) dayanmaktadır16 . 3D görüntüleme, daha önce standart 2D yöntemlerle tanımlanmayan yeni morfogenetik hareketleri ortaya çıkardı17,18,19,20, omurgalı somitogenezi ve eksenel genişleme mekanizmalarını anlamak için toto görüntülemenin gücünü vurguladı.
Fare embriyolarının 3D ve 4D mikroskopisi, özellikle canlı görüntüleme, teknik olarak zordur ve doğru ve anlamlı mekansal-zamansal analize izin vermek için numune hazırlama, görüntü toplama ve veri ön işleme sırasında kritik adımlar gerektirir. Burada, eksenel genişleme ve segmentasyon sırasında hem NMP'leri hem de mezodermal hücreleri incelemek için kullanılabilecek fare embriyolarının canlı görüntüleme ve tam montajlı immünofloresan boyaması için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Ek olarak, yaşlı embriyoların ve fetüslerin optik projeksiyon tomografisi (OPT) için, somitogenez sırasındaki sorunlardan (örneğin, kemik füzyonu ve skolyoz) kaynaklanabilecek patolojik anormalliklerin toto görselleştirmesinde ve nicelleştirilmesinde 3D'ye izin veren bir protokol de tanımlıyoruz13,21,22. Son olarak, omurgalı segmentasyonu ve eksenel uzama çalışması ve öğretiminde 3D görüntüleme rekonstrüksiyonlarının gücünü gösteriyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose low gelling temperature</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9414</td>
			<td>Used to mounting embryos (e.g. for OPT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira software</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Brachyury (Goat polyclonal)</td>
			<td>R and D Systems</td>
			<td>AF2085 RRID:AB_2200235</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sox2 (Rabbit monoclonal)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab92494 RRID:AB_10585428</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tbx6 (Goat polyclonal)</td>
			<td>R and D Systems</td>
			<td>AF4744 RRID:AB_2200834</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Laminin111 (Rabbit polyclonal)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L9393 RRID:AB_477163</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-goat 488 (Donkey polyclonal)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11055 RRID:AB_2534102</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit 568 (Donkey polyclonal)</td>
			<td>ThermoFisher &#160; Scientific</td>
			<td>A10042 RRID:AB_2534017</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Alcohol (99+%)</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to clear embryos (component of BABB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl Benzoate (99+%)</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>Used to clear embryos (component of BABB)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>P6154</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x20 mm #0</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>100um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x20 mm #1</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>170um thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 20x60 mm #1.5</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>To use as &#8220;slides&#8221;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#8217;,6-Diamidino-2- Phenylindole Dihydrochloride)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D3571</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drishti software</td>
			<td>(open source)</td>
			<td>-</td>
			<td>Free software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ED2SS</td>
			<td>For demineralization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji/ImageJ software</td>
			<td>(open source)</td>
			<td>-</td>
			<td>Free software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>NZYtech</td>
			<td>MB01401</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens software</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone defined fetal bovine serum</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>#HYCLSH30070.03</td>
			<td>For live imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide solution 30 %</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>1085971000</td>
			<td>For clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane / Oxford instruments</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSpacers</td>
			<td>SunJin Lab</td>
			<td>(varies)</td>
			<td>Use as spacers for preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#25030&#8211;024</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low glucose DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11054020</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7167</td>
			<td>To dissect embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC20847.307</td>
			<td>For dehydration and rehydration steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl salicylate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6752</td>
			<td>Used to clear embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td>Used in solution to fix embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#P0781</td>
			<td>For live imaging medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate-buffered saline solution)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>L0615-500</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapiClear</td>
			<td>SunJin Laboratory</td>
			<td>RapiClear 1.52</td>
			<td>Used to clear embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secure-Sea hybridization chambers</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5474</td>
			<td>Use as spacers for preparations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>simLab software</td>
			<td>SimLab soft</td>
			<td>-</td>
			<td>Commerial software tool</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide, depression concave glass - 75x25 mm</td>
			<td>(any)</td>
			<td>-</td>
			<td>To mount thick embryos.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td>For immunofluorescence</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three and four-dimensional visualization and analysis approaches to study vertebrate axial elongation and segmentation

Somitogenez, omurgalı embriyonik gelişiminin bir işaretidir. Yıllardır, araştırmacılar bu süreci ex vivo ve in vitro yaklaşımları kapsayan çok çeşitli teknikler kullanarak çeşitli organizmalarda inceliyorlar. Bununla birlikte, çoğu çalışma hala iki boyutlu (2D) görüntüleme verilerinin analizine dayanmaktadır, bu da karmaşık bir 3D alanda oldukça dinamik etkileşimler içeren eksenel genişleme ve somitogenez gibi gelişimsel bir sürecin doğru bir şekilde değerlendirilmesini sınırlar. Burada, bu gelişimsel süreçlerde yer alan hücreleri (örneğin, nöromezodermal progenitörler) incelemek için fare canlı görüntüleme elde etme, veri kümesi işleme, görselleştirme ve 3D ve 4D olarak analiz etme tekniklerine izin veren teknikleri açıklıyoruz. Ayrıca, fare embriyolarında optik projeksiyon tomografisi ve tam montajlı immünofloresan mikroskopisi için adım adım bir protokol sağlıyoruz (numune hazırlamadan görüntü elde etmeye kadar) ve 3D görüntü verilerini işlemek ve görselleştirmek için geliştirdiğimiz bir boru hattını gösteriyoruz. Bu tekniklerden bazılarının kullanımını genişletiyoruz ve eksenel genişleme ve somit oluşumu (örneğin, 3D rekonstrüksiyonlar) hakkındaki mevcut anlayışımızı geliştirmek için kullanılabilecek farklı yazılımların (örneğin, Fiji / ImageJ, Drishti, Amira ve Imaris) belirli özelliklerini vurguluyoruz. Toplamda, burada açıklanan teknikler, gelişim biyolojisinde 3D veri görselleştirme ve analizinin önemini vurgulamaktadır ve diğer araştırmacıların omurgalı eksenel uzantısı ve segmentasyonu bağlamında 3D ve 4D görüntü verilerini daha iyi ele almalarına yardımcı olabilir. Son olarak, çalışma omurgalı embriyonik gelişimini öğretmeyi kolaylaştırmak için yeni araçlar da kullanmaktadır.

Bu yazıda hem canlı hem de immünofloresan görüntüleme için gösterilen temsili sonuçlar, 20 × 1.0 NA su hedefi, 960 nm'ye ayarlanmış uyarma lazeri ve GaAsP fotodetektörleri (Dias et al. (2020)43'te açıklandığı gibi) ile iki fotonlu bir sistem kullanılarak elde edilmiştir. Optik projeksiyon tomografisi, özel yapım bir OPenT tarayıcı kullanılarak yapıldı (Gualda et al. (2013)28'de açıklandığı gibi).
Canlı gö...

Watch this Scientific Journal Video about Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation at JoVE.com

Three and Four-Dimensional Visualization and Analysis Approaches to Study Vertebrate Axial Elongation and Segmentation

Burada, fare embriyolarının üç ve dört boyutlu görüntü verilerinin, toto optik projeksiyon tomografisi ve multifoton mikroskobu kullanılarak canlı görüntüleme ve tam montajlı immünofloresan boyama ile elde edilen eksenel uzama ve segmentasyon bağlamında görselleştirilmesini ve analizini sağlayan hesaplamalı araç ve yöntemleri açıklamaktayız.

Omurgalı Eksenel Uzama ve Segmentasyonunu İncelemek için Üç ve Dört Boyutlu Görselleştirme ve Analiz Yaklaşımları

Somitogenesis is a hallmark of vertebrate embryonic development. For years, researchers have been studying this process in a variety of organisms using a ...

Fare embriyolarındaki organogenez aşamaları, embriyo kompleks yapılarının zor görselleştirilmesi nedeniyle kısmen zayıf bir şekilde çalışılmaktadır. Bu protokol, eksenel genişleme ve segmentasyon sırasında fare embriyolarının 3D ve 4D görselleştirmesine ve analizine izin veren teknikleri açıklar. Bu tekniğin temel avantajı, araştırmacıların fare embriyosunun karmaşık yapılarını 3D dinamik nesneler olarak incelemelerine ve göstermelerine izin vermesidir.Bu protokol, skolyoz gibi memelilerin omurlarını ve omuriliğini etkileyen konjenital malformasyonların incelenmesinde kullanılabilecek teknikler içerir. Bu teknikler in vitro model sistemlerle de kullanılabilir, böylece insan embriyonik gelişiminin incelenmesine izin verilir. Canlı görüntüleme için embriyonik gün 8.25 ile embriyonik gün 10.5 arasında fare embriyoları hazırlamak için, embriyoları önceden ısıtılmış M2 ortamında 37 santigrat derecede diseke edin.Temiz forseps kullanarak yumurta sarısı kesesini nazikçe çıkarın ve diseksiyon sırasında üretilen kan ve kalıntıları çıkarmak için embriyoyu bir kez taze M2 ortamı ile yıkayın. Canlı görüntüleme prosedürü sırasında, embriyoları% 10 HyClone tanımlı FBS, iki milimolar L-glutamin ve% 1 penisilin streptomisin ile desteklenmiş düşük glikozlu DMEM ortamında, 37 santigrat derece ısıtılmış bir odada ve% 5 karbondioksit ortamına sahip% 65 oksijen ile inkübe edin. İmmünofloresan mikroskopi için benzer aşamadaki fare embriyolarını hazırlamak için, ısıtılmış M2 kullanmak yerine, embriyoları soğuk PBS'de diseke edin ve% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin.Metin makalesinde açıklandığı gibi tüm mount immünofloresan boyama protokolü uygulandıktan sonra, RapiClear kullanılarak doku temizliği sağlanabilir. İlk olarak, embriyoları 75 x 25 milimetrelik bir çöküntü içbükey cam slaytın ortasına yerleştirin, mikroskop çöküntü slaytındaki tüm PBST'yi çıkarın ve 200 mikrolitre temizleme çözeltisi ekleyin, ardından slayt hazırlığını bir kutu ile örtün. Işıktan korunan 10 dakika sonra, embriyolar şeffaf hale gelmeye başladığında, temizleme solüsyonunu değiştirin ve 20 dakika daha bekleyin.Embriyoyu bir taraftan başlayıp yavaşça diğer tarafa doğru hareket eden bir örtü ile doldurun. Örnek artık görüntüleme için hazırdır. Metil salisilat veya BABB kullanarak temizleme için, embriyoların% 100 metanol içinde tamamen dehidrate olduğundan emin olun ve daha sonra konsantrasyonda% 20 ardışık artışlar ve her adım için 20 dakikalık bir inkübasyon ile BABB ve metanol serisine başlayın.BABB çözümü% 100'e ulaştığındaYeni bir çözüm için iki ek değişiklik yapın. Numunenin sıkıştırılmasını önlemek için embriyoları monte etmek için 20 x 60 milimetre 1,5 kapak camı slayt hazırlayın. İnce metal yıkayıcılardan yapılmış ara parçalar ekleyin.Temizlenen embriyoları bir kürdan, ince bir pamuk ucu veya bir Pasteur pipeti kullanarak mikroskop slaytlarına aktarın. Daha sonra bir damla montaj ortamı ekleyin, başka bir benzer kapak camıyla örtün ve kabarcıkları önlemek için hazırlığı daha iyi stabilize etmek için erimiş parafin ile kapatın. Kapak kaymasını bir tarafa yerleştirin ve ardından yavaş yavaş ve yavaşça yana doğru kaydırın, gerekirse daha fazla ortam ekleyin.Örnek şimdi mikroskopta görüntülenmeye hazırdır. Görüntülemeden sonra embriyoyu standartlaştırılmış bir ön-posterior ve dorsal-ventral eksen pozisyonuna yeniden konumlandırmak için Fiji / ImageJ kullanın. Fiji'nin görüntüsündeki veri kümesi boyutunu azaltın, ardından veri kümesini 200 megabayttan daha azına düşürmek için gereken X, Y ve Z ölçek değerlerini ölçeklendirin ve ekleyin.Yeni pencere oluştur seçeneğinin işaretli olduğundan emin olun. Ardından eklentilere gidin ve 3D Viewer'ı açın. 3B Görüntüleyici penceresinin içinde, embriyoyu seçmek için üzerine tıklayın ve kırmızı bir 3B kutunun görünmesine neden olun.Bu modu kullanırken, veri kümesinin dönüşünü fare ile denetleyin. Embriyonun mükemmel konumunu sağladıktan sonra, düzenle'yi seçin, görüntüyü dönüştürün ve dönüştürülmüş görüntüyü 3D Viewer penceresinde dışa aktarın. Farklı ortogonal düzlemleri inceleyin, ardından görüntüye gidin, ardından ortogonal görünümleri yığınlayın ve seçin.Embriyo doğru konumlandırıldığında, 3B Görüntüleyici pencere menüsünü seçin, ardından dönüştürme matrisini düzenleyin, dönüştürün ve mat uzantılı bir metin dosyasına kaydedin. Metin dosyasını Fiji/ImageJ kullanarak açın, ilk iki satırı kaldırın ve yeniden kaydedin. Bu, TransformJ eklentisiyle uyumlu bir dönüşüm matrisi dosyası oluşturur.Tam çözünürlüklü veri kümesine geçin ve TransformJ ve TransformJ affine işlem eklentilerini gerçekleştirin. Yeni pencerede, daha önce kaydedilmiş matris dosyasını aramak için göz atın, kübik B-spline enterpolasyonunu seçin ve izotropik olarak yeniden örnekleyin, ardından Tamam'ı tıklayın. Embriyoyu düzgün bir şekilde yeniden konumlandırdıktan sonra, oluşturulan boş alanın çoğunu kesin. Tam bir Z projeksiyon görüntüsü gerçekleştirmek için yığınlara, Z Projesi'ne tıklayın ve maksimum yoğunluğu seçin.Ardından, X ve Y'deki tüm embriyoyu içeren minimum yatırım getirisini çizin.Düzenle, seçim, seçimi geri yükle ve görüntüyü seçerek kırp'a tıklayarak orijinal veri kümesi görüntü pencerelerine geçin. Görüntü seçerek ve yığınları açarak embriyo dokularıyla kesişmeyen başlangıçtaki ve sondaki dilimleri kesin, araçlara tıklayın, dilim sökücüyü seçin ve çıkarılacak ilk ve son dilimi belirtin, artışı bire değiştirdiğinizden emin olun. İstenirse, metin makalesindeki talimatları kullanarak daha fazla analiz ve 3D rekonstrüksiyon gerçekleştirin.Daha gelişmiş embriyoların 3D analizini yapmak için, embriyonik gün 18.5 fetüslerini soğuk PBS'de diseke edin, tüm ekstra embriyonik zarları çıkarın, daha sonra diseksiyon prosedürü sırasında üretilen kan ve kalıntıları çıkarmak için fetüsleri taze PBS'de birkaç kez yıkayın. PBS'de yapılan fetüsleri% 4 PFA'da beş ila yedi gün boyunca dört santigrat derecede sabitleyin. Embriyoyu PBS'de birkaç kez yıkadıktan sonra,% 100 metanole ulaşılana kadar% 10 metanol çözeltisinin art arda 10 artışını inkübe ederek fetüsleri dehidrate edin.Her inkübasyonu oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde 25 dakika boyunca gerçekleştirin. Daha sonra, fetüsleri önce metanolde% 5 hidrojen peroksitte bir gün boyunca bir çalkalayıcı üzerinde ayrı ayrı inkübe edin ve daha sonra embriyolar tüm doğal pigmentasyonu kaybedene kadar üç güne kadar metanolde% 10 hidrojen peroksit içinde inkübe edin. Embriyoları ters metanol serisinde demineralize suda kademeli olarak rehidre edin, her inkübasyonda oda sıcaklığında bir çalkalayıcıda 20 dakika boyunca inkübasyon, daha sonra embriyoları demineralize suda yıkama başına 30 dakika boyunca üç kez yıkayın.Fetüsleri% 1 agaroz bloklarına gömmek için, 50 mililitrelik bir plastik tüp veya şırıngayı erimiş agarozla doldurun, ardından fetüsü agaroza dikey bir pozisyonda yerleştirin ve agarozun katılaşması sırasında forseps ile bu pozisyonu koruyun. Agarozun tamamen jöle yapması için kalıbı 30 dakika boyunca dört santigrat derecede blokla yerleştirin, ardından agaroz bloğunu fetüsle birlikte kalıptan çıkarın ve demoralize su içeren bir kaba koyun. Demineralize su veya PBS ile seyreltilmiş metanol konsantrasyonunda% 10'luk artışlarla fetüs dehidrasyonunu kademeli olarak gerçekleştirin, numuneyi% 100 metanole ulaşılana kadar bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında en az 45 dakika metanol konsantrasyonunda tutun.Fetüsleri, her konsantrasyonda 2.5 saat boyunca bir dizi BABB çözeltisi ve metanol ile hareket ettirerek temizleyin ve BABB konsantrasyonunda% 100 BABB'ye ulaşana kadar% 25 artış sağlayın. BABB çözeltisini, fetüs tamamen şeffaf olana kadar her gün taze bir çözelti ile değiştirin. Bu işlem üç ila beş gün sürebilir.Temizlenmiş agaroz bloğunu OPT tarayıcısının motor eksenine bağlamak için yapıştırıcı kullanın, ardından tüm fetüsün görüntüsünü elde etmek için optikleri ayarlayın ve tam bir projeksiyon veri kümesi elde etmeye devam edin. 4D canlı görüntüleme tekniği, LuVeLu muhabir ekspresyonunun ve embriyonik gün 8.5 Snai1 koşullu nakavt embriyolarının dinamik analizini sağlar. Presomitik mezodermdeki normal LuVeLu sinyalinin yanı sıra, Snai1 koşullu nakavt embriyoları, ilkel çizgiden kaynaklanan ektopik çıkıntıda LuVeLu ekspresyonunu gösterir.Tüm montaj immünofloresan testleri, potansiyel NMP'lerin ve mezoderm farklılaşmasının anahtar düzenleyicilerinin tespit edilmesini sağlar. Beyaz ve sarı oklar, mutant ve vahşi tip embriyolardaki farklılıkları vurgular. Tüm montaj immün boyamalarının 3D render'ı, çalışmadaki doku veya yapının daha iyi anlaşılmasını sağlar.Bu durumda, potansiyel NMP'lerin kuyruk tomurcuğundaki yeri araştırıldı. 3D doku rekonstrüksiyonları, fare embriyolarındaki morfolojik kusurları anlamak ve karakterize etmek için de önemlidir. 3D rekonstrüksiyonun etkileşimli görselleştirilmesi de kullanıcı dostu formatlarda oluşturulabilir.Örneğin, bir PDF dosyasında. Bu 3D embriyo kaudal yapıları, 3D modellerin gücünü daha genel bir kitleye göstermek ve omurgalı eksenel uzama ve segmentasyonunu öğretmede çalışmaya yardımcı olmak için kullanılabilir. Son olarak, OTP mikroskopi tekniği kullanılarak daha gelişmiş fare embriyolarının toto görselleştirmesinde 3D mümkündür.Embriyonik gün 18.5 fetüslerinin anahtar dilimlerini vurgulayan animasyonlu render'lar burada gösterilmektedir. Hatırlanması gereken en önemli şey, sonucun embriyoda gözlemlenenlerin sadık bir temsili olarak kalması gerektiğidir. Araştırmacılar bu yöntemleri, görüntülere sadece statik sunmanın ötesine geçmek için kullanabilirler, ancak aynı zamanda videolar, üç boyutlu rekonstrüksiyonlar ve hatta verilerinin etkileşimli 3D modellerini de içerebilirler.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Üç Boyutlu Kültürleri, mıkroRNA Analizi ve Putatif Hedef Genler üzerinde bir İnsan Sinir Kök Hücre Hattı Farklılaşma

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Ex Vivo Culture of Pharyngeal Arches to Study Heart and Muscle Progenitors and Their Niche

Faringeal Arches Ex Vivo Kültür Kalp ve kas atalarıdır ve Bunların Niche Eğitim için

The pharyngeal mesoderm of developing embryos contributes to broad regions of head and heart musculature. We have developed a novel method to study head ...

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

Embriyonik Meckel Kıkırdak içinde Zebrabow klonal Hücre Analizi aracılığıyla Kondrosit interkalasyonu ve Yön Yayılması Görselleştirme

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Somatik yeniden programlanması Kinetik Ölçümü ve Gerçek Zamanlı Görselleştirme

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

İki ve Üç boyutlu Embriyoid Oluşumu Fare Embriyonik Kök Hücreler Retinoik Asit kaynaklı sinir Farklılaşma analizi

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Embriyonik Anjiyojenezin Görselleştirilmesi ve Nicel Analizi<emXenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Morfogenez ve embriyonik ve Perinatal aort patogenezi okumaya vivo içinde ve doku ve hücre Explant yaklaşımları kullanma

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Bağdaşık süper çözünürlük ve elektron mikroskobu Zebra balığı Retina Protein yerelleşme gidermek için

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Üç boyutlu görüntü oluşturma ve çözümleme-in Immunolabeled, açıklık insan plasental Villous damar ağları

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Çekirdeklerin dağıtım, proteinler ve sitoiskeleti çalışmaya Caenorhabditis elegans Germline sayısal analizi

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...