Name: analysis of translation in the developing mouse brain using polysome profiling
Uploaded: 2021-05-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل من منحة اكتشاف NSERC (RGPIN/04246-2018 إلى G.Y.). G.Y. هو كرسي البحوث الكندية. تم تمويل S.K. من قبل زمالة Mitacs Globalink للدراسات العليا ومنحة طلاب الدراسات العليا في ACHRI.

وأشرفت لجنة رعاية الحيوانات في جامعة كالغاري على جميع استخدام الحيوانات. تم شراء فئران CD1 المستخدمة في التجربة من بائع تجاري.
1. إعداد الحلول
ملاحظة لمنع تدهور الحمض النووي الريبي، رش منضدة العمل وجميع المعدات مع محلول إزالة التلوث RNase. يتم استخدام نصائح خالية ?...

<ol>
	<li>G&#246;tz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+neurogenesis.">The cell biology of neurogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).</li><li>Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+specification+of+neural+fates+by+transcription+factor+codes.">Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes.</a> Development. 134, 3771-3780 (2007).</li><li>Fiddes, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-Specific+NOTCH2NL+Genes+Affect+Notch+Signaling+and+Cortical+Neurogenesis.">Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis.</a> Cell. 173, 1356-1369 (2018).</li><li>Lennox, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+DDX3X+mutations+impair+RNA+metabolism+and+neurogenesis+during+fetal+cortical+development.">Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development.</a> Neuron. 106, 404-420 (2020).</li><li>Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+control+of+neurogenesis:+A+view+from+the+mammalian+cerebral+cortex.">Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359 (2012).</li><li>Amadei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Smaug2-based+translational+repression+complex+determines+the+balance+between+precursor+maintenance+versus+differentiation+during+mammalian+neurogenesis.">A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis.</a> Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).</li><li>Yang, G., Smibert, C. A., Kaplan, D. R., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+eIF4E1/4E-T+complex+determines+the+genesis+of+neurons+from+precursors+by+translationally+repressing+a+proneurogenic+transcription+program.">An eIF4E1/4E-T complex determines the genesis of neurons from precursors by translationally repressing a proneurogenic transcription program.</a> Neuron. 84, 723-739 (2014).</li><li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Glo1-Methylglyoxal+pathway+that+is+perturbed+in+maternal+diabetes+regulates+embryonic+and+adult+neural+stem+cell+pools+in+murine+offspring.">A Glo1-Methylglyoxal pathway that is perturbed in maternal diabetes regulates embryonic and adult neural stem cell pools in murine offspring.</a> Cell Reports. 17, 1022-1036 (2016).</li><li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+defined+neocortical+translation+and+polysome+assembly+are+determined+by+the+RNA-binding+protein+Hu+antigen+R.">Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).</li><li>Rodrigues, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylglyoxal+couples+metabolic+and+translational+control+of+Notch+signalling+in+mammalian+neural+stem+cells.">Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells.</a> Nature Communications. 11, 2018 (2020).</li><li>Iwasaki, S., Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+toolbox+for+protein+synthesis+studies.">The growing toolbox for protein synthesis studies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).</li><li>Chekulaeva, M., Landthaler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+on+translation.">Eyes on translation.</a> Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).</li><li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Selective+mRNA+Translation+in+Mammalian+Cells+by+Polysome+Profiling.">Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e52295 (2014).</li><li>Chass&#233;, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+using+polysome+profiling.">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45, 15 (2017).</li><li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin.">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).</li><li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamic+WNT3+secretion+spatiotemporally+regulates+the+neocortical+ribosome+signature+and+mRNA+translation+to+specify+neocortical+cell+subtypes.">Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes.</a> Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e51455 (2014).</li></ol>

التنميط المتعدد هو تقنية شائعة الاستخدام وقوية لتقييم الحالة الترجمية في كل من الجينات الفردية ومستويات الجينوم على نطاق14. في هذا التقرير، نقدم بروتوكولا للتنميط المتعدد باستخدام منصة تجميعها في المنزل وتطبيقها لتحليل قشرة الماوس النامية. هذه المنصة الفعالة من حيث التكلفة ...

أثناء تطور دماغ الثدييات ، تتكاثر الخلايا الجذعية العصبية وتفرق لتوليد الخلايا العصبية وجليا1،2 . اضطراب هذه العملية يمكن أن يؤدي إلى تغييرات في بنية الدماغ ووظيفة, كما رأينا في العديد من اضطرابات النمو العصبي3,4. السلوك السليم للخلايا الجذعية العصبية يتطلب التعبير المنظم لجينات محددة5. في حين تمت دراسة التحكم اللاجيني والنسخي لهذه الجينات بشكل مكثف ، تشير النتائج الأخيرة إلى أن تنظيم الجينات على مستويات أخرى يساهم أيضا في تنسيق انتشار الخلايا الجذعية العصبية والتمايز6و7و8و9و10. وبالتالي ، فإن معالجة برامج التحكم التحويلية سوف تعزز بشكل كبير فهمنا للآليات الكامنة وراء قرار مصير الخلايا الجذعية العصبية وتطور الدماغ.
وقد طبقت ثلاث تقنيات رئيسية مع نقاط قوة مختلفة على نطاق واسع لتقييم الوضع الترجمي من مرنا، بما في ذلك التنميط ريبوسوم، وترجمة تنقية تقارب الريبوسوم (TRAP) والتنميط متعدد السمات. التنميط ريبوسوم يستخدم تسلسل الحمض النووي الريبي لتحديد شظايا الحمض النووي الريبي المحمية ريبوسوم، مما يسمح للتحليل العالمي لعدد وموقع ترجمة الريبوسومات على كل نسخة لاستنتاج غير مباشر معدل الترجمة من خلال مقارنتها وفرة النص11. TRAP يستفيد من البروتينات الريبوسومية الموسومة بالظهارة لالتقاط الريبوسوم ملزمة mRNAs12. وبالنظر إلى أنه يمكن التعبير عن البروتينات الريبوسومية الموسومة في أنواع خلايا محددة باستخدام النهج الوراثية، يسمح TRAP بتحليل الترجمة بطريقة خاصة بنوع الخلية. وبالمقارنة، فإن التنميط المتعدد، الذي يستخدم تجزئة تدرج كثافة السكروز لفصل الجزء الحر والسيء الترجمة (أحاديات أخف وزنا) عن تلك التي تترجم بنشاط عن طريق الريبوسومات (البوليسومات الأثقل)، يوفر قياسا مباشرا لكثافة الريبوسوم على مرنا13. ميزة واحدة تقدم هذه التقنية هو براعة لدراسة ترجمة مرنا محددة من الفائدة، فضلا عن تحليل ترجمة الجينوم على نطاقواسع 14.
في هذه الورقة، ونحن نصف بروتوكول مفصل من التنميط متعددة لتحليل قشرة الدماغ الماوس النامية. نحن نستخدم نظام تجميعها في المنزل لإعداد تدرجات كثافة السكروز وجمع الكسور لتطبيقات المصب. يمكن تكييف البروتوكول المعروض هنا بسهولة لتحليل أنواع أخرى من الأنسجة والكائنات الحية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL RNA free microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Greiner-Bio</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M MgCl2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21-23G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M KCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt end needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB2530/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>115-39-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 mouse</td>
			<td></td>
			<td>Charles River Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tip forceps</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#Z168785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td></td>
			<td>Sigma</td>
			<td>66-81-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition software TracerDAQ</td>
			<td>Measurement Computing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital converter</td>
			<td></td>
			<td>Measurement Computing</td>
			<td>USB-1208LS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA miniprep kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>R2070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>12-03-3483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No.5 forceps</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Model 2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-513-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear stage actuator</td>
			<td>Rattmmotor</td>
			<td>CBX1605-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase control RNA</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L4561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima first strand cDNA synthesis kit</td>
			<td>Themo Fisher</td>
			<td>M1681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature V-clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VH1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MSB7515/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series optical post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MS2R/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series pedestal post holder base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MBA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;12.7 mm aluminum post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TRA150/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa SYBR green fastmix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>CA101414-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>58-58-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RA90/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle &#216;1/2&#34; to &#216;6 mm post clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RA90TR/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase AWAY</td>
			<td>Molecular BioProducts</td>
			<td>7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free tips</td>
			<td>Frogga Bio</td>
			<td>FT10, FT200, FT1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free water</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>809-115-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim right-angle bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AB90B/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small V-clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VC1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>302-95-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper motor driver</td>
			<td>SongHe</td>
			<td>TB6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>57501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube piercer</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>BR-184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td></td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>L8-70M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO project super starter kit</td>
			<td>Elegoo</td>
			<td>EL-KIT-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV monitor</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>EM-1 Econo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VB01A/M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of translation in the developing mouse brain using polysome profiling

يعتمد التطور السليم لدماغ الثدييات على توازن دقيق بين انتشار الخلايا الجذعية العصبية والتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا العصبية. يتم التحكم في هذا التوازن بإحكام من خلال التعبير الجيني الذي يتم ضبطه على مستويات متعددة ، بما في ذلك النسخ وما بعد النسخ والترجمة. وفي هذا الصدد، تبرز مجموعة متزايدة من الأدلة دورا حاسما للتنظيم التحويلي في تنسيق قرارات مصير الخلايا الجذعية العصبية. الكسر المتعدد هو أداة قوية لتقييم حالة الحمض النووي الريبي الترجمي على المستويين الجيني العالمي والفردي. هنا، نقدم خط أنابيب متعدد السمات في المنزل لتقييم الكفاءة التحويلية في الخلايا من قشرة الدماغ الماوس النامية. نحن نصف بروتوكولات إعداد تدرج السكروز وتحلل الأنسجة والطرد الفائق والتحليل القائم على الكسر للحالة الترجمية ل mRNA.

كمظاهرة، تم فصل الليزات القشرية التي تحتوي على 75 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي (مجمعة من 8 أجنة) عن طريق تدرج السكروز إلى 12 كسرا. قمم امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 254 نانومتر حددت الكسور التي تحتوي على وحدة فرعية 40S، وحدة فرعية 60S، 80S أحادية والبوليسومات(الشكل 4A). تحليل الك...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling at JoVE.com

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

يتطلب تطور دماغ الثدييات التحكم السليم في التعبير الجيني على مستوى الترجمة. هنا، ونحن نصف نظام التنميط متعددة مع سهلة لتجميع السكروز التدرج صنع ومنصة الكسر لتقييم الحالة التحويلية من الحمض النووي الريبي في الدماغ النامية.

تحليل الترجمة في الدماغ الماوس النامية باستخدام التنميط متعددة

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

التنظيم التحويلي يلعب دورا هاما في نمو الدماغ. التنميط المتعدد يوفر أداة مفيدة وقوية لتقييم الحالة الترجمية من مرنا، مما يجعل من الممكن لدراسة وظائف التحكم التحويلية أثناء نمو الدماغ. هذه الطريقة هي نهج سهل ومنخفض التكلفة لجعل تدرجات السكروز وتقييم الكسر المتعدد.في هذا البروتوكول، يتم استخدامه لتحليل قشرة الماوس النامية. ومع ذلك، يمكن تكييفها بسهولة لدراسة النظم الأخرى. تبدأ بتخفيف 2.2 السكروز الضرس لإعداد ستة 10 إلى 50٪ تدرجات السكروز.ملء حقنة 30 ملليلتر مع ما يقرب من 16 ملليلتر من السكروز 10٪، ووضعها على مضخة حقنة وربطها إلى الإبرة. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في الحقنة أو الأنابيب أو الإبرة، ومسح طرف الإبرة لإزالة أي محلول متبقي. تحريك المرحلة الآلية حتى بحيث طرف الإبرة يمس مركز الأنبوب في الجزء السفلي.تعيين مضخة حقنة لمعدل تدفق من اثنين من ملليلتر في الدقيقة الواحدة لحجم 2.3 ملليلتر. بعد الاستغناء عن 2.3 ملليلتر من محلول السكروز 10٪، انتقل إلى أسفل المرحلة الآلية وتكرار العملية لجميع التدرجات الستة. ثم أضف محلول السكروز بنسبة 20٪ إلى الجزء السفلي من الأنابيب يليه 30 و 40 و 50٪ جمع أجنة الفئران CD1 في اليوم الجنيني 12 ووضعها في لوحة 10 سم تحتوي على HBSS الجليد الباردة على الجليد.تحت نطاق التشريح، نقل جنين واحد إلى لوحة ستة سنتيمترات تحتوي على HBSS الجليد الباردة. استخدام الإبر قياس 21-23 لإصلاح موقف الرأس عن طريق اختراق من خلال العينين في زاوية 45 درجة وتطبيق قوة للتأكد من الإبر ثابتة على لوحة. استخدام ملقط رقم خمسة لإزالة الجلد والجمجمة تعمل من الوسط إلى الجانبين، ثم قطع المصابيح الشمية وإزالة السحايا لفضح الأنسجة القشرية.استخدام ملقط منحني لقطع الأنسجة القشرية إلى 2-3 ملليلتر من المتوسط العصبي على الجليد. سحب الأنسجة من أجنة مختلفة حسب الحاجة. الأنسجة من ثمانية إلى 10 أجنة تعطي عادة ما يقرب من 200 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي.إضافة سيكلوهيكسيميد إلى الوسط العصبي القاعدي مع الأنسجة تشريح إلى تركيز النهائي من 100 ميكروغرام لكل ملليلتر واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. طرد الأنسجة في 500 × ز لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية والتخلص من supernatant. غسل الأنسجة مرتين مع الجليد البارد PBS تكملها مع 100 ميكروغرام لكل ملليلتر سيكلوهيكسيميد.إضافة 500 ميكرولتر من العازلة تحلل الخلية تكملها مع أربعة ميكرولترات من مثبطات RNase وماصة صعودا وهبوطا لإعادة إنفاق الأنسجة. استخدم إبرة الأنسولين لتسلي الأنسجة برفق. ثم تحتضن على الجليد لمدة 10 دقائق مع دوامة قصيرة كل دقيقتين إلى ثلاث دقائق.بعد الحضانة، طرد المركزية في lysate 2000 x ز لمدة خمس دقائق في أربع درجات مئوية ونقل supernatant إلى أنبوب طرد مركزي جديد على الجليد. كرر هذه العملية مرة أخرى الطرد المركزي في 13، 000 x ز. بعد نقل الناطور إلى أنبوب طرد مركزي جديد على الجليد ، قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي في الأنسجة باستخدام مطياف UV-Vis.تحميل العينات على رأس التدرجات السكروز عن طريق الاستغناء ببطء lysate إلى جدران أنابيب الطرد الفائق. ضع تدرجات السكروز برفق في الدلاء واطرد العينات بسرعة 190 و000 × ز وأربع درجات مئوية لمدة 90 دقيقة. ضع أنبوب طرد مركزي فارغ على مثقب الأنبوب واخترق الأنبوب برفق بواسطة الإبرة من الأسفل.ملء حقنة 30 ملليلتر مع 25 ملليلتر من محلول مطاردة السكروز 60٪. ثم اضغط بلطف على الحقنة بحيث يملأ محلول المطاردة الأنبوب الفارغ ويمر عبر شاشة الأشعة فوق البنفسجية 254 نانومتر لتعيين خط الأساس للكشف. اضغط على الصفر التلقائي على شاشة الأشعة فوق البنفسجية لتسجيل خط أساس للكشف، ثم اضغط على تشغيل على البرنامج لبدء التسجيل.بمجرد أن يضع النظام خط الأساس ، وقفة تسجيل على البرنامج والتراجع عن حل مطاردة ، والتأكد من أن أي حل مطاردة المتبقية لا يزال في النظام. تحميل أنبوب عينة واحدة على أنبوب مثقب واختراق بلطف أنبوب مع الإبرة من أسفل. بدء التسجيل على البرنامج، تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في الخط.ثم بدء مضخة حقنة وجامع الكسور لجمع كسور متعددة، ووضع الكسر إلى 30 ثانية. جمع الكسور في أنابيب 1.5 ملليلتر. تم فصل الليزات القشرية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي التي تم سحبها من ثمانية أجنة عن طريق تدرج السكروز إلى 12 كسرا.حددت قمم امتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 254 نانومتر كسور تحتوي على وحدة فرعية 60S 40S و 80S أحادية وبوليسوم. أظهر تحليل الكسور بواسطة البقعة الغربية للوحدات الفرعية الريبوسومية الكبيرة Rpl10 وجودها في أحاديات وبوليسومات 60S الفرعية. في المقابل، لم تكن البروتينات السيتوبلازمية، Gapdh و Csde1، مرتبطة بالريبوسومات، ولكنها كانت غنية في كسور تحتوي على الحمض النووي الريبي الحر.بما يتفق مع فصل البروتينات في كسور مختلفة، كانت جابد وsox2 mRNAs غنية للغاية في الكسور التي تحتوي على البوليسومات الثقيلة، مما يشير إلى أن هذه الرناس تترجم بكفاءة في القشرة النامية. وعلى النقيض من ذلك، تم إثراء rpl7 و rpl35 mRNAs في الكسر الذي يحتوي على أحاديات، مما يشير إلى ترجمة مكبوتة. للحصول على نتائج قابلة للاستنساخ، من المهم الحفاظ على الاتساق في صنع تدرجات السكروز.يجب استخدام مضخات الحقن لإخراج السكروز. أثناء الكسر وجمع العينات ، من المهم غسل النظام بالماء الخالي من RNase. وهذا يقلل من أي السكروز المتبقية من العينة السابقة.يمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم الحالة الترجمية للرنانات الريبية في مختلف الأنسجة. باستخدام النظام الأساسي ، يمكن الحصول على تدرجات متسقة للتنميط المتعدد ، مما يوفر حلا منخفض التكلفة لهذه التقنية الكلاسيكية والمفيدة.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

تحليل فسيفساء من وظائف الجينات في الدماغ بعد الولادة ماوس التنمية عن طريق استخدام فيروس لجنة المساواة العرقية القائمة على التوحد

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

Electroporation في الجسم الحي من الشبكية ماوس النامية

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

وحيدة الخلية التنميط من الخلايا العصبية الشبكية المتطورة والناضجة

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

التصور والتلاعب الجيني من التشعبات والاعمده الفقريه في قشرة الدماغ والحصين ماوس باستخدام<em&gt; في الرحم</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

تقييم التقدم دورة الخلية الجذعية العصبية من الخلايا والسلف في تطوير الدماغ ماوس بعد الإجهاد السمية الوراثية

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

التصوير حية من الانقسام في تطوير الجنينية الماوس اللحاء

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

التصوير ألياف هرمون السيروتونين في الحبل الشوكي الماوس عن طريق وضوح / تقنية مكعب

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

نمذجة عدوى فيروس زكى من وضع الدماغ البشري في المختبر باستخدام الخلايا الجذعية المشتقة من أورجانويدس الدماغي

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

التحديد الكمي للتوزيع غير متجانسة من البروتين متشابك في الدماغ الماوس استخدام الفلورة

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

غرس المزمن من الصفيف اليكتروكورتيكوجرافيك الجامعة القشرية في مرموز المشتركة

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...