Name: analysis of translation in the developing mouse brain using polysome profiling
Uploaded: 2021-05-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af en NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018 til G.Y.). G.Y. er en Canada Research Chair. S.K. blev finansieret af Mitacs Globalink Graduate Fellowship og ACHRI Graduate Student Scholarship.

Al dyrebrug blev overvåget af Animal Care Committee ved University of Calgary. CD1 mus, der anvendes til eksperimentet blev købt fra kommercielle leverandør.
1. Udarbejdelse af løsninger
BEMÆRK For at forhindre RNA-nedbrydning skal arbejdsbænken og alt udstyr med RNase dekontamineringsopløsning forhindres. RNase-fri tips bruges til eksperimentet. Alle løsninger er tilberedt i RNase-fri vand.
<ol><li>Cykloheximidopløsningen (100 mg/mL) fremstilles i DMSO o...

<ol>
	<li>G&#246;tz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+neurogenesis.">The cell biology of neurogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).</li><li>Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+specification+of+neural+fates+by+transcription+factor+codes.">Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes.</a> Development. 134, 3771-3780 (2007).</li><li>Fiddes, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-Specific+NOTCH2NL+Genes+Affect+Notch+Signaling+and+Cortical+Neurogenesis.">Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis.</a> Cell. 173, 1356-1369 (2018).</li><li>Lennox, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+DDX3X+mutations+impair+RNA+metabolism+and+neurogenesis+during+fetal+cortical+development.">Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development.</a> Neuron. 106, 404-420 (2020).</li><li>Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+control+of+neurogenesis:+A+view+from+the+mammalian+cerebral+cortex.">Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359 (2012).</li><li>Amadei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Smaug2-based+translational+repression+complex+determines+the+balance+between+precursor+maintenance+versus+differentiation+during+mammalian+neurogenesis.">A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis.</a> Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).</li><li>Yang, G., Smibert, C. A., Kaplan, D. R., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+eIF4E1/4E-T+complex+determines+the+genesis+of+neurons+from+precursors+by+translationally+repressing+a+proneurogenic+transcription+program.">An eIF4E1/4E-T complex determines the genesis of neurons from precursors by translationally repressing a proneurogenic transcription program.</a> Neuron. 84, 723-739 (2014).</li><li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Glo1-Methylglyoxal+pathway+that+is+perturbed+in+maternal+diabetes+regulates+embryonic+and+adult+neural+stem+cell+pools+in+murine+offspring.">A Glo1-Methylglyoxal pathway that is perturbed in maternal diabetes regulates embryonic and adult neural stem cell pools in murine offspring.</a> Cell Reports. 17, 1022-1036 (2016).</li><li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+defined+neocortical+translation+and+polysome+assembly+are+determined+by+the+RNA-binding+protein+Hu+antigen+R.">Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).</li><li>Rodrigues, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylglyoxal+couples+metabolic+and+translational+control+of+Notch+signalling+in+mammalian+neural+stem+cells.">Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells.</a> Nature Communications. 11, 2018 (2020).</li><li>Iwasaki, S., Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+toolbox+for+protein+synthesis+studies.">The growing toolbox for protein synthesis studies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).</li><li>Chekulaeva, M., Landthaler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+on+translation.">Eyes on translation.</a> Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).</li><li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Selective+mRNA+Translation+in+Mammalian+Cells+by+Polysome+Profiling.">Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e52295 (2014).</li><li>Chass&#233;, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+using+polysome+profiling.">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45, 15 (2017).</li><li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin.">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).</li><li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamic+WNT3+secretion+spatiotemporally+regulates+the+neocortical+ribosome+signature+and+mRNA+translation+to+specify+neocortical+cell+subtypes.">Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes.</a> Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e51455 (2014).</li></ol>

Polysome profilering er en almindeligt anvendt og kraftfuld teknik til at vurdere oversættelsesstatus på både enkelt gen og genom-dækkende niveauer14 . I denne rapport præsenterer vi en protokol med polysome profilering ved hjælp af en hjemmemonteret platform og dens anvendelse til at analysere den udviklende musebark. Denne omkostningseffektive platform er nem at samle og generere robuste, reproducerbare saccharosegradienter og polysomprofilering med høj følsomhed.
<p class="jove_cont...

Under udviklingen af pattedyrshjernen formerer neurale stamceller sig og differentierer sig for at generere neuroner og glia1,2 . Forstyrrelsen af denne proces kan føre til ændringer i hjernens struktur og funktion, som det ses i mange neuroudviklingsforstyrrelser3,4. Den korrekte opførsel af neurale stamceller kræver orkestreret udtryk for specifikke gener5. Mens den epigenetiske og transskriptionelle kontrol af disse gener er blevet intensivt undersøgt, tyder nylige resultater på, at genregulering på andre niveauer også bidrager til koordinering af neural stamcellespredning og differentiering6,7,8,9,10. Således vil løse translationelle kontrolprogrammer i høj grad fremme vores forståelse af de mekanismer, der ligger til grund neurale stamcelle skæbne beslutning og hjernens udvikling.
Tre hovedteknikker med forskellige styrker er blevet anvendt bredt til at vurdere mRNA's translationelle status, herunder ribosome profilering, oversættelse af ribosome affinitetsrensning (TRAP) og polysome profilering. Ribosome-profilering bruger RNA-sekventering til at bestemme ribosome-beskyttede mRNA-fragmenter, hvilket gør det muligt for den globale analyse af antallet og placeringen af oversættelse af ribosomer på hver udskrift indirekte at udlede oversættelseshastigheden ved at sammenligne den med udskriftstæthed11. TRAP udnytter epitop-mærkede ribosomale proteiner til at fange ribosome-bundetmRNA'er 12. I betragtning af at de mærkede ribosomale proteiner kan udtrykkes i specifikke celletyper ved hjælp af genetiske tilgange, tillader TRAP analyse af oversættelse på en celletypespecifik måde. Til sammenligning giver polysome profilering, der bruger gradientfraktionering af saccharosetæthed til at adskille fri og dårligt oversat portion (lettere monosomer) fra dem, der aktivt oversættes af ribosomer (tungere polysomer), en direkte måling af ribosomtæthed på mRNA13. En fordel denne teknik tilbyder, er dens alsidighed til at studere oversættelsen af specifikke mRNA af interesse samt genom-dækkende translatome analyse14.
I dette papir beskriver vi en detaljeret protokol med polysome profilering for at analysere den udviklende muse cerebral cortex. Vi bruger et hjemmemonteret system til at forberede saccharosetæthedsgradienter og indsamle fraktioner til downstream-applikationer. Den protokol, der præsenteres her, kan let tilpasses til at analysere andre typer væv og organismer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL RNA free microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Greiner-Bio</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M MgCl2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21-23G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M KCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt end needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB2530/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>115-39-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 mouse</td>
			<td></td>
			<td>Charles River Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tip forceps</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#Z168785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td></td>
			<td>Sigma</td>
			<td>66-81-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition software TracerDAQ</td>
			<td>Measurement Computing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital converter</td>
			<td></td>
			<td>Measurement Computing</td>
			<td>USB-1208LS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA miniprep kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>R2070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>12-03-3483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No.5 forceps</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Model 2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-513-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear stage actuator</td>
			<td>Rattmmotor</td>
			<td>CBX1605-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase control RNA</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L4561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima first strand cDNA synthesis kit</td>
			<td>Themo Fisher</td>
			<td>M1681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature V-clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VH1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MSB7515/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series optical post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MS2R/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series pedestal post holder base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MBA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;12.7 mm aluminum post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TRA150/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa SYBR green fastmix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>CA101414-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>58-58-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RA90/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle &#216;1/2&#34; to &#216;6 mm post clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RA90TR/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase AWAY</td>
			<td>Molecular BioProducts</td>
			<td>7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free tips</td>
			<td>Frogga Bio</td>
			<td>FT10, FT200, FT1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free water</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>809-115-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim right-angle bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AB90B/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small V-clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VC1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>302-95-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper motor driver</td>
			<td>SongHe</td>
			<td>TB6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>57501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube piercer</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>BR-184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td></td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>L8-70M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO project super starter kit</td>
			<td>Elegoo</td>
			<td>EL-KIT-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV monitor</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>EM-1 Econo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VB01A/M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of translation in the developing mouse brain using polysome profiling

Den korrekte udvikling af pattedyrshjernen er afhængig af en fin balance mellem spredning af neurale stamceller og differentiering i forskellige neurale celletyper. Denne balance styres tæt af genekspression, der finjusteres på flere niveauer, herunder transskribering, posttransskription og oversættelse. I denne henseende fremhæver en voksende mængde beviser en kritisk rolle translationel regulering i koordineringen af neurale stamcelle skæbne beslutninger. Polysomefraktion er et effektivt værktøj til vurdering af mRNA-oversættelsesstatus på både globalt og individuelt genniveau. Her præsenterer vi en intern polysome profileringspipeline for at vurdere translationel effektivitet i celler fra den udviklende muse cerebral cortex. Vi beskriver protokollerne for saccharosegradientpræparat, væv lysis, ultracentrifugering og fraktioneringsbaseret analyse af mRNA-oversættelsesstatus.

Som en demonstration blev det kortikale lysat, der indeholder 75 μg RNA (samlet fra 8 embryoner), adskilt af saccharosegradienten i 12 fraktioner. Toppe af UV-absorbans ved 254 nm identificerede fraktioner, der indeholder 40S-underenheden, 60S-underenheden, 80S monosom og polysomer (Figur 4A). Analyse af fraktioner efter vestlig skamplet for den store ribosomale underenhed, Rpl10 viste sin tilstedeværelse i 60S underenheden (brøk 3), monosom (brøk 4) og polysomer (fraktioner 5-12) (<stro...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling at JoVE.com

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

Udviklingen af pattedyrshjernen kræver ordentlig kontrol af genekspression på oversættelsesniveau. Her beskriver vi et polysome profileringssystem med en platform, der er nem at samle saccharosegradientfremstilling og fraktioneringsplatform for at vurdere mRNA'ernes translationelle status i den udviklende hjerne.

Analyse af oversættelse i den udviklende musehjerne ved hjælp af polysom profilering

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

Translationel regulering spiller en vigtig rolle i hjernens udvikling. Polysome profilering er et nyttigt og kraftfuldt værktøj til at vurdere mRNA's translationelle status, hvilket gør det muligt at undersøge translationelle kontrolfunktioner under hjernens udvikling. Denne metode er en nem og billig tilgang til fremstilling af saccharosegradienter og vurdering af polysomfraktionering.I denne protokol bruges den til at analysere den udviklende musebark. Det kan dog let tilpasses til at studere andre systemer. Begynd med at fortynde 2,2 molar saccharose til at forberede seks 10 til 50% saccharosegradienter.Fyld en 30 milliliter sprøjte med ca. 16 milliliter 10% saccharose, læg den på sprøjtepumpen og tilslut den til nålen. Sørg for, at der ikke er luftbobler i sprøjten, slangen eller nålen, og tør nålespidsen af for at fjerne eventuelle resterende opløsninger. Flyt den motoriserede fase op, så spidsen af nålen rører midten af røret i bunden.Sæt sprøjtepumpen til en strømningshastighed på to milliliter i minuttet for et volumen på 2,3 milliliter. Efter at have udleveret 2,3 milliliter 10% saccharoseopløsning skal du gå ned ad motoriseret fase og gentage processen for alle seks stigninger. Derefter tilsættes 20% saccharoseopløsning til bunden af rørene efterfulgt af 30, 40 og 50%Collect CD1 musefostre på embryonal dag 12 og læg dem i en 10 centimeter plade indeholdende iskold HBSS på is.Under dissektionsomfanget overføres et foster til en seks centimeter plade, der indeholder iskold HBSS. Brug 21 til 23 gauge nåle til at fastsætte placeringen af hovedet ved at trænge gennem øjnene i en 45 graders vinkel og anvende en kraft for at sikre nåle er fastgjort på pladen. Brug nummer fem pincet til at fjerne hud og kranium arbejder fra midten til siderne, derefter skære olfaktoriske pærer og fjerne meninges at udsætte kortikale væv.Brug buede pincet til at skære kortikale væv i to til tre milliliter neurobasal medium på is. Træk væv fra forskellige embryoner efter behov. Væv fra otte til 10 embryoner giver normalt ca. 200 mikrogram totalt RNA.Cykloheximid til neurobasalmediet tilsættes med dissekerede væv til en endelig koncentration på 100 mikrogram pr. milliliter og inkuberes ved 37 grader Celsius i 10 minutter. Centrifuge vævet ved 500 x g i fem minutter ved fire grader Celsius og kassér supernatanten. Vask vævene to gange med iskold PBS suppleret med 100 mikrogram pr. milliliter cykloheximid.Tilsæt 500 mikroliter celle lysis buffer suppleret med fire mikroliter af RNase hæmmer og pipette op og ned for at genbruge vævet. Brug en insulinnål til forsigtigt at lyse vævet. Derefter inkuberes på is i 10 minutter med kort hvirvelstrømning hvert andet til tre minutter.Efter inkubationen centrifugeres lysatet ved 2000 x g i fem minutter ved fire grader Celsius og overfører supernatanten til et nyt centrifugerør på is. Gentag denne proces endnu en gang centrifuging på 13.000 x g. Efter at supernatanten er overført til et nyt centrifugerør på is, måles RNA-koncentrationen i vævslysatet ved hjælp af et UV-Vis-spektrofotometer.Prøverne læsses oven på saccharosegradienterne ved langsomt at dispensere lysatet til ultracentrifugerørenes vægge. Forsigtigt placere saccharose gradienter i spande og ultracentrifuge prøverne på 190.000 x g og fire grader Celsius i 90 minutter. Placer et tomt ultracentrifugerør på rørborehulen, og træd forsigtigt ind i røret med nålen fra bunden.Fyld en 30 milliliter sprøjte med 25 milliliter 60% saccharose chase opløsning. Tryk derefter forsigtigt på sprøjten, så chase-opløsningen fylder det tomme rør og går gennem UV-skærmen på 254 nanometer for at indstille baseline til detektion. Tryk på auto nul på UV-skærmen for at registrere en baseline til registrering, og tryk derefter på Afspil på softwaren for at begynde at optage.Når systemet har etableret en baseline, skal du sætte optagelsen på softwaren på pause og trække chase-løsningen tilbage og sørge for, at der ikke forbliver nogen rest chase-løsning i systemet. Læg et prøverør på rørboremaskinen, og træd forsigtigt ind i røret med nålen fra bunden. Begynd at optage på softwaren, sørg for, at der ikke er luftbobler i linjen.Start derefter sprøjtepumpen og fraktionsopsamleren for at indsamle polysomefraktioner, og sæt fraktioneringsmaskinen til 30 sekunder. Opsamles fraktioner i 1,5 milliliter rør. Det kortikale lysat indeholdende RNA trukket fra otte embryoner blev adskilt af en saccharosegradient i 12 fraktioner.Toppe af UV-absorbans ved 254 nanometer identificerede fraktioner, der indeholder 40S-underenheden 60S-underenheden og 80S monosom og polysomer. Analyse af fraktioner af vestlige blot for de store ribosomale underenhed Rpl10 viste sin tilstedeværelse i 60S subunit monosomer og polysomer. I modsætning hertil var cytoplasmiske proteiner, Gapdh og Csde1, ikke forbundet med ribosomer, men blev beriget med fraktioner, der indeholder gratis RNA.I overensstemmelse med adskillelsen af proteiner i forskellige fraktioner blev Gapdh og sox2 mRNA'er højt beriget i de fraktioner, der indeholder tunge polysomer, hvilket tyder på, at disse mRNA'er effektivt oversættes i den udviklende cortex. I modsætning hertil blev rpl7 og rpl35 mRNA'er beriget i fraktionen indeholdende monosomer, hvilket tyder på undertrykt oversættelse. For at opnå reproducerbare resultater er det vigtigt at opretholde konsistens i fremstillingen af saccharosegradienter.Sprøjtepumperne skal bruges til at skubbe saccharoseen ud. Under fraktionering og prøveopsamling er det vigtigt at vaske systemet med RNase-frit vand. Dette reducerer eventuel rest saccharose fra den foregående prøve.Denne metode kan bruges til at vurdere mRNA'ernes translationelle status i forskellige væv. Ved hjælp af platformen kan der opnås ensartede gradienter til polysomeprofilering, hvilket giver en billig løsning til denne klassiske og nyttige teknik.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Enkelt-celle Profilering af at udvikle og Ældre retinaneuroner

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisering og genetisk manipulering af dendritter og udløberne i mus cerebrale cortex og hippocampus under anvendelse<em&gt; I utero</em&gt; Elektroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Vurdering af cellecyklusprogression af neurale stam-og stamcelle i Mouse hjernens udvikling efter Genotoksisk Stress

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Live-Imaging mitosens i udviklingslandene mus embryonale Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imaging Serotonerge Fibers i Mouse Spinal Cord Brug af CLARITY / CUBIC Teknik

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modellering Zika Virus infektion i udviklingslandene menneskelige hjerne In Vitro ved hjælp af stamceller afledt Cerebral Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

Kvantificere den heterogen fordeling af en Synaptic Protein i mus hjernen bruger immunfluorescens

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Kronisk Implantation af hele-kortikale Electrocorticographic Array i den fælles silkeabe

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...