Name: analysis of translation in the developing mouse brain using polysome profiling
Uploaded: 2021-05-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling at JoVE.com

Dit werk werd gefinancierd door een NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018 to G.Y.). G.Y. is een Canada Research Chair. S.K. werd gefinancierd door Mitacs Globalink Graduate Fellowship en ACHRI Graduate Student Scholarship.

Al het diergebruik werd gecontroleerd door de Animal Care Committee van de Universiteit van Calgary. CD1-muizen die voor het experiment werden gebruikt, werden gekocht bij de commerciële leverancier.
1. Voorbereiding van oplossingen
OPMERKING Om RNA-afbraak te voorkomen, moet u de werkbank en alle apparatuur met RNase-ontsmettingsoplossing spuiten. Voor het experiment worden RNase-vrije tips gebruikt. Alle oplossingen worden bereid in RNase-vrij water.
<ol><li>Be...

<ol>
	<li>G&#246;tz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+neurogenesis.">The cell biology of neurogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).</li><li>Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+specification+of+neural+fates+by+transcription+factor+codes.">Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes.</a> Development. 134, 3771-3780 (2007).</li><li>Fiddes, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-Specific+NOTCH2NL+Genes+Affect+Notch+Signaling+and+Cortical+Neurogenesis.">Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis.</a> Cell. 173, 1356-1369 (2018).</li><li>Lennox, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+DDX3X+mutations+impair+RNA+metabolism+and+neurogenesis+during+fetal+cortical+development.">Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development.</a> Neuron. 106, 404-420 (2020).</li><li>Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+control+of+neurogenesis:+A+view+from+the+mammalian+cerebral+cortex.">Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359 (2012).</li><li>Amadei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Smaug2-based+translational+repression+complex+determines+the+balance+between+precursor+maintenance+versus+differentiation+during+mammalian+neurogenesis.">A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis.</a> Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).</li><li>Yang, G., Smibert, C. A., Kaplan, D. R., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+eIF4E1/4E-T+complex+determines+the+genesis+of+neurons+from+precursors+by+translationally+repressing+a+proneurogenic+transcription+program.">An eIF4E1/4E-T complex determines the genesis of neurons from precursors by translationally repressing a proneurogenic transcription program.</a> Neuron. 84, 723-739 (2014).</li><li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Glo1-Methylglyoxal+pathway+that+is+perturbed+in+maternal+diabetes+regulates+embryonic+and+adult+neural+stem+cell+pools+in+murine+offspring.">A Glo1-Methylglyoxal pathway that is perturbed in maternal diabetes regulates embryonic and adult neural stem cell pools in murine offspring.</a> Cell Reports. 17, 1022-1036 (2016).</li><li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+defined+neocortical+translation+and+polysome+assembly+are+determined+by+the+RNA-binding+protein+Hu+antigen+R.">Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).</li><li>Rodrigues, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylglyoxal+couples+metabolic+and+translational+control+of+Notch+signalling+in+mammalian+neural+stem+cells.">Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells.</a> Nature Communications. 11, 2018 (2020).</li><li>Iwasaki, S., Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+toolbox+for+protein+synthesis+studies.">The growing toolbox for protein synthesis studies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).</li><li>Chekulaeva, M., Landthaler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+on+translation.">Eyes on translation.</a> Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).</li><li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Selective+mRNA+Translation+in+Mammalian+Cells+by+Polysome+Profiling.">Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e52295 (2014).</li><li>Chass&#233;, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+using+polysome+profiling.">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45, 15 (2017).</li><li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin.">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).</li><li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamic+WNT3+secretion+spatiotemporally+regulates+the+neocortical+ribosome+signature+and+mRNA+translation+to+specify+neocortical+cell+subtypes.">Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes.</a> Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e51455 (2014).</li></ol>

Polysomale profilering is een veelgebruikte en krachtige techniek om de translationele status te beoordelen op zowel single gene als genoombrede niveaus14 . In dit rapport presenteren we een protocol van polysomenprofilering met behulp van een thuisgeassembleerd platform en de toepassing ervan om de zich ontwikkelende muisschors te analyseren. Dit kosteneffectieve platform is eenvoudig te monteren en genereert robuuste, reproduceerbare sacharosegradiënten en polysoomprofilering met hoge gevoeligh...

Tijdens de ontwikkeling van de hersenen van zoogdieren verspreiden neurale stamcellen zich en differentiëren ze om neuronen en glia1,2 te genereren. De verstoring van dit proces kan leiden tot veranderingen in de hersenstructuur en -functie, zoals te zien is bij veel neuroontwikkelingsstoornissen3,4. Het juiste gedrag van neurale stamcellen vereist de georkestreerde expressie van specifieke genen5. Hoewel de epigenetische en transcriptiecontrole van deze genen intensief is bestudeerd, suggereren recente bevindingen dat genregulatie op andere niveaus ook bijdraagt aan de coördinatie van neurale stamcelproliferatie en differentiatie6,7,8,9,10. Het aanpakken van de translationele controleprogramma's zal dus ons begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de beslissing over het lot van neurale stamcellen en de ontwikkeling van de hersenen aanzienlijk bevorderen.
Drie hoofdtechnieken met verschillende sterktes zijn op grote schaal toegepast om de translationele status van mRNA te beoordelen, waaronder ribosoomprofilering, het vertalen van ribosoomaffiniteitszuivering (TRAP) en polysoomprofilering. Ribosoomprofilering maakt gebruik van RNA-sequencing om ribosoombeveiligde mRNA-fragmenten te bepalen, waardoor de globale analyse van het aantal en de locatie van het vertalen van ribosomen op elk transcript indirect de vertaalsnelheid kan afleiden door het te vergelijken met transcriptie overvloed11. TRAP maakt gebruik van epitoop-gelabelde ribosomale eiwitten om ribosoomgebonden mRNAs te vangen12. Aangezien de gelabelde ribosomale eiwitten kunnen worden uitgedrukt in specifieke celtypen met behulp van genetische benaderingen, maakt TRAP de analyse van vertaling op een celtypespecifieke manier mogelijk. Ter vergelijking, polysoomprofilering, waarbij sucrosedichtheidsgradiëntfractie wordt gebruikt om vrije en slecht vertaalde porties (lichtere monosomen) te scheiden van die welke actief worden vertaald door ribosomen (zwaardere polysomen), biedt een directe meting van de ribosoomdichtheid op mRNA13. Een voordeel van deze techniek is de veelzijdigheid om de vertaling van specifiek mRNA van belang te bestuderen, evenals genoombrede vertaalanalyse14.
In dit artikel beschrijven we een gedetailleerd protocol van polysomale profilering om de zich ontwikkelende hersenschors van muizen te analyseren. We gebruiken een zelfgeassembleerd systeem om sucrosedichtheidsgradiënten voor te bereiden en fracties te verzamelen voor downstreamtoepassingen. Het hier gepresenteerde protocol kan eenvoudig worden aangepast om andere soorten weefsels en organismen te analyseren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL RNA free microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Greiner-Bio</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M MgCl2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21-23G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M KCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt end needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB2530/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>115-39-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 mouse</td>
			<td></td>
			<td>Charles River Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tip forceps</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#Z168785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td></td>
			<td>Sigma</td>
			<td>66-81-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition software TracerDAQ</td>
			<td>Measurement Computing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital converter</td>
			<td></td>
			<td>Measurement Computing</td>
			<td>USB-1208LS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA miniprep kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>R2070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>12-03-3483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No.5 forceps</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Model 2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-513-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear stage actuator</td>
			<td>Rattmmotor</td>
			<td>CBX1605-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase control RNA</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L4561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima first strand cDNA synthesis kit</td>
			<td>Themo Fisher</td>
			<td>M1681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature V-clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VH1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MSB7515/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series optical post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MS2R/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series pedestal post holder base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MBA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;12.7 mm aluminum post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TRA150/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa SYBR green fastmix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>CA101414-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>58-58-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RA90/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle &#216;1/2&#34; to &#216;6 mm post clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RA90TR/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase AWAY</td>
			<td>Molecular BioProducts</td>
			<td>7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free tips</td>
			<td>Frogga Bio</td>
			<td>FT10, FT200, FT1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free water</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>809-115-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim right-angle bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AB90B/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small V-clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VC1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>302-95-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper motor driver</td>
			<td>SongHe</td>
			<td>TB6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>57501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube piercer</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>BR-184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td></td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>L8-70M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO project super starter kit</td>
			<td>Elegoo</td>
			<td>EL-KIT-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV monitor</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>EM-1 Econo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VB01A/M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of translation in the developing mouse brain using polysome profiling

De juiste ontwikkeling van het zoogdierbrein is afhankelijk van een fijne balans van neurale stamcelproliferatie en differentiatie in verschillende neurale celtypen. Deze balans wordt strak gecontroleerd door genexpressie die op meerdere niveaus is verfijnd, waaronder transcriptie, posttranscriptie en vertaling. In dit opzicht benadrukt een groeiende hoeveelheid bewijs een cruciale rol van translationele regulatie bij het coördineren van beslissingen over het lot van neurale stamcellen. Polysoomfractie is een krachtig hulpmiddel voor de beoordeling van de mRNA-translationele status op zowel globaal als individueel genniveau. Hier presenteren we een interne polysomale profileringspijplijn om de translationele efficiëntie in cellen van de zich ontwikkelende hersenschors van muizen te beoordelen. We beschrijven de protocollen voor sucrose gradiëntvoorbereiding, weefsellysis, ultracentrifugatie en fractioneringsgebaseerde analyse van de mRNA-translationele status.

Als demonstratie werd het corticale lysaat met 75 μg RNA (gepoold uit 8 embryo's) gescheiden door de sacharosegradiënt in 12 fracties. Pieken van UV-absorptie bij 254 nm geïdentificeerde fracties die de 40S-subeenheid, 60S-subeenheid, 80S-monosomen en polysomen bevatten (figuur 4A). Analyse van breuken door westelijke vlek voor de grote ribosomale subeenheid, Rpl10 toonde zijn aanwezigheid in de 60S subeenheid (breuk 3), monosomen (breuk 4) en polysomen (fracties 5-12) (<strong class="xfi...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling at JoVE.com

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

De ontwikkeling van het zoogdierbrein vereist een goede controle van genexpressie op het niveau van vertaling. Hier beschrijven we een polysoomprofileringssysteem met een eenvoudig te assembleren sucrose gradiëntvormings- en fractioneringsplatform om de translationele status van mRNAs in de zich ontwikkelende hersenen te beoordelen.

Analyse van vertaling in de zich ontwikkelende muishersenen met behulp van polysoomprofilering

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

Translationele regulatie speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van de hersenen. Polysomale profilering biedt een nuttig en krachtig hulpmiddel om de translationele status van mRNA te beoordelen, waardoor het mogelijk is om translationele controlefuncties tijdens de hersenontwikkeling te onderzoeken. Deze methode is een eenvoudige en goedkope aanpak om sucrosegradiënten te maken en polysoomfractie te beoordelen.In dit protocol wordt het gebruikt om de zich ontwikkelende muisschors te analyseren. Het kan echter gemakkelijk worden aangepast om andere systemen te bestuderen. Begin met het verdunnen van 2,2 molaire sucrose om zes 10 tot 50% sacharosegradiënten voor te bereiden.Vul een spuit van 30 milliliter met ongeveer 16 milliliter 10% sacharose, plaats deze op de spuitpomp en sluit deze aan op de naald. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de spuit, slang of naald zitten en veeg de punt van de naald af om eventuele restoplossing te verwijderen. Beweeg het gemotoriseerde stadium zodanig omhoog dat de punt van de naald het midden van de buis aan de onderkant raakt.Stel de spuitpomp in op een debiet van twee milliliter per minuut voor een volume van 2,3 milliliter. Na het doseren van 2,3 milliliter 10% sacharoseoplossing, gaat u door het gemotoriseerde stadium en herhaalt u het proces voor alle zes gradiënten. Voeg vervolgens 20% sacharose-oplossing toe aan de bodem van de buizen, gevolgd door 30, 40 en 50%Verzamel CD1-muisembryo's op embryonale dag 12 en plaats ze in een plaat van 10 centimeter met ijskoude HBSS op ijs.Breng onder de dissectie scope één embryo over op een plaat van zes centimeter met ijskoude HBSS. Gebruik naalden van 21 tot 23 gauge om de positie van het hoofd te bevestigen door onder een hoek van 45 graden door de ogen te penetreren en een kracht uit te brengen om ervoor te zorgen dat de naalden op de plaat zijn bevestigd. Gebruik nummer vijf tangen om de huid en schedel te verwijderen die van het midden naar de zijkanten werken, snijd vervolgens de olfactorische bollen en verwijder de hersenvliezen om de corticale weefsels bloot te leggen.Gebruik gebogen tang om de corticale weefsels in twee tot drie milliliter neurobasaal medium op ijs te snijden. Trek de weefsels uit verschillende embryo's als dat nodig is. Weefsels van acht tot 10 embryo's geven meestal ongeveer 200 microgram totaal RNA.Voeg cycloheximide toe aan het neurobasale medium met de ontlede weefsels tot een eindconcentratie van 100 microgram per milliliter en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 graden Celsius. Centrifugeer het weefsel gedurende vijf minuten op 500 x g bij vier graden Celsius en gooi het supernatant weg. Was de weefsels tweemaal met ijskoud PBS aangevuld met 100 microgram per milliliter cycloheximide.Voeg 500 microliters cellysisbuffer toe, aangevuld met vier microliters RNase-remmer en pipet op en neer om het weefsel te resuspenden. Gebruik een insulinenaald om het weefsel voorzichtig te lyseren. Incubeer vervolgens 10 minuten op ijs met korte vortexing om de twee tot drie minuten.Centrifugeer na de incubatie het lysaat bij 2000 x g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius en breng het supernatant over in een nieuwe centrifugebuis op ijs. Herhaal dit proces nogmaals met centrifugeren op 13,000 x g. Na het overbrengen van het supernatant naar een nieuwe centrifugebuis op ijs, meet u de RNA-concentratie in het weefsellysaat met behulp van een UV-Vis spectrofotometer.Plaats de monsters bovenop de sacharosegradiënten door het lysaat langzaam aan de wanden van de ultracentrifugebuizen te doseren. Plaats de sacharosegradiënten voorzichtig in de emmers en ultracentrifugeer de monsters gedurende 90 minuten op 190, 000 x g en vier graden Celsius. Plaats een lege ultracentrifugebuis op de buispiercing en penetreer voorzichtig de buis met de naald van de bodem.Vul een spuit van 30 milliliter met 25 milliliter 60% sucrose chase oplossing. Druk vervolgens voorzichtig op de spuit zodat de chase-oplossing de lege buis vult en door de 254 nanometer UV-monitor gaat om de basislijn voor detectie in te stellen. Druk op auto zero op de UV-monitor om een basislijn voor detectie te registreren en druk vervolgens op Afspelen op de software om te beginnen met opnemen.Zodra het systeem een basislijn heeft vastgesteld, pauzeert u de opname van de software en trekt u de chase-oplossing in, zodat er geen restachtervolgingsoplossing in het systeem achter blijft. Plaats één monsterbuis op de buispiercing en penetreer voorzichtig de buis met de naald van de bodem. Begin met opnemen op de software, zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de lijn zitten.Start vervolgens de spuitpomp en de fractiecollector om polysomale fracties te verzamelen en stel de fractionator in op 30 seconden. Verzamel de fracties in buizen van 1,5 milliliter. Het corticale lysaat dat RNA bevat dat uit acht embryo's wordt getrokken, werd gescheiden door een sacharosegradiënt in 12 fracties.Pieken van UV-absorptie bij 254 nanometer geïdentificeerde fracties die de 40S subunit 60S subunit en 80S monosomen en polysomen bevatten. Analyse van de fracties door westerse vlek voor de grote ribosomale subeenheid Rpl10 toonde zijn aanwezigheid in de 60S subeenheid monosomen en polysomen. Cytoplasmatische eiwitten, Gapdh en Csde1 daarentegen, werden niet geassocieerd met ribosomen, maar werden verrijkt in fracties die vrij RNA bevatten.In overeenstemming met de scheiding van eiwitten in verschillende fracties, werden Gapdh en sox2 mRNAs sterk verrijkt in de fracties die zware polysomen bevatten, wat suggereert dat deze mRNAs efficiënt worden vertaald in de zich ontwikkelende cortex. Daarentegen werden rpl7 en rpl35 mRNAs verrijkt in de fractie die monosomen bevatte, wat een onderdrukte vertaling suggereert. Om reproduceerbare resultaten te verkrijgen, is het belangrijk om consistentie te behouden bij het maken van sacharosegradiënten.De spuitpompen moeten worden gebruikt om de sacharose uit te werpen. Tijdens fractionering en monsterverzameling is het belangrijk om het systeem te wassen met RNase-vrij water. Dit vermindert eventuele resterende sacharose die overblijft van het vorige monster.Deze methode kan worden gebruikt om de translationele status van mRNAs in verschillende weefsels te beoordelen. Met behulp van het platform kunnen consistente gradiënten voor polysomale profilering worden verkregen, wat een goedkope oplossing biedt voor deze klassieke en nuttige techniek.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

Mozaïek Analyse van Gene Functie in Postnatale Mouse ontwikkeling van de hersenen met behulp van Virus-based Cre recombinatie

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Elektroporatie van de ontwikkelingslanden Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Single-cell Profilering van het ontwikkelen en Jong netvlies Neuronen

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisatie en genetische manipulatie van dendrieten en stekels in de muis Cerebral cortex en de hippocampus met behulp van<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporatie

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Het beoordelen van de celcyclus van neurale stamcellen en stamcellen in de Mouse ontwikkeling van de hersenen na genotoxische stress

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Live-Imaging van mitose in het ontwikkelen van muis embryonale Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Beeldvorming Serotonerge vezels in de muis Spinal Cord Met behulp van de DUIDELIJKHEID / CUBIC Techniek

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Zika Virus infectie van de ontwikkelende hersenen In Vitro met behulp van stamcel modellering afgeleid cerebrale Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

Kwantificeren van de heterogene verdeling van een Synaptic proteïne in de hersenen van de muis met immunofluorescentie

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Chronische implantatie van geheel-corticale Electrocorticographic Array in de gemeenschappelijke Hapalomys

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...