Name: analysis of translation in the developing mouse brain using polysome profiling
Uploaded: 2021-05-22T14:00:00
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Ces travaux ont été financés par une subvention découverte du CSERN (RGPIN/04246-2018 à G.Y.). G.Y. est chaire de recherche du Canada. S.K. a été financé par mitacs Globalink Graduate Fellowship et ACHRI Graduate Student Scholarship.

Toute l’utilisation des animaux a été supervisée par le Comité de protection des animaux de l’Université de Calgary. Les souris CD1 utilisées pour l’expérience ont été achetées auprès d’un fournisseur commercial.
1. Préparation de solutions
REMARQUE Pour prévenir la dégradation de l’ARN, vaporisez l’établi et tout l’équipement avec la solution de décontamination RNase. Les conseils sans RNase sont utilisés pour l’expérience. Toutes l...

<ol>
	<li>G&#246;tz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+neurogenesis.">The cell biology of neurogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).</li><li>Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+specification+of+neural+fates+by+transcription+factor+codes.">Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes.</a> Development. 134, 3771-3780 (2007).</li><li>Fiddes, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-Specific+NOTCH2NL+Genes+Affect+Notch+Signaling+and+Cortical+Neurogenesis.">Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis.</a> Cell. 173, 1356-1369 (2018).</li><li>Lennox, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+DDX3X+mutations+impair+RNA+metabolism+and+neurogenesis+during+fetal+cortical+development.">Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development.</a> Neuron. 106, 404-420 (2020).</li><li>Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+control+of+neurogenesis:+A+view+from+the+mammalian+cerebral+cortex.">Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359 (2012).</li><li>Amadei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Smaug2-based+translational+repression+complex+determines+the+balance+between+precursor+maintenance+versus+differentiation+during+mammalian+neurogenesis.">A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis.</a> Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).</li><li>Yang, G., Smibert, C. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+defined+neocortical+translation+and+polysome+assembly+are+determined+by+the+RNA-binding+protein+Hu+antigen+R.">Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).</li><li>Rodrigues, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylglyoxal+couples+metabolic+and+translational+control+of+Notch+signalling+in+mammalian+neural+stem+cells.">Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells.</a> Nature Communications. 11, 2018 (2020).</li><li>Iwasaki, S., Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+toolbox+for+protein+synthesis+studies.">The growing toolbox for protein synthesis studies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).</li><li>Chekulaeva, M., Landthaler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+on+translation.">Eyes on translation.</a> Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).</li><li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Selective+mRNA+Translation+in+Mammalian+Cells+by+Polysome+Profiling.">Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e52295 (2014).</li><li>Chass&#233;, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+using+polysome+profiling.">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45, 15 (2017).</li><li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin.">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).</li><li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamic+WNT3+secretion+spatiotemporally+regulates+the+neocortical+ribosome+signature+and+mRNA+translation+to+specify+neocortical+cell+subtypes.">Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes.</a> Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e51455 (2014).</li></ol>

Le profilage polysome est une technique couramment utilisée et puissante pour évaluer l’état translationnel à la fois au niveau d’un seul gène et à l’échelle dugénome 14 . Dans ce rapport, nous présentons un protocole de profilage polysome à l’aide d’une plate-forme assemblée à domicile et son application pour analyser le cortex de souris en développement. Cette plate-forme rentable est facile à assembler et à générer des gradients de saccharose robustes et reproductible...

Pendant le développement du cerveau des mammifères, les cellules souches neurales prolifèrent et se différencient pour générer des neurones et desgliales 1,2 . La perturbation de ce processus peut mener aux changements dans la structure et la fonction de cerveau, comme vu dans beaucoup de désordres neurodevelopmental3,4. Le bon comportement des cellules souches neurales nécessite l’expression orchestrée de gènes spécifiques5. Tandis que le contrôle épigénétique et transcriptionnel de ces gènes a été intensivement étudié, les résultats récents suggèrent que la régulation de gène à d’autres niveaux contribue également à la coordination de la prolifération et de la différenciation neuralesde cellules souches 6,7,8,9,10. Ainsi, la résolution des programmes de contrôle translationnel fera grandement progresser notre compréhension des mécanismes sous-jacents à la décision sur le sort des cellules souches neurales et au développement du cerveau.
Trois techniques principales avec des forces différentes ont été largement appliquées pour évaluer l’état translationnel de l’ARNm, y compris le profilage ribosome, la traduction de la purification de l’affinité ribosome (TRAP) et le profilage polysome. Le profilage ribosome utilise le séquençage de l’ARN pour déterminer les fragments d’ARNm protégés par le ribosome, ce qui permet à l’analyse globale du nombre et de l’emplacement des ribosomes de traduction sur chaque transcription d’inférer indirectement le taux de traduction en le comparant à l’abondance detranscription 11. TRAP tire parti des protéines ribosomiques marquées d’épitope pour capturer les ARNM ribosome-liés12. Étant donné que les protéines ribosomiques étiquetées peuvent être exprimées dans des types de cellules spécifiques à l’aide d’approches génétiques, TRAP permet l’analyse de la traduction d’une manière spécifique au type de cellule. En comparaison, le profilage polysome, qui utilise la fractionnement du gradient de densité saccharose pour séparer la partie libre et mal traduite (monosomes plus légers) de ceux qui sont activement traduits par des ribosomes (polysomes plus lourds), fournit une mesure directe de la densité ribosome surl’ARNm 13. Un avantage de cette technique est sa polyvalence pour étudier la traduction de l’ARNm spécifique d’intérêt ainsi que l’analyse du traduislatome à l’échelledu génome 14.
Dans cet article, nous décrivons un protocole détaillé de profilage polysome pour analyser le cortex cérébral de souris en développement. Nous utilisons un système assemblé à domicile pour préparer les gradients de densité du saccharose et recueillir des fractions pour les applications en aval. Le protocole présenté ici peut être facilement adapté pour analyser d’autres types de tissus et d’organismes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL RNA free microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Greiner-Bio</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M MgCl2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21-23G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M KCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt end needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB2530/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>115-39-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 mouse</td>
			<td></td>
			<td>Charles River Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tip forceps</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#Z168785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td></td>
			<td>Sigma</td>
			<td>66-81-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition software TracerDAQ</td>
			<td>Measurement Computing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital converter</td>
			<td></td>
			<td>Measurement Computing</td>
			<td>USB-1208LS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA miniprep kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>R2070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>12-03-3483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No.5 forceps</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Model 2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-513-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear stage actuator</td>
			<td>Rattmmotor</td>
			<td>CBX1605-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase control RNA</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L4561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima first strand cDNA synthesis kit</td>
			<td>Themo Fisher</td>
			<td>M1681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature V-clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VH1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MSB7515/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series optical post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MS2R/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series pedestal post holder base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MBA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;12.7 mm aluminum post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TRA150/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa SYBR green fastmix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>CA101414-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>58-58-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RA90/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle &#216;1/2&#34; to &#216;6 mm post clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RA90TR/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase AWAY</td>
			<td>Molecular BioProducts</td>
			<td>7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free tips</td>
			<td>Frogga Bio</td>
			<td>FT10, FT200, FT1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free water</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>809-115-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim right-angle bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AB90B/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small V-clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VC1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>302-95-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper motor driver</td>
			<td>SongHe</td>
			<td>TB6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>57501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube piercer</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>BR-184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td></td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>L8-70M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO project super starter kit</td>
			<td>Elegoo</td>
			<td>EL-KIT-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV monitor</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>EM-1 Econo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VB01A/M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of translation in the developing mouse brain using polysome profiling

Le bon développement du cerveau mammifère repose sur un équilibre fin de la prolifération et de la différenciation des cellules souches neurales en différents types de cellules neurales. Cet équilibre est étroitement contrôlé par l’expression des gènes qui est peaufinée à plusieurs niveaux, y compris la transcription, la post-transcription et la traduction. À cet égard, un nombre croissant de preuves mettent en évidence un rôle essentiel de la régulation translationnelle dans la coordination des décisions relatives au sort des cellules souches neurales. La fractionnement polysome est un outil puissant pour l’évaluation du statut translationnel de l’ARNm aux niveaux génétique global et individuel. Ici, nous présentons un pipeline interne de profilage polysome pour évaluer l’efficacité translationnelle dans les cellules du cortex cérébral de souris en développement. Nous décrivons les protocoles pour la préparation de gradient de saccharose, la lyse de tissu, l’ultracentrifugation et l’analyse fractionnée-basée de l’état translationnel d’ARNm.

À titre de démonstration, le lysate cortical contenant 75 ARN μg (mis en commun à partir de 8 embryons) a été séparé par le gradient de saccharose en 12 fractions. Pics d’absorption UV à 254 nm fractions identifiées contenant le sous-unité 40S, sous-unité 60S, monosome 80S et polysomes (Figure 4A). Analyse des fractions par tache occidentale pour la grande sous-unité ribosomique, Rpl10 a montré sa présence dans la sous-unité 60S (fraction 3), monosome (fraction 4) et polyso...

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Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

Le développement du cerveau mammifère nécessite un contrôle approprié de l’expression des gènes au niveau de la traduction. Ici, nous décrivons un système de profilage polysome avec une plate-forme facile à assembler de gradient de saccharose et de fractionnement pour évaluer l’état translationnel des ARNM dans le cerveau en développement.

Analyse de la traduction dans le cerveau de souris en développement à l’aide du profilage polysome

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

La régulation translationnelle joue un rôle important dans le développement du cerveau. Le profilage polysome fournit un outil utile et puissant pour évaluer l’état translationnel de l’ARNm, ce qui permet d’examiner les fonctions de contrôle translationnel pendant le développement du cerveau. Cette méthode est une approche facile et peu coûteux pour faire des gradients de saccharose et évaluer la fractionnement polysome.Dans ce protocole, il est utilisé pour analyser le cortex de la souris en développement. Cependant, il peut être facilement adapté pour étudier d’autres systèmes. Commencez par diluer 2,2 saccharose molaire pour préparer six gradients de saccharose de 10 à 50 %.Remplissez une seringue de 30 millilitres d’environ 16 millilitres de saccharose à 10 %, placez-la sur la pompe à seringues et connectez-la à l’aiguille. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la seringue, le tube ou l’aiguille, et essuyez le bout de l’aiguille pour enlever toute solution résiduelle. Déplacez le stade motorisé vers le haut de telle sorte que la pointe de l’aiguille touche le centre du tube au fond.Réglez la pompe à seringues à une vitesse d’écoulement de deux millilitres par minute pour un volume de 2,3 millilitres. Après avoir distribué 2,3 millilitres de solution de saccharose à 10 %, descendez le stade motorisé et répétez le processus pour les six gradients. Ajoutez ensuite une solution de saccharose de 20 % au fond des tubes suivie de 30, 40 et 50 % recueillez des embryons de souris CD1 au jour embryonnaire 12 et placez-les dans une plaque de 10 centimètres contenant du HBSS glacé sur la glace.Sous la portée de dissection, transférer un embryon dans une plaque de six centimètres contenant du HBSS froid comme glace. Utilisez des aiguilles de calibre 21 à 23 pour fixer la position de la tête en pénétrant à travers les yeux à un angle de 45 degrés et appliquez une force pour vous assurer que les aiguilles sont fixées sur la plaque. Utilisez le nombre cinq forceps pour enlever la peau et le crâne travaillant du milieu aux côtés, puis coupez les ampoules olfactives et enlevez les méninges pour exposer les tissus corticals.Utilisez des forceps incurvés pour couper les tissus corticals en deux à trois millilitres de milieu neurobasal sur la glace. Tirez les tissus de différents embryons au besoin. Les tissus de huit à dix embryons donnent habituellement environ 200 microgrammes d’ARN total.Ajouter le cycloheximide au milieu neurobasal avec les tissus disséqués à une concentration finale de 100 microgrammes par millilitre et incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Centrifuger le tissu à 500 x g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et jeter le supernatant. Lavez les tissus deux fois avec du PBS glacé complété par 100 microgrammes par cycloheximide millilitre.Ajouter 500 microlitres de tampon de lyse cellulaire complétés par quatre microlitres d’inhibiteur de la RNase et pipette de haut en bas pour résuspendre le tissu. Utilisez une aiguille à insuline pour lyser doucement le tissu. Puis incuber sur la glace pendant 10 minutes avec un bref vortex toutes les deux à trois minutes.Après l’incubation, centrifuger le lysate à 2000 x g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et transférer le supernatant dans un nouveau tube de centrifugeuse sur la glace. Répétez ce processus une fois de plus en centrifugant à 13 000 x g. Après avoir transféré le supernatant dans un nouveau tube de centrifugeuse sur la glace, mesurez la concentration d’ARN dans le lysate tissulaire à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis.Chargez les échantillons sur les gradients de saccharose en distribuant lentement le lysate aux parois des tubes d’ultracentrifugeuse. Placez doucement les gradients de saccharose dans les seaux et ultracentrifugez les échantillons à 190 000 x g et quatre degrés Celsius pendant 90 minutes. Placez un tube d’ultracentrifugeuse vide sur le perceur de tube et pénètrez doucement le tube avec l’aiguille du fond.Remplissez une seringue de 30 millilitres avec 25 millilitres de solution de chasse au saccharose à 60 %. Appuyez ensuite doucement sur la seringue de sorte que la solution de chasse remplit le tube vide et passe par le moniteur UV de 254 nanomètres pour définir la ligne de base pour la détection. Appuyez sur l’auto zéro sur le moniteur UV pour enregistrer une ligne de base pour la détection, puis appuyez sur Lire sur le logiciel pour commencer l’enregistrement.Une fois que le système établit une ligne de base, mettre en pause l’enregistrement sur le logiciel et rétracter la solution de poursuite, en s’assurant qu’aucune solution de poursuite résiduelle reste dans le système. Chargez un tube d’échantillon sur le perceur de tube et pénètrez doucement le tube avec l’aiguille du fond. Commencez à enregistrer sur le logiciel, assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans la ligne.Ensuite, démarrez la pompe à seringues et le collecteur de fractions pour recueillir les fractions polysome, en fixant le fractionneur à 30 secondes. Recueillir les fractions en tubes de 1,5 millilitre. Le lysate cortical contenant de l’ARN tiré de huit embryons a été séparé par un gradient de saccharose en 12 fractions.Les pics d’absorption uv à 254 nanomètres ont identifié des fractions contenant le sous-unité 40S 60S et le monosome et les polysomes 80S. L’analyse des fractions par tache occidentale pour le grand sous-unité ribosomal Rpl10 a montré sa présence dans les monosomes et les polysomes subunit 60S. En revanche, les protéines cytoplasmiques, Gapdh et Csde1, n’ont pas été associées aux ribosomes, mais ont été enrichies en fractions contenant l’ARN libre.Conformément à la séparation des protéines en différentes fractions, gapdh et sox2 mRNAs ont été fortement enrichis dans les fractions contenant des polysomes lourds, suggérant que ces ARNM sont efficacement traduits dans le cortex en développement. En revanche, les arNR rpl7 et rpl35 ont été enrichis dans la fraction contenant des monosomes, suggérant la traduction réprimée. Pour obtenir des résultats reproductibles, il est important de maintenir la cohérence dans la fabrication des gradients de saccharose.Les pompes à seringues doivent être utilisées pour éjecter le saccharose. Lors de la fractionnement et de la collecte d’échantillons, il est important de laver le système avec de l’eau sans RNase. Cela réduit tout saccharose résiduel restant de l’échantillon précédent.Cette méthode peut être utilisée pour évaluer l’état translationnel des ARNR dans divers tissus. À l’aide de la plate-forme, des gradients cohérents pour le profilage polysome peuvent être obtenus, ce qui fournit une solution peu coûteux pour cette technique classique et utile.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Analyse mosaïque de fonction des gènes dans le développement de cerveau de souris à l&#39;aide postnatale à base de virus recombinaison Cre

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Recherche

Neurosciences

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

En électroporation in vivo de la rétine de souris en développement

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Une seule cellule de profilage de développer et d&#39;âge mûr neurones de la rétine

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisation et la manipulation génétique des dendrites et des épines dans le cortex cérébral et l&#39;hippocampe de souris à l&#39;aide<em&gt; In utero</em&gt; Électroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Évaluation de la progression du cycle cellulaire des cellules souches neurales et progénitrices dans le développement du cerveau de souris après un stress génotoxique

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Imagerie en direct de la mitose dans les développement Cortex souris embryonnaires

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imagerie fibres sérotoninergiques dans la moelle épinière de souris Utilisation du CLARITY / Technique CUBIC

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modélisation d’infection par le Virus de Zika du développement cerveau humain In Vitro à l’aide de cellules souches dérivées cérébrale organoïdes

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

Quantifier la répartition hétérogène d’une protéine synaptique dans le cerveau de souris à l’aide d’Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Implantation chronique d’ensemble-corticale Electrocorticographic tableau dans l’ouistiti commun

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...