Name: analysis of translation in the developing mouse brain using polysome profiling
Uploaded: 2021-05-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch einen NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018 bis G.Y.) finanziert. G.Y. ist ein Canada Research Chair. S.K. wurde vom Mitacs Globalink Graduate Fellowship und dem ACHRI Graduate Student Scholarship finanziert.

Der gesamte Gebrauch von Tieren wurde vom Animal Care Committee der University of Calgary überwacht. CD1-Mäuse, die für das Experiment verwendet wurden, wurden von kommerziellen Anbietern gekauft.
1. Vorbereitung von Lösungen
HINWEIS Um den ABBAU der RNA zu verhindern, sprühen Sie die Werkbank und alle Geräte mit RNase-Dekontaminationslösung. Für das Experiment werden RNase-freie Spitzen verwendet. Alle Lösungen werden in RNase-freiem Wasser vorbereitet.
...

<ol>
	<li>G&#246;tz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+neurogenesis.">The cell biology of neurogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).</li><li>Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+specification+of+neural+fates+by+transcription+factor+codes.">Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes.</a> Development. 134, 3771-3780 (2007).</li><li>Fiddes, I. 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(92), e52295 (2014).</li><li>Chass&#233;, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+using+polysome+profiling.">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45, 15 (2017).</li><li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin.">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).</li><li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamic+WNT3+secretion+spatiotemporally+regulates+the+neocortical+ribosome+signature+and+mRNA+translation+to+specify+neocortical+cell+subtypes.">Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes.</a> Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e51455 (2014).</li></ol>

Polysome Profiling ist eine häufig verwendete und leistungsfähige Technik, um den Translationsstatus sowohl auf einzelnen Gen- als auch auf genomweiten Ebenen14 zu bewerten. In diesem Bericht stellen wir ein Protokoll der Polysomenprofilierung mit einer selbst zusammengesetzten Plattform und deren Anwendung zur Analyse des sich entwickelnden Mauskortex vor. Diese kostengünstige Plattform lässt sich einfach montieren und robuste, reproduzierbare Saccharosegradienten und Polysomenprofilierung mi...

Während der Entwicklung des Säugetierhirns vermehren sich neuronale Stammzellen und differenzieren sich, um Neuronen und Glia1,2 zu erzeugen. Die Störung dieses Prozesses kann zu Veränderungen in der Gehirnstruktur und -funktion führen, wie in vielen neuroentwicklungsbedingten Störungengesehen 3,4. Das richtige Verhalten neuronaler Stammzellen erfordert die orchestrierte Expression spezifischer Gene5. Während die epigenetische und transkriptionelle Kontrolle dieser Gene intensiv untersucht wurde, deuten jüngste Ergebnisse darauf hin, dass die Genregulation auf anderen Ebenen auch zur Koordination der Proliferation und Differenzierung neuronaler Stammzellen beiträgt6,7,8,9,10. Daher wird die Adressierung der translationalen Kontrollprogramme unser Verständnis der Mechanismen, die der Entscheidung über das Schicksal von neuronalen Stammzellen und der Entwicklung des Gehirns zugrunde liegen, erheblich voranbringen.
Drei Haupttechniken mit unterschiedlichen Stärken wurden weit verbreitet, um den Translationsstatus von mRNA zu bewerten, einschließlich Ribosom-Profiling, Übersetzen ribososome-Affinitätsreinigung (TRAP) und Polysome-Profiling. Ribosome Profiling verwendet RNA-Sequenzierung, um ribosome-geschützte mRNA-Fragmente zu bestimmen, was die globale Analyse der Anzahl und Position der Übersetzung von Ribosomen auf jedem Transkript ermöglicht, um indirekt die Translationsrate abzuleiten, indem man sie mit transkriptionsüberfluss11vergleicht. TRAP nutzt epitopgemarkierte ribosomale Proteine, um ribosomgebundene mRNAs12zu erfassen. Da die markierten ribosomalen Proteine mit genetischen Ansätzen in bestimmten Zelltypen exprimiert werden können, ermöglicht TRAP die zelltypspezifische Analyse der Translation. Im Vergleich dazu bietet die Polysomenprofilierung, die die Saccharosedichtegradientenfraktionierung verwendet, um freie und schlecht übersetzte Portionen (leichtere Monosomen) von denen zu trennen, die aktiv durch Ribosomen (schwerere Polysomen) übersetzt werden, eine direkte Messung der Ribosomdichte auf mRNA13. Ein Vorteil dieser Technik ist ihre Vielseitigkeit, die Übersetzung spezifischer mRNA von Interesse sowie genomweite Translatome-Analyse14zu studieren.
In diesem Artikel beschreiben wir ein detailliertes Protokoll der Polysomenprofilierung zur Analyse der sich entwickelnden Mausgroßhirnrinde. Wir verwenden ein selbst montiertes System, um Saccharosedichtegradienten vorzubereiten und Brüche für nachgelagerte Anwendungen zu sammeln. Das hier vorgestellte Protokoll kann leicht angepasst werden, um andere Arten von Geweben und Organismen zu analysieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL RNA free microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Greiner-Bio</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M MgCl2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21-23G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M KCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt end needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB2530/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>115-39-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 mouse</td>
			<td></td>
			<td>Charles River Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tip forceps</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#Z168785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td></td>
			<td>Sigma</td>
			<td>66-81-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition software TracerDAQ</td>
			<td>Measurement Computing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital converter</td>
			<td></td>
			<td>Measurement Computing</td>
			<td>USB-1208LS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA miniprep kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>R2070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>12-03-3483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No.5 forceps</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Model 2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-513-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear stage actuator</td>
			<td>Rattmmotor</td>
			<td>CBX1605-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase control RNA</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L4561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima first strand cDNA synthesis kit</td>
			<td>Themo Fisher</td>
			<td>M1681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature V-clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VH1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MSB7515/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series optical post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MS2R/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series pedestal post holder base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MBA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;12.7 mm aluminum post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TRA150/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa SYBR green fastmix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>CA101414-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>58-58-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RA90/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle &#216;1/2&#34; to &#216;6 mm post clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RA90TR/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase AWAY</td>
			<td>Molecular BioProducts</td>
			<td>7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free tips</td>
			<td>Frogga Bio</td>
			<td>FT10, FT200, FT1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free water</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>809-115-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim right-angle bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AB90B/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small V-clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VC1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>302-95-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper motor driver</td>
			<td>SongHe</td>
			<td>TB6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>57501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube piercer</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>BR-184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td></td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>L8-70M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO project super starter kit</td>
			<td>Elegoo</td>
			<td>EL-KIT-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV monitor</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>EM-1 Econo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VB01A/M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of translation in the developing mouse brain using polysome profiling

Die richtige Entwicklung des Säugetiergehirns beruht auf einem feinen Gleichgewicht der proliferation neuronaler Stammzellen und der Differenzierung in verschiedene neuronale Zelltypen. Dieses Gleichgewicht wird streng durch genexpression kontrolliert, die auf mehreren Ebenen fein abgestimmt ist, einschließlich Transkription, Posttranskription und Übersetzung. In dieser Hinsicht unterstreicht eine wachsende Zahl von Beweisen eine entscheidende Rolle der translationalen Regulierung bei der Koordinierung von Entscheidungen über das Schicksal neuronaler Stammzellen. Polysome Fractionation ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Beurteilung des mRNA-Translationalstatus sowohl auf globaler als auch auf individueller Genebene. Hier stellen wir eine hauseigene Polysomen-Profiling-Pipeline vor, um die Translationseffizienz in Zellen aus der sich entwickelnden Mausgroßrinde zu bewerten. Wir beschreiben die Protokolle zur Saccharosegradientenvorbereitung, Gewebelyse, Ultrazentrifugation und Fraktionierungs-basierte Analyse des mRNA-Translationalstatus.

Als Demonstration wurde das kortikale Lysat, das 75 g RNA (gepoolt aus 8 Embryonen) enthält, durch den Saccharosegradienten in 12 Fraktionen getrennt. Spitzen der UV-Absorption bei 254 nm identifizierten Fraktionen, die die 40S-Untereinheit, 60S-Untereinheit, 80S-Monosomen und Polysomen enthalten (Abbildung 4A). Die Analyse der Fraktionen nach Western Blot für die große ribosomale Untereinheit randalierte Rpl10 in der 60S-Untereinheit (Fraktion 3), Monosomen (Fraktion 4) und Polysomen (Fr...

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Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

Die Entwicklung des Säugetiergehirns erfordert eine ordnungsgemäße Kontrolle der Genexpression auf der Ebene der Translation. Hier beschreiben wir ein Polysomen-Profiling-System mit einer einfach zu montierenden Sucrose-Gradientenerstellungs- und Fraktionierungsplattform, um den Translationsstatus von mRNAs im sich entwickelnden Gehirn zu bewerten.

Analyse der Übersetzung im sich entwickelnden Mausgehirn mit Polysome Profiling

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

Die translationale Regulierung spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des Gehirns. Polysome Profiling bietet ein nützliches und leistungsstarkes Werkzeug, um den Translationsstatus von mRNA zu bewerten, was es ermöglicht, translationale Steuerungsfunktionen während der Gehirnentwicklung zu untersuchen. Diese Methode ist ein einfacher und kostengünstiger Ansatz, um Saccharosegradienten zu machen und die Polysomenfraktionierung zu bewerten.In diesem Protokoll wird es verwendet, um den sich entwickelnden Mauskortex zu analysieren. Es kann jedoch leicht an andere Systeme angepasst werden. Beginnen Sie mit der Verdünnung von 2,2 Molsaccharose, um sechs 10 bis 50%Saccharose-Gradienten zuzubereiten.Füllen Sie eine 30-Milliliter-Spritze mit ca. 16 Millilitern 10%Saccharose, legen Sie sie auf die Spritzenpumpe und schließen Sie sie an die Nadel an. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in der Spritze, Schläuche oder Nadel befinden, und wischen Sie die Nadelspitze ab, um Restlösung zu entfernen. Bewegen Sie die motorisierte Bühne so nach oben, dass die Spitze der Nadel die Mitte des Rohres an der Unterseite berührt.Stellen Sie die Spritzenpumpe bei einem Volumen von 2,3 Millilitern auf einen Durchfluss von zwei Millilitern pro Minute ein. Nach der Abgabe von 2,3 Milliliter10%Saccharose-Lösung, bewegen Sie sich die motorisierte Stufe nach unten und wiederholen Sie den Prozess für alle sechs Steigungen. Dann fügen Sie 20%Saccharose-Lösung auf den Boden der Röhren gefolgt von 30, 40 und 50%Sammeln CD1 Maus Embryonen am embryonalen Tag 12 und legen Sie sie in einer 10-Zentimeter-Platte mit eiskalten HBSS auf Eis.Übertragen Sie im Sezierbereich einen Embryo auf eine sechs Zentimeter große Platte, die eiskalte HBSS enthält. Verwenden Sie 21 bis 23 Messgerätnadeln, um die Position des Kopfes zu fixieren, indem Sie durch die Augen in einem 45-Grad-Winkel eindringen und eine Kraft anwenden, um sicherzustellen, dass die Nadeln auf der Platte befestigt sind. Verwenden Sie Nummer fünf Zangen, um die Haut und Schädel arbeiten von der Mitte zu den Seiten zu entfernen, dann schneiden Sie die olfaktorischen Glühbirnen und entfernen Sie die Menings, um die kortikalen Gewebe auszusetzen.Verwenden Sie gekrümmte Zangen, um das kortikale Gewebe in zwei bis drei Milliliter neurobasales Medium auf Eis zu schneiden. Ziehen Sie die Gewebe aus verschiedenen Embryonen nach Bedarf. Gewebe von acht bis zehn Embryonen ergeben in der Regel etwa 200 Mikrogramm Gesamt-RNA.Fügen Sie Cycloheximid dem neurobasalen Medium mit dem sezierten Gewebe zu einer Endkonzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter hinzu und brüten sie 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie das Gewebe bei 500 x g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und entsorgen Sie den Überstand. Waschen Sie das Gewebe zweimal mit eiskaltem PBS, ergänzt mit 100 Mikrogramm pro Milliliter Cycloheximid.Fügen Sie 500 Mikroliter Zelllysepuffer hinzu, ergänzt durch vier Mikroliter RNase-Inhibitor und Pipette nach oben und unten, um das Gewebe wieder aufzuhängen. Verwenden Sie eine Insulinnadel, um das Gewebe sanft zu lysieren. Dann auf Eis für 10 Minuten mit kurzen Wirbel alle zwei bis drei Minuten inkubieren.Nach der Inkubation zentrieren Sie das Lysat bei 2000 x g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius und übertragen Sie den Überstand auf ein neues Zentrifugenrohr auf Eis. Wiederholen Sie diesen Vorgang noch einmal Zentrifugieren bei 13.000 x g. Nach der Übertragung des Überstandes auf ein neues Zentrifugenrohr auf Eis, messen Sie die RNA-Konzentration im Gewebelysat mit einem UV-Vis Spektrophotometer.Laden Sie die Proben auf die Saccharosegradienten, indem Sie das Lysat langsam an die Wände der Ultrazentrifugenrohre abgeben. Die Saccharose-Gradienten vorsichtig in die Eimer legen und die Proben 90 Minuten bei 190, 000 x g und vier Grad Celsius ultrazentrieren. Legen Sie ein leeres Ultrazentrifugenrohr auf den Rohrpiercer und dringen Sie vorsichtig mit der Nadel von unten in das Rohr ein.Füllen Sie eine 30-Milliliter-Spritze mit 25 Millilitern 60%Saccharose-Chase-Lösung. Drücken Sie dann vorsichtig die Spritze so, dass die Chase-Lösung das leere Rohr füllt und durch den 254 Nanometer UV-Monitor geht, um die Basis für die Detektion festzulegen. Drücken Sie auf dem UV-Monitor auf Auto Zero, um eine Baseline für die Erkennung zu registrieren, und drücken Sie dann Play auf der Software, um mit der Aufzeichnung zu beginnen.Sobald das System eine Baseline erstellt hat, halten Sie die Aufzeichnung auf der Software an und ziehen Sie die Chase-Lösung zurück, um sicherzustellen, dass keine Restverfolgungslösung im System verbleibt. Laden Sie ein Probenrohr auf den Rohrpiercer und dringen Sie vorsichtig mit der Nadel von unten in das Rohr ein. Beginnen Sie mit der Aufnahme auf der Software, stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen in der Linie befinden.Starten Sie dann die Spritzenpumpe und den Bruchkollektor, um Polysomenfraktionen zu sammeln, und stellen Sie den Fraktionator auf 30 Sekunden ein. Sammeln Sie die Fraktionen in 1,5 Milliliter-Röhren. Das kortikale Lysat, das RNA aus acht Embryonen enthält, wurde durch einen Saccharosegradienten in 12 Fraktionen getrennt.Peaks der UV-Absorption bei 254 Nanometern identifiziert Fraktionen, die die 40S Untereinheit 60S Untereinheit und 80S Monosomen und Polysomen enthalten. Die Analyse der Fraktionen durch Western Blot für die große ribosomale Untereinheit Rpl10 zeigte ihre Präsenz in den 60S-Untereinheitsmonosomen und Polysomen. Im Gegensatz dazu wurden zytoplasmatische Proteine, Gapdh und Csde1, nicht mit Ribosomen assoziiert, sondern in Fraktionen angereichert, die freie RNA enthielten.In Übereinstimmung mit der Trennung von Proteinen in verschiedenen Fraktionen wurden Gapdh und sox2 mRNAs in den Fraktionen, die schwere Polysomen enthalten, stark angereichert, was darauf hindeutet, dass diese mRNAs effizient in den sich entwickelnden Kortex übersetzt werden. Im Gegensatz dazu wurden rpl7 und rpl35 mRNAs in der Fraktion angereichert, die Monosomen enthält, was auf eine verdrängte Übersetzung hindeutet. Um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen, ist es wichtig, die Konsistenz bei der Herstellung von Saccharosegradienten aufrechtzuerhalten.Die Spritzenpumpen sollten zum Auswerfen der Saccharose verwendet werden. Bei der Fraktionierung und Probenentnahme ist es wichtig, das System mit RNase-freiem Wasser zu waschen. Dadurch werden restliche Saccharose aus der vorherigen Probe reduziert.Diese Methode kann verwendet werden, um den Translationsstatus von mRNAs in verschiedenen Geweben zu bewerten. Mit hilfe der Plattform können konsistente Gradienten für die Polysomenprofilierung erzielt werden, was eine kostengünstige Lösung für diese klassische und nützliche Technik bietet.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

Mosaic Analyse der Genfunktion in Postnatale Mäusehirnen mithilfe von Virus-basierten Cre Rekombination

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when ...

Forschung

Neurowissenschaften

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In-vivo-Elektroporation von Entwicklung Maus Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Einzel-Zell-Profiling der Entwicklung und Reife Netzhautneuronen

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisierung und genetische Manipulation von Dendriten und Dornen in der Maus Hirnrinde und im Hippocampus mit<em&gt; In utero</em&gt; Die Elektroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Beurteilung der Zellzyklus-Progression of Neural Stem-und Vorläuferzellen im sich entwickelnden Gehirn Maus nach genotoxischen Stress

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Live-Imaging der Mitose in der Entwicklung von embryonalen Maus-Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imaging Serotonerge Fasern im Rückenmark der Maus Mit der CLARITY / CUBIC Technik

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modellierung der Zika-Virus-Infektion des entwickelnden menschlichen Gehirns In Vitro mit Stammzellen abgeleitet zerebrale Organellen

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

Quantifizierung der heterogenen Verteilung der synaptischen Protein im Gehirn Maus mit Immunfluoreszenz

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Chronische Implantation des gesamten kortikalen Electrocorticographic Arrays in der Weißbüschelaffe

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...