Name: analysis of translation in the developing mouse brain using polysome profiling
Uploaded: 2021-05-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling at JoVE.com

इस काम को एनएसईआरसी डिस्कवरी ग्रांट (आरजीपिन/04246-2018 से जीवाई) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। जीवाई एक कनाडा अनुसंधान कुर्सी है । एस. के. को मितिक्स ग्लोबलिंक ग्रेजुएट फेलोशिप और अचरी ग्रेजुएट स्टूडेंट स्कॉलरशिप द्वारा वित्त पोषित किया गया था ।

सभी पशु उपयोग कैलगरी विश्वविद्यालय में पशु देखभाल समिति द्वारा निगरानी की गई थी । प्रयोग के लिए इस्तेमाल किए गए सीडी 1 चूहों को वाणिज्यिक विक्रेता से खरीदा गया था।
1. समाधान की तैयारी
<p class="jove_conte...

<ol>
	<li>G&#246;tz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+neurogenesis.">The cell biology of neurogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).</li><li>Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+specification+of+neural+fates+by+transcription+factor+codes.">Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes.</a> Development. 134, 3771-3780 (2007).</li><li>Fiddes, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-Specific+NOTCH2NL+Genes+Affect+Notch+Signaling+and+Cortical+Neurogenesis.">Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis.</a> Cell. 173, 1356-1369 (2018).</li><li>Lennox, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+DDX3X+mutations+impair+RNA+metabolism+and+neurogenesis+during+fetal+cortical+development.">Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development.</a> Neuron. 106, 404-420 (2020).</li><li>Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+control+of+neurogenesis:+A+view+from+the+mammalian+cerebral+cortex.">Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359 (2012).</li><li>Amadei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Smaug2-based+translational+repression+complex+determines+the+balance+between+precursor+maintenance+versus+differentiation+during+mammalian+neurogenesis.">A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis.</a> Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).</li><li>Yang, G., Smibert, C. A., Kaplan, D. R., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+eIF4E1/4E-T+complex+determines+the+genesis+of+neurons+from+precursors+by+translationally+repressing+a+proneurogenic+transcription+program.">An eIF4E1/4E-T complex determines the genesis of neurons from precursors by translationally repressing a proneurogenic transcription program.</a> Neuron. 84, 723-739 (2014).</li><li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Glo1-Methylglyoxal+pathway+that+is+perturbed+in+maternal+diabetes+regulates+embryonic+and+adult+neural+stem+cell+pools+in+murine+offspring.">A Glo1-Methylglyoxal pathway that is perturbed in maternal diabetes regulates embryonic and adult neural stem cell pools in murine offspring.</a> Cell Reports. 17, 1022-1036 (2016).</li><li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+defined+neocortical+translation+and+polysome+assembly+are+determined+by+the+RNA-binding+protein+Hu+antigen+R.">Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).</li><li>Rodrigues, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylglyoxal+couples+metabolic+and+translational+control+of+Notch+signalling+in+mammalian+neural+stem+cells.">Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells.</a> Nature Communications. 11, 2018 (2020).</li><li>Iwasaki, S., Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+toolbox+for+protein+synthesis+studies.">The growing toolbox for protein synthesis studies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).</li><li>Chekulaeva, M., Landthaler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+on+translation.">Eyes on translation.</a> Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).</li><li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Selective+mRNA+Translation+in+Mammalian+Cells+by+Polysome+Profiling.">Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e52295 (2014).</li><li>Chass&#233;, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+using+polysome+profiling.">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45, 15 (2017).</li><li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin.">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).</li><li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamic+WNT3+secretion+spatiotemporally+regulates+the+neocortical+ribosome+signature+and+mRNA+translation+to+specify+neocortical+cell+subtypes.">Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes.</a> Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e51455 (2014).</li></ol>

पॉलीसोम प्रोफाइलिंग एक सामान्य रूप से उपयोग की जाने वाली और शक्तिशाली तकनीक है जो एकल जीन और जीनोम-वाइड दोनों स्तरों पर ट्रांसलेशनल स्थिति का आकलन करने के लिए14 है। इस रिपोर्ट में, हम विकासशील ?...

स्तनधारी मस्तिष्क के विकास के दौरान, तंत्रिका स्टेम कोशिकाएं न्यूरॉन्स और ग्लिया1,2 उत्पन्न करने के लिए पैदा होती हैं और अंतर करती हैं। इस प्रक्रिया के क्षोभ मस्तिष्क की संरचना और कार्य में परिवर्तन का कारण बन सकता है, जैसा कि कई न्यूरोडेवलपमेंटल विकारों मेंदेखा जाता है 3,4। तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के उचित व्यवहार के लिए विशिष्ट जीन5की आर्केस्ट्रा अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है । जबकि इन जीनों के एपिजेनेटिक और ट्रांसक्रिप्शनल नियंत्रण का गहनता से अध्ययन किया गया है, हाल के निष्कर्षों से पता चलता है कि अन्य स्तरों पर जीन विनियमन भी तंत्रिका स्टेम सेल प्रसार और भेदभाव 6 ,7,8,9,10के समन्वय में योगदान देता है । इस प्रकार, अनुवाद नियंत्रण कार्यक्रमों को संबोधित बहुत तंत्रिका स्टेम सेल भाग्य निर्णय और मस्तिष्क के विकास अंतर्निहित तंत्र के बारे में हमारी समझ अग्रिम होगा ।
विभिन्न शक्तियों के साथ तीन मुख्य तकनीकों को व्यापक रूप से एमआरएनए की अनुवादात्मक स्थिति का आकलन करने के लिए लागू किया गया है, जिसमें राइबोसोम प्रोफाइलिंग, राइबोसोम आत्मीयता शुद्धिकरण (ट्रैप) और पॉलीसोम प्रोफाइलिंग का अनुवाद शामिल है। राइबोसोम प्रोफाइलिंग राइबोसोम-संरक्षित एमआरएनए टुकड़ों को निर्धारित करने के लिए आरएनए अनुक्रमण का उपयोग करता है, जिससे प्रत्येक ट्रांसक्रिप्ट पर राइबोसोम्स का अनुवाद करने की संख्या और स्थान के वैश्विक विश्लेषण को अप्रत्यक्ष रूप से अनुवाद दर का अनुमान लगाने की अनुमति मिलती है, जिसकी तुलना ट्रांसलेशन दर को ट्रांसक्रिप्ट बहुतायतसे 11से किया जाता है। ट्रैप राइबोसोम-बाउंड mRNAs12पर कब्जा करने के लिए epitope-टैग रिबोसोमल प्रोटीन का लाभ लेता है । यह देखते हुए कि टैग किए गए राइबोसोमल प्रोटीन को आनुवंशिक दृष्टिकोणों का उपयोग करके विशिष्ट सेल प्रकारों में व्यक्त किया जा सकता है, ट्रैप सेल प्रकार-विशिष्ट तरीके से अनुवाद के विश्लेषण की अनुमति देता है। इसकी तुलना में, पॉलीसोम प्रोफाइलिंग, जो रिबोसोम्स (भारी पॉलीसोम्स) द्वारा सक्रिय रूप से अनुवादित लोगों से मुक्त और खराब अनुवादित हिस्से (लाइटर मोनोसोम्स) को अलग करने के लिए सुक्रोज घनत्व ढाल का उपयोग करता है, mRNA13पर राइबोसोम घनत्व का प्रत्यक्ष माप प्रदान करता है। इस तकनीक का एक लाभ रुचि के विशिष्ट एमआरएनए के अनुवाद के साथ-साथ जीनोम-वाइड ट्रांसलिरोम विश्लेषण14का अध्ययन करना इसकी बहुमुखी प्रतिभा है।
इस पेपर में, हम विकासशील माउस सेरेब्रल कॉर्टेक्स का विश्लेषण करने के लिए पॉलीसोम प्रोफाइलिंग के विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। हम सुक्रोज घनत्व ढाल तैयार करने और डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए अंश एकत्र करने के लिए घर-इकट्ठे प्रणाली का उपयोग करते हैं। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल को अन्य प्रकार के ऊतकों और जीवों का विश्लेषण करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL RNA free microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Greiner-Bio</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M MgCl2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21-23G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M KCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt end needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB2530/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>115-39-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 mouse</td>
			<td></td>
			<td>Charles River Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tip forceps</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#Z168785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td></td>
			<td>Sigma</td>
			<td>66-81-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition software TracerDAQ</td>
			<td>Measurement Computing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital converter</td>
			<td></td>
			<td>Measurement Computing</td>
			<td>USB-1208LS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA miniprep kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>R2070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>12-03-3483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No.5 forceps</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Model 2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-513-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear stage actuator</td>
			<td>Rattmmotor</td>
			<td>CBX1605-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase control RNA</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L4561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima first strand cDNA synthesis kit</td>
			<td>Themo Fisher</td>
			<td>M1681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature V-clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VH1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MSB7515/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series optical post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MS2R/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series pedestal post holder base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MBA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;12.7 mm aluminum post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TRA150/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa SYBR green fastmix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>CA101414-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>58-58-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RA90/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle &#216;1/2&#34; to &#216;6 mm post clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RA90TR/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase AWAY</td>
			<td>Molecular BioProducts</td>
			<td>7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free tips</td>
			<td>Frogga Bio</td>
			<td>FT10, FT200, FT1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free water</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>809-115-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim right-angle bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AB90B/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small V-clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VC1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>302-95-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper motor driver</td>
			<td>SongHe</td>
			<td>TB6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>57501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube piercer</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>BR-184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td></td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>L8-70M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO project super starter kit</td>
			<td>Elegoo</td>
			<td>EL-KIT-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV monitor</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>EM-1 Econo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VB01A/M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of translation in the developing mouse brain using polysome profiling

स्तनधारी मस्तिष्क का उचित विकास तंत्रिका स्टेम सेल प्रसार और विभिन्न तंत्रिका कोशिका प्रकारों में भेदभाव के ठीक संतुलन पर निर्भर करता है। यह संतुलन जीन अभिव्यक्ति द्वारा कसकर नियंत्रित किया जाता है जो ट्रांसक्रिप्शन, पोस्ट-ट्रांसक्रिप्शन और अनुवाद सहित कई स्तरों पर ठीक-ठाक है। इस संबंध में, साक्ष्य का एक बढ़ता हुआ निकाय तंत्रिका स्टेम सेल भाग्य निर्णयों के समन्वय में अनुवादात्मक नियमन की महत्वपूर्ण भूमिका पर प्रकाश डालता है । पॉलीसोम अंश वैश्विक और व्यक्तिगत जीन दोनों स्तरों पर एमआरएनए ट्रांसलेशनल स्थिति के आकलन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। यहां, हम विकासशील माउस सेरेब्रल कॉर्टेक्स से कोशिकाओं में ट्रांसलेशनल दक्षता का आकलन करने के लिए एक इन-हाउस पॉलीसोम प्रोफाइलिंग पाइपलाइन पेश करते हैं। हम एमआरएनए ट्रांसलेशनल स्थिति के सुक्रोज रेडिएंट तैयारी, टिश्यू लाइसिस, अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन और आंशिक-आधारित विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

एक प्रदर्शन के रूप में, 75 माइक्रोन आरएनए (8 भ्रूण से पूल) युक्त कॉर्टिकल लिसेट को सुक्रोज ढाल द्वारा 12 अंशों में अलग किया गया था। 254 एनएम पर यूवी अवशोषण की चोटियों ने 40S सबयूनिट, 60S सबयूनिट, 80S मोनोसोम और पॉलीसो?...

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Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

स्तनधारी मस्तिष्क के विकास के लिए अनुवाद के स्तर पर जीन अभिव्यक्ति के उचित नियंत्रण की आवश्यकता होती है। यहां, हम विकासशील मस्तिष्क में mRNAs की अनुवादात्मक स्थिति का आकलन करने के लिए एक आसान-से-इकट्ठा सुक्रोज ढाल बनाने और अंश मंच के साथ एक पॉलीसोम प्रोफाइलिंग सिस्टम का वर्णन करते हैं।

पॉलीसोम प्रोफाइलिंग का उपयोग करके विकासशील माउस मस्तिष्क में अनुवाद का विश्लेषण

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

ट्रांसलेशनल रेगुलेशन मस्तिष्क के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। पॉलीसोम प्रोफाइलिंग एमआरएनए की ट्रांसलेशनल स्थिति का आकलन करने के लिए एक उपयोगी और शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है, जिससे मस्तिष्क के विकास के दौरान ट्रांसलेशनल कंट्रोल कार्यों की जांच करना संभव हो जाता है। यह विधि सुक्रोज ग्रेडिएंट बनाने और पॉलीसोम अंश का आकलन करने के लिए एक आसान और कम लागत वाला दृष्टिकोण है।इस प्रोटोकॉल में, इसका उपयोग विकासशील माउस कॉर्टेक्स का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है। हालांकि, इसे अन्य प्रणालियों का अध्ययन करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है। छह 10 से 50% सुक्रोज ढाल तैयार करने के लिए 2.2 मोलर सुक्रोज को कमजोर करके शुरू करें।10% सुक्रोज के लगभग 16 मिलीलीटर के साथ एक 30 मिलीलीटर सिरिंज भरें, इसे सिरिंज पंप पर रखें और इसे सुई से कनेक्ट करें। सुनिश्चित करें कि सिरिंज, ट्यूबिंग या सुई में कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं, और किसी भी अवशिष्ट समाधान को हटाने के लिए सुई की नोक पोंछ। मोटराइज्ड स्टेज को इस तरह ले जाएं कि सुई की नोक नीचे ट्यूब के केंद्र को छू जाए।सिरिंज पंप को 2.3 मिलीलीटर की मात्रा के लिए प्रति मिनट दो मिलीलीटर की प्रवाह दर पर सेट करें। 10% सुक्रोज समाधान के 2.3 मिलीलीटर वितरित करने के बाद, मोटरचालित चरण को नीचे ले जाएं और सभी छह ग्रेडिएंट्स के लिए प्रक्रिया दोहराएं। फिर ट्यूबों के नीचे 20% सुक्रोज समाधान जोड़ें इसके बाद 30, 40 और 50% भ्रूण दिवस 12 पर सीडी 1 माउस भ्रूण एकत्र करें और उन्हें बर्फ पर बर्फ ठंडे एचबीएसएस युक्त 10 सेंटीमीटर प्लेट में रखें।विच्छेदन दायरे के तहत, एक भ्रूण को छह सेंटीमीटर प्लेट में स्थानांतरित करें जिसमें बर्फ ठंडी एचबीएसएस होती है। 45 डिग्री कोण पर आंखों के माध्यम से मर्मज्ञ द्वारा सिर की स्थिति को ठीक करने के लिए 21 से 23 गेज सुइयों का उपयोग करें और यह सुनिश्चित करने के लिए एक बल लागू करें कि सुई प्लेट पर तय की गई है। बीच से किनारों तक काम करने वाली त्वचा और खोपड़ी को हटाने के लिए नंबर पांच संदंश का उपयोग करें, फिर घ्राण बल्ब काटें और कॉर्टिकल ऊतकों को बेनकाब करने के लिए मेनिंग्स को हटा दें।कॉर्टिकल ऊतकों को बर्फ पर न्यूरोबेसल माध्यम के दो से तीन मिलीलीटर में काटने के लिए घुमावदार संदंश का उपयोग करें। जरूरत के अनुसार विभिन्न भ्रूणों से ऊतकों को खींचें। आठ से 10 भ्रूण के ऊतक आमतौर पर कुल आरएनए के लगभग २०० माइक्रोग्राम देते हैं ।विच्छेदन ऊतकों के साथ न्यूरोबेसल माध्यम में साइक्लोहेक्सीमाइड जोड़ें 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता और 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 500 x ग्राम पर ऊतक अपकेंद्रित्र और सुपरनेट को त्याग दें। ऊतकों को बर्फ की ठंड के साथ दो बार धोएं पीबीएस 100 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर साइक्लोहेक्सीमाइड के साथ पूरक होता है।कोशिका लाइसिस बफर के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें जो आरएनएसई अवरोधक के चार माइक्रोलीटर के साथ पूरक हैं और ऊतक को फिर से खर्च करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करते हैं। ऊतक को धीरे-धीरे लेज़ करने के लिए इंसुलिन सुई का उपयोग करें। फिर हर दो से तीन मिनट में संक्षिप्त भंवर के साथ 10 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।इनक्यूबेशन के बाद, चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए २००० एक्स जी पर lysate अपकेंद्रित्र और बर्फ पर एक नई अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण । इस प्रक्रिया को एक बार और 13, 000 x g पर अपकेंद्री दोहराएं। बर्फ पर एक नई अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए सुपरनेट को स्थानांतरित करने के बाद, यूवी-विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके ऊतक में आरएनए एकाग्रता को मापें।धीरे-धीरे अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूबों की दीवारों पर लिस्लेट वितरित करके सुक्रोज ग्रेडिएंट्स के शीर्ष पर नमूनों को लोड करें। धीरे-धीरे सुक्रोज ग्रेडिएंट्स को बाल्टी में रखें और नमूनों को 90 मिनट के लिए 190, 000 x g और चार डिग्री सेल्सियस पर अल्ट्रासेंट्रफ्यूज करें। ट्यूब पियर्सर पर एक खाली अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूब रखें और धीरे-धीरे नीचे से सुई के साथ ट्यूब में प्रवेश करें।60% सुक्रोज चेस समाधान के 25 मिलीलीटर के साथ एक 30 मिलीलीटर सिरिंज भरें। फिर धीरे से सिरिंज को इस तरह दबाएं कि चेस समाधान खाली ट्यूब भरता है और पता लगाने के लिए बेसलाइन सेट करने के लिए 254 नैनोमीटर यूवी मॉनिटर के माध्यम से चला जाता है। पता लगाने के लिए एक बेसलाइन रजिस्टर करने के लिए यूवी मॉनिटर पर ऑटो शून्य दबाएं, फिर रिकॉर्डिंग शुरू करने के लिए सॉफ्टवेयर पर प्ले दबाएं।एक बार जब सिस्टम एक बेसलाइन स्थापित करता है, तो सॉफ्टवेयर पर रिकॉर्डिंग को रोकें और चेस समाधान को वापस लें, यह सुनिश्चित करें कि सिस्टम में कोई अवशिष्ट चेस समाधान नहीं रहता है। ट्यूब पियर्सर पर एक नमूना ट्यूब लोड करें और धीरे-धीरे नीचे से सुई के साथ ट्यूब में प्रवेश करें। सॉफ्टवेयर पर रिकॉर्डिंग शुरू करें, सुनिश्चित करें कि लाइन में कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं।फिर सिरिंज पंप और अंश कलेक्टर को पॉलीसोम अंश इकट्ठा करने के लिए शुरू करें, 30 सेकंड के लिए अंश स्थापित करें। अंशों को 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में ले लीजिए। आठ भ्रूणों से खींचे गए आरएनए से युक्त कॉर्टिकल लिस्एट को एक सुक्रोज ग्रेडिएंट ने 12 अंशों में अलग कर दिया ।254 नैनोमीटर पर यूवी अवशोषण की चोटियों ने 40S सबयूनिट 60S सबयूनिट और 80S मोनोसोम और पॉलीसोम वाले अंशों की पहचान की। बड़े राइबोसोमल सबयूनिट आरपीएल10 के लिए पश्चिमी दाग द्वारा अंशों के विश्लेषण ने 60 के दशक के सबयूनिट मोनोसोम्स और पॉलीसोम्स में अपनी उपस्थिति दिखाई। इसके विपरीत, साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन, गपध और सीएसडी1, राइबोसोम्स से जुड़े नहीं थे, लेकिन मुफ्त आरएनए वाले अंशों में समृद्ध थे।विभिन्न अंशों में प्रोटीन के पृथक्करण के अनुरूप, गध और सोक्स 2 एमआरएएनए भारी पॉलीसोम वाले अंशों में अत्यधिक समृद्ध थे, यह सुझाव देते हुए कि इन mRNAs का विकासशील प्रांतस्था में कुशलतापूर्वक अनुवाद किया जाता है। इसके विपरीत, rpl7 और rpl35 mRNAs मोनोसोम युक्त अंश में समृद्ध थे, दमित अनुवाद का सुझाव । प्रजनन योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए, सुक्रोज ग्रेडिएंट बनाने में स्थिरता बनाए रखना महत्वपूर्ण है।सुक्रोज को बाहर निकालने के लिए सिरिंज पंप का इस्तेमाल किया जाना चाहिए। अंश और नमूना संग्रह के दौरान, RNase-मुक्त पानी के साथ सिस्टम को धोना महत्वपूर्ण है। यह पिछले नमूने से शेष किसी भी अवशिष्ट सुक्रोज को कम करता है।इस विधि का उपयोग विभिन्न ऊतकों में mRNAs की अनुवादात्मक स्थिति का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। मंच का उपयोग करके, पॉलीसोम प्रोफाइलिंग के लिए लगातार ढाल प्राप्त किए जा सकते हैं, जो इस शास्त्रीय और उपयोगी तकनीक के लिए कम लागत वाला समाधान प्रदान करता है।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

प्रसवोत्तर माउस मस्तिष्क के विकास में जीन फंक्शन के वायरस आधारित Cre पुनर्संयोजन का उपयोग करके मोज़ेक विश्लेषण

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

विकास माउस रेटिना के vivo electroporation में

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

विकासशील और परिपक्व रेटिना न्यूरॉन्स की रूपरेखा एकल कक्ष

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

और माउस मस्तिष्क प्रांतस्था और हिप्पोकैम्पस का उपयोग में Dendrites और कांटा के आनुवंशिक हेरफेर विज़ुअलाइज़ेशन<em&gt; Utero में</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Genotoxic तनाव के बाद तंत्रिका स्टेम और माउस विकासशील मस्तिष्क में पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं का आकलन कोशिका चक्र प्रगति

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

विकासशील माउस भ्रूण प्रांतस्था में सूत्रीविभाजन के रहते इमेजिंग

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

माउस रीढ़ की हड्डी में serotonergic फाइबर इमेजिंग स्पष्टता का उपयोग / क्यूबिक तकनीक

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

मॉडलिंग स्टेम सेल व्युत्पंन सेरेब्रल Organoids का उपयोग इन विट्रो में विकासशील मानव मस्तिष्क के Zika वायरस संक्रमण

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

माउस मस्तिष्क में एक Synaptic प्रोटीन के विषम वितरण बढ़ाता इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

जीर्ण-cortical Electrocorticographic सरणी के आम Marmoset में पुरानी आरोपण

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...