Name: analysis of translation in the developing mouse brain using polysome profiling
Uploaded: 2021-05-22T14:00:00
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Questo lavoro è stato finanziato da un NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018 a G.Y.). G.Y. è una presidente di ricerca canadese. S.K. è stato finanziato dalla Mitacs Globalink Graduate Fellowship e dalla Borsa di studio per studenti laureati ACHRI.

Tutto l'uso degli animali è stato supervisionato dal Comitato per la cura degli animali dell'Università di Calgary. I mouse CD1 utilizzati per l'esperimento sono stati acquistati da un fornitore commerciale.
1. Preparazione di soluzioni
NOTA Per prevenire la degradazione dell'RNA, spruzzare il workbench e tutte le apparecchiature con soluzione di decontaminazione RNasi. Per l'esperimento vengono utilizzate punte senza RNasi. Tutte le soluzioni sono preparate in acqu...

<ol>
	<li>G&#246;tz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+neurogenesis.">The cell biology of neurogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).</li><li>Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+specification+of+neural+fates+by+transcription+factor+codes.">Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes.</a> Development. 134, 3771-3780 (2007).</li><li>Fiddes, I. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+DDX3X+mutations+impair+RNA+metabolism+and+neurogenesis+during+fetal+cortical+development.">Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development.</a> Neuron. 106, 404-420 (2020).</li><li>Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+control+of+neurogenesis:+A+view+from+the+mammalian+cerebral+cortex.">Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359 (2012).</li><li>Amadei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Smaug2-based+translational+repression+complex+determines+the+balance+between+precursor+maintenance+versus+differentiation+during+mammalian+neurogenesis.">A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis.</a> Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).</li><li>Yang, G., Smibert, C. 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(92), e52295 (2014).</li><li>Chass&#233;, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+using+polysome+profiling.">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45, 15 (2017).</li><li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin.">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).</li><li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamic+WNT3+secretion+spatiotemporally+regulates+the+neocortical+ribosome+signature+and+mRNA+translation+to+specify+neocortical+cell+subtypes.">Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes.</a> Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e51455 (2014).</li></ol>

La profilazione polisoma è una tecnica comunemente usata e potente per valutare lo stato traslazione sia a livello di singolo gene che di genoma14 . In questo report, presentiamo un protocollo di profilazione polisoma utilizzando una piattaforma assemblata in casa e la sua applicazione per analizzare la corteccia del mouse in via di sviluppo. Questa piattaforma economica è facile da assemblare e generare gradienti di saccarosio robusti e riproducibili e profilazione polisoma con elevata sensibil...

Durante lo sviluppo del cervello dei mammiferi, le cellule staminali neurali proliferano e si differenziano per generare neuroni e glia1,2 . La perturbazione di questo processo può portare ad alterazioni della struttura e della funzione cerebrale, come si vede in molti disturbi del neurosviluppo3,4. Il corretto comportamento delle cellule staminali neurali richiede l'espressione orchestrata di genispecifici 5. Mentre il controllo epigenetico e trascrizionale di questi geni è stato intensamente studiato, recenti scoperte suggeriscono che la regolazione genica ad altri livelli contribuisce anche alla coordinazione della proliferazione e differenziazione delle cellule staminalineurali 6,7,8,9,10. Pertanto, affrontare i programmi di controllo traslizionale farà avanzare notevolmente la nostra comprensione dei meccanismi alla base della decisione del destino delle cellule staminali neurali e dello sviluppo cerebrale.
Tre tecniche principali con diversi punti di forza sono state ampiamente applicate per valutare lo stato traslazionale dell'mRNA, tra cui la profilazione ribosoma, la traduzione della purificazione dell'affinità ribosoma (TRAP) e la profilazione polisome. La profilazione ribosoma utilizza il sequenziamento dell'RNA per determinare frammenti di mRNA protetti da ribosomi, permettendo all'analisi globale del numero e della posizione della traduzione dei ribosomi su ogni trascrizione di dedurre indirettamente il tasso di traslazione confrontandolo con l'abbondanza ditrascrizione 11. TRAP sfrutta le proteine ribosomiche taggate all'epitopo per catturare mRNA legati al ribosoma12. Dato che le proteine ribosomiche taggate possono essere espresse in specifici tipi di cellule utilizzando approcci genetici, TRAP consente l'analisi della traduzione in modo specifico del tipo cellulare. In confronto, la profilazione polisomeria, che utilizza il frazionamento del gradiente di densità del saccarosio per separare la porzione libera e scarsamente tradotta (monosomi più leggeri) da quelli tradotti attivamente dai ribosomi (polisomi più pesanti), fornisce una misurazione diretta della densità ribosoma su mRNA13. Un vantaggio che questa tecnica offre è la sua versatilità per studiare la traduzione di mRNA specifici di interesse e l'analisi del trasoma a livello genomico14.
In questo articolo, descriviamo un protocollo dettagliato di profilazione polisoma per analizzare la corteccia cerebrale del topo in via di sviluppo. Utilizziamo un sistema assemblato in casa per preparare gradienti di densità di saccarosio e raccogliere frazioni per applicazioni a valle. Il protocollo qui presentato può essere adattato facilmente per analizzare altri tipi di tessuti e organismi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL RNA free microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Greiner-Bio</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M MgCl2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21-23G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M KCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt end needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB2530/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>115-39-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 mouse</td>
			<td></td>
			<td>Charles River Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tip forceps</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#Z168785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td></td>
			<td>Sigma</td>
			<td>66-81-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition software TracerDAQ</td>
			<td>Measurement Computing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital converter</td>
			<td></td>
			<td>Measurement Computing</td>
			<td>USB-1208LS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA miniprep kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>R2070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>12-03-3483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No.5 forceps</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Model 2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-513-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear stage actuator</td>
			<td>Rattmmotor</td>
			<td>CBX1605-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase control RNA</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L4561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima first strand cDNA synthesis kit</td>
			<td>Themo Fisher</td>
			<td>M1681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature V-clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VH1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MSB7515/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series optical post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MS2R/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series pedestal post holder base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MBA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;12.7 mm aluminum post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TRA150/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa SYBR green fastmix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>CA101414-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>58-58-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RA90/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle &#216;1/2&#34; to &#216;6 mm post clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RA90TR/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase AWAY</td>
			<td>Molecular BioProducts</td>
			<td>7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free tips</td>
			<td>Frogga Bio</td>
			<td>FT10, FT200, FT1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free water</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>809-115-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim right-angle bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AB90B/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small V-clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VC1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>302-95-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper motor driver</td>
			<td>SongHe</td>
			<td>TB6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>57501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube piercer</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>BR-184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td></td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>L8-70M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO project super starter kit</td>
			<td>Elegoo</td>
			<td>EL-KIT-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV monitor</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>EM-1 Econo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VB01A/M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of translation in the developing mouse brain using polysome profiling

Il corretto sviluppo del cervello dei mammiferi si basa su un buon equilibrio tra proliferazione e differenziazione delle cellule staminali neurali in diversi tipi di cellule neurali. Questo equilibrio è strettamente controllato dall'espressione genica che viene messa a punto a più livelli, tra cui trascrizione, post-trascrizione e traduzione. A questo proposito, un crescente corpus di prove evidenzia un ruolo critico della regolamentazione traslizionale nel coordinamento delle decisioni sul destino delle cellule staminali neurali. Il frazionamento polisoma è un potente strumento per la valutazione dello stato traslazione dell'mRNA a livello genico globale e individuale. Qui presentiamo una pipeline di profilazione polisomaria internamente per valutare l'efficienza traslibrazionale nelle cellule dalla corteccia cerebrale del topo in via di sviluppo. Descriviamo i protocolli per la preparazione del gradiente di saccarosio, la lisi tissutale, l'ultracentrifugazione e l'analisi basata sul frazionamento dello stato traslazione dell'mRNA.

Come dimostrazione, il lisato corticale contenente 75 μg di RNA (raggruppato da 8 embrioni) è stato separato dal gradiente di saccarosio in 12 frazioni. Picchi di assorbanza UV a 254 nm hanno identificato frazioni contenenti la subunità 40S, la subunità 60S, il monosome 80S e i polisomi(Figura 4A). Analisi delle frazioni per macchia occidentale per la grande subunità ribosomiale, Rpl10 ha mostrato la sua presenza nella subunità 60S (frazione 3), monosome (frazione 4) e polisomei (frazi...

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Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

Lo sviluppo del cervello dei mammiferi richiede un adeguato controllo dell'espressione genica a livello di traduzione. Qui descriviamo un sistema di profilazione polisome con una piattaforma di gradiente di saccarosio e frazionamento facile da assemblare per valutare lo stato traslazionale degli mRNA nel cervello in via di sviluppo.

Analisi della traduzione nel cervello del mouse in via di sviluppo utilizzando la profilazione polisome

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

La regolazione traslizionale svolge un ruolo importante nello sviluppo cerebrale. La profilazione polisoma fornisce uno strumento utile e potente per valutare lo stato traslazionale dell'mRNA, rendendo possibile esaminare le funzioni di controllo traslazionale durante lo sviluppo cerebrale. Questo metodo è un approccio facile e a basso costo per creare gradienti di saccarosio e valutare il frazionamento polisoma.In questo protocollo, viene utilizzato per analizzare la corteccia del mouse in via di sviluppo. Tuttavia, può essere facilmente adattato per studiare altri sistemi. Iniziare diluire il saccarosio molare 2.2 per preparare sei gradienti di saccarosio dal 10 al 50%.Riempire una siringa da 30 millilitri con circa 16 millilitri di saccarosio al 10%, posizionarla sulla pompa della siringa e collegarla all'ago. Assicurarsi che non vi siano bolle d'aria nella siringa, nel tubo o nell'ago e pulire la punta dell'ago per rimuovere qualsiasi soluzione residua. Spostare lo stadio motorizzato verso l'alto in modo che la punta dell'ago tocchi il centro del tubo nella parte inferiore.Impostare la pompa della siringa su una portata di due millilitri al minuto per un volume di 2,3 millilitri. Dopo aver erogato 2,3 millilitri di soluzione di saccarosio al 10%, spostare verso il basso lo stadio motorizzato e ripetere il processo per tutti e sei i gradienti. Quindi aggiungere la soluzione di saccarosio al 20% sul fondo dei tubi seguita da 30, 40 e 50%Raccogliere embrioni di topo CD1 al giorno 12 embrionale e metterli in una piastra di 10 centimetri contenente HBSS ghiacciato sul ghiaccio.Sotto l'ambito della dissezione, trasferire un embrione su una piastra di sei centimetri contenente HBSS ghiacciato. Utilizzare aghi da 21 a 23 calibro per fissare la posizione della testa penetrando attraverso gli occhi con un angolo di 45 gradi e applicare una forza per assicurarsi che gli aghi siano fissati sulla piastra. Utilizzare le forcelle numero cinque per rimuovere la pelle e il cranio che lavorano dal centro ai lati, quindi tagliare i bulbi olfattivi e rimuovere le meningi per esporre i tessuti corticali.Utilizzare forcelle curve per tagliare i tessuti corticali in due o tre millilitri di mezzo neurobasale sul ghiaccio. Estrarre i tessuti da diversi embrioni in base alle esigenze. I tessuti da otto a 10 embrioni di solito danno circa 200 microgrammi di RNA totale.Aggiungere il cicloeximide al mezzo neurobasale con i tessuti sezionati a una concentrazione finale di 100 microgrammi per millilitro e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Centrifugare il tessuto a 500 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius e scartare il supernatante. Lavare i tessuti due volte con PBS ghiacciato integrato con 100 microgrammi per cicloesiuro millilitro.Aggiungere 500 microlitri di tampone dilisi cellulare integrati con quattro microlitri di inibitore della RNasi e pipetta su e giù per rimescolare il tessuto. Utilizzare un ago di insulina per liscigere delicatamente il tessuto. Quindi incubare sul ghiaccio per 10 minuti con un breve vortice ogni due o tre minuti.Dopo l'incubazione, centrifugare il lisato a 2000 x g per cinque minuti a quattro gradi Celsius e trasferire il supernatante in un nuovo tubo di centrifuga su ghiaccio. Ripetere questo processo ancora una volta centrifugando a 13.000 x g. Dopo aver trasferito il supernatante in un nuovo tubo di centrifuga sul ghiaccio, misurare la concentrazione di RNA nel lisato tissutale utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis.Caricare i campioni sopra i gradienti di saccarosio erogando lentamente il llysate alle pareti dei tubi ultracentrifugo. Posizionare delicatamente le sfumature di saccarosio nei secchi e ultracentrifugare i campioni a 190, 000 x g e quattro gradi Celsius per 90 minuti. Posizionare un tubo ultracentrifugo vuoto sul piercer del tubo e penetrare delicatamente nel tubo con l'ago dal basso.Riempire una siringa da 30 millilitri con 25 millilitri di soluzione di inseguimento al saccarosio al 60%. Quindi premere delicatamente la siringa in modo che la soluzione di inseguimento riempia il tubo vuoto e passa attraverso il monitor UV da 254 nanometri per impostare la linea di base per il rilevamento. Premere zero automatico sul monitor UV per registrare una linea di base per il rilevamento, quindi premere Riproduci sul software per iniziare la registrazione.Una volta che il sistema stabilisce una linea di base, sospendere la registrazione sul software e ritirare la soluzione di inseguimento, assicurandosi che non rimanga alcuna soluzione di inseguimento residua nel sistema. Caricare un tubo campione sul piercer del tubo e penetrare delicatamente nel tubo con l'ago dal basso. Inizia a registrare sul software, assicurati che non ci siano bolle d'aria nella linea.Quindi avviare la pompa della siringa e il raccoglitore di frazioni per raccogliere frazioni polisoma, impostando il frazionatore su 30 secondi. Raccogliere le frazioni in tubi da 1,5 millilitri. Il lisato corticale contenente RNA estratto da otto embrioni è stato separato da un gradiente di saccarosio in 12 frazioni.Picchi di assorbanza UV a 254 nanometri hanno identificato frazioni contenenti la subunità 40S 60S e il monosome 80S e i polisomei. L'analisi delle frazioni da parte della macchia occidentale per la grande subunità ribosomiale Rpl10 ha mostrato la sua presenza nei monosomi e nei polisomi della subunità 60S. Al contrario, le proteine citoplasmatiche Gapdh e Csde1, non erano associate ai ribosomi, ma erano arricchite in frazioni contenenti RNA libero.Coerentemente con la separazione delle proteine in diverse frazioni, gapdh e sox2 mRNA erano altamente arricchiti nelle frazioni contenenti polisomi pesanti, suggerendo che questi mRNA sono tradotti in modo efficiente nella corteccia in via di sviluppo. Al contrario, rpl7 e rpl35 mRNA sono stati arricchiti nella frazione contenente monosomi, suggerendo una traduzione repressa. Per ottenere risultati riproducibili, è importante mantenere la coerenza nella realizzazione di gradienti di saccarosio.Le pompe per siringhe devono essere utilizzate per espellere il saccarosio. Durante il frazionamento e la raccolta del campione, è importante lavare il sistema con acqua priva di RNasi. Ciò riduce il saccarosio residuo rimanente dal campione precedente.Questo metodo può essere utilizzato per valutare lo stato traslazionale degli mRNA in vari tessuti. Utilizzando la piattaforma, è possibile ottenere gradienti coerenti per la profilatura polisome, che fornisce una soluzione a basso costo per questa tecnica classica e utile.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

Analisi mosaico della funzione del gene nello sviluppo postnatale cervello di topo mediante virus basati su ricombinazione Cre

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when ...

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Neuroscienze

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In elettroporazione in vivo di Retina topo in via di sviluppo

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Single-cell Profiling dei neuroni retinici maturi e in sviluppo

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualizzazione e manipolazione genetica di dendriti e spine nella corteccia cerebrale e nell&#39;ippocampo mouse utilizzando<em&gt; In utero</em&gt; Elettroporazione

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Valutare progressione del ciclo cellulare delle staminali e cellule progenitrici del cervello di sviluppo del mouse dopo stress genotossico

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Immagini dal vivo della mitosi in via di sviluppo embrionali di topo Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imaging Fibre serotoninergici nel midollo spinale mouse Uso del CHIAREZZA / Tecnica CUBIC

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modellazione di infezione del Virus di Zika dello sviluppo del cervello umano In Vitro utilizzando cellule staminali derivate Organoids cerebrale

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

Quantificare la distribuzione eterogenea di una proteina sinaptica nel cervello del Mouse mediante immunofluorescenza

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Impianto cronico di tutto-corticale Electrocorticographic Array nel Marmoset comune

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...