Name: analysis of translation in the developing mouse brain using polysome profiling
Uploaded: 2021-05-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling at JoVE.com

이 작품은 NSERC 디스커버리 그랜트 (RGPIN/04246-2018에서 G.Y.에)에 의해 지원되었습니다. G.Y.는 캐나다 연구 위원장입니다. S.K.는 미틱스 글로벌잉크 대학원 펠로우십과 ACHRI 대학원 학생 장학금의 지원을 받았습니다.

모든 동물 사용은 캘거리 대학의 동물 관리위원회에 의해 감독되었습니다. 실험에 사용되는 CD1 마우스는 상용 벤더로부터 구입하였다.
1. 솔루션 준비
참고 RNA 분해를 방지하기 위해, 작업 벤치 및 RNase 오염 제거 솔루션으로 모든 장비를 스프레이합니다. RNase 가 없는 팁은 실험에 사용됩니다. 모든 솔루션은 RNase가 없는 물로 준비됩니다.
<ol><li>DMSO에서 ?...

<ol>
	<li>G&#246;tz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+neurogenesis.">The cell biology of neurogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).</li><li>Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+specification+of+neural+fates+by+transcription+factor+codes.">Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes.</a> Development. 134, 3771-3780 (2007).</li><li>Fiddes, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-Specific+NOTCH2NL+Genes+Affect+Notch+Signaling+and+Cortical+Neurogenesis.">Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis.</a> Cell. 173, 1356-1369 (2018).</li><li>Lennox, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+DDX3X+mutations+impair+RNA+metabolism+and+neurogenesis+during+fetal+cortical+development.">Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development.</a> Neuron. 106, 404-420 (2020).</li><li>Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+control+of+neurogenesis:+A+view+from+the+mammalian+cerebral+cortex.">Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359 (2012).</li><li>Amadei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Smaug2-based+translational+repression+complex+determines+the+balance+between+precursor+maintenance+versus+differentiation+during+mammalian+neurogenesis.">A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis.</a> Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).</li><li>Yang, G., Smibert, C. A., Kaplan, D. R., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+eIF4E1/4E-T+complex+determines+the+genesis+of+neurons+from+precursors+by+translationally+repressing+a+proneurogenic+transcription+program.">An eIF4E1/4E-T complex determines the genesis of neurons from precursors by translationally repressing a proneurogenic transcription program.</a> Neuron. 84, 723-739 (2014).</li><li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Glo1-Methylglyoxal+pathway+that+is+perturbed+in+maternal+diabetes+regulates+embryonic+and+adult+neural+stem+cell+pools+in+murine+offspring.">A Glo1-Methylglyoxal pathway that is perturbed in maternal diabetes regulates embryonic and adult neural stem cell pools in murine offspring.</a> Cell Reports. 17, 1022-1036 (2016).</li><li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+defined+neocortical+translation+and+polysome+assembly+are+determined+by+the+RNA-binding+protein+Hu+antigen+R.">Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).</li><li>Rodrigues, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylglyoxal+couples+metabolic+and+translational+control+of+Notch+signalling+in+mammalian+neural+stem+cells.">Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells.</a> Nature Communications. 11, 2018 (2020).</li><li>Iwasaki, S., Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+toolbox+for+protein+synthesis+studies.">The growing toolbox for protein synthesis studies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).</li><li>Chekulaeva, M., Landthaler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+on+translation.">Eyes on translation.</a> Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).</li><li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Selective+mRNA+Translation+in+Mammalian+Cells+by+Polysome+Profiling.">Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e52295 (2014).</li><li>Chass&#233;, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+using+polysome+profiling.">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45, 15 (2017).</li><li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin.">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).</li><li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamic+WNT3+secretion+spatiotemporally+regulates+the+neocortical+ribosome+signature+and+mRNA+translation+to+specify+neocortical+cell+subtypes.">Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes.</a> Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e51455 (2014).</li></ol>

다각형 프로파일링은 단일 유전자 및 게놈 전체 수준14 모두에서 번역 상태를 평가하는 데 일반적으로 사용되는 강력한 기술이다. 이 보고서에서는 홈어셈블 플랫폼과 개발 중인 마우스 피질을 분석하기 위한 응용 프로그램을 사용하여 다형성 프로파일링 프로토콜을 제시합니다. 이 비용 효율적인 플랫폼은 견고하고 재현 가능한 자당 그라데이션과 고감도의 다형성 프로파일링...

포유류 뇌의 발달 동안 신경 줄기 세포가 증식하고 분화하여 뉴런과 신경교1,2를 생성한다. 이 과정의 섭동은 많은 신경 발달 장애3,4에서볼 수 있듯이 뇌 구조 및 기능의 변경으로 이어질 수 있습니다. 신경 줄기 세포의 적절한 행동은 특정 유전자5의오케스트레이션된 발현을 요구한다. 이들 유전자의 후성유전학 및 전사적 대조가 집중적으로 연구되고 있는 반면, 최근 연구 결과에 따르면 다른 수준에서 유전자 조절은 신경줄기 세포 증식 및 분화6,7,8,9,10의조정에 기여한다는 것을 시사한다. 따라서, 번역 제어 프로그램을 해결 크게 신경 줄기 세포 운명 결정 및 뇌 개발의 기본 메커니즘의 우리의 이해를 향상 시킬 것 이다.
다른 강점을 가진 3개의 주요 기술은 리보솜 프로파일링, 리보솜 친화성 정화(TRAP) 및 다일부 프로파일링을 번역하는 것을 포함하여 mRNA의 번역 상태를 평가하기 위하여 널리 적용되었습니다. 리보솜 프로파일링은 RNA 시퀀싱을 사용하여 리보솜 보호 mRNA 단편을 결정하며, 각 성적증명서에 리보솜을 번역하는 리보솜의 수와 위치를 전 세계적으로 분석하여 성적증명서풍부(11)와비교하여 번역률을 간접적으로 추론할 수 있다. TRAP은 에피토프 태그리보솜 단백질을 활용하여 리보솜 바운드 mRNAs12를포획한다. 태그가 지정된 리보실 단백질이 유전적 접근법을 사용하여 특정 세포 유형으로 발현될 수 있다는 점을 감안할 때 TRAP은 세포 유형별 방식으로 번역을 분석할 수 있게 한다. 이에 비해, 자당 밀도 그라데이션 분획을 사용하여 리보솜(무거운 다각형)에 의해 능동적으로 번역되는 부분으로부터 자유롭고 제대로 번역되지 않은 부분(가벼운 모노좀)을 분리하는 다일부 프로파일링은 mRNA13에대한 리보솜 밀도를 직접 측정한다. 이 기술이 제공하는 한 가지 장점은 관심있는 특정 mRNA의 번역뿐만 아니라 게놈 전체 트랜스 라토메 분석14의번역을 연구하는 다재 다능함입니다.
이 논문에서, 우리는 개발 마우스 대뇌 피질을 분석하기 위해 다성 프로파일링의 상세한 프로토콜을 설명합니다. 당사는 홈어셈블 시스템을 사용하여 자당 밀도 그라데이션을 준비하고 다운스트림 응용 프로그램에 대한 분수를 수집합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 다른 유형의 조직 및 유기체를 분석하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL RNA free microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Greiner-Bio</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M MgCl2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21-23G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M KCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt end needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB2530/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>115-39-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 mouse</td>
			<td></td>
			<td>Charles River Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tip forceps</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#Z168785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td></td>
			<td>Sigma</td>
			<td>66-81-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition software TracerDAQ</td>
			<td>Measurement Computing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital converter</td>
			<td></td>
			<td>Measurement Computing</td>
			<td>USB-1208LS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA miniprep kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>R2070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>12-03-3483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No.5 forceps</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Model 2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-513-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear stage actuator</td>
			<td>Rattmmotor</td>
			<td>CBX1605-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase control RNA</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L4561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima first strand cDNA synthesis kit</td>
			<td>Themo Fisher</td>
			<td>M1681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature V-clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VH1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MSB7515/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series optical post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MS2R/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series pedestal post holder base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MBA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;12.7 mm aluminum post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TRA150/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa SYBR green fastmix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>CA101414-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>58-58-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RA90/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle &#216;1/2&#34; to &#216;6 mm post clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RA90TR/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase AWAY</td>
			<td>Molecular BioProducts</td>
			<td>7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free tips</td>
			<td>Frogga Bio</td>
			<td>FT10, FT200, FT1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free water</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>809-115-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim right-angle bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AB90B/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small V-clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VC1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>302-95-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper motor driver</td>
			<td>SongHe</td>
			<td>TB6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>57501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube piercer</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>BR-184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td></td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>L8-70M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO project super starter kit</td>
			<td>Elegoo</td>
			<td>EL-KIT-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV monitor</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>EM-1 Econo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VB01A/M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of translation in the developing mouse brain using polysome profiling

포유류 뇌의 적절한 개발은 신경 줄기 세포 증식 및 다른 신경 세포 유형으로 분화의 미세한 균형에 의존한다. 이 균형은 전사, 전사 후 및 번역을 포함하여 여러 수준에서 미세 조정되는 유전자 발현에 의해 엄격하게 제어됩니다. 이와 관련하여, 증거의 성장 몸은 신경 줄기 세포 운명 결정 조정에 번역 규제의 중요한 역할을 강조. 다일부 분획은 글로벌 및 개별 유전자 수준에서 mRNA 번역 상태의 평가를 위한 강력한 도구입니다. 여기에서, 우리는 발전마우스 대뇌 피질에서 세포의 번역 효율성을 평가하기 위하여 사내 polysome 프로파일링 파이프라인을 제시합니다. 우리는 자당 그라데이션 준비, 조직 용해, 초원심 분리 및 mRNA 번역 상태의 분획 기반 분석을위한 프로토콜을 설명합니다.

데모로서, 75 μg RNA를 포함하는 피질 용액(8개의 배아로부터 풀링)은 자당 그라데이션에 의해 12개의 분획으로 분리되었다. 254nm에서 UV 흡광도의 피크는 40S 서브유닛, 60S 서브유닛, 80S 단조및 다일부(도4A)를포함하는 분획을 확인하였다. 큰 리보솜 서브유닛에 대한 서쪽 블롯에 의한 분획의 분석은, Rpl10은 60S 하위 유닛(분획 3), 단음(분수 4) 및 다일부(분획 5-12)(도<strong class="xfig"...

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Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

포유류 뇌의 발달은 번역 수준에서 유전자 발현의 적절한 제어를 필요로한다. 여기서는 조립하기 쉬운 자당 그라데이션 및 분획 플랫폼을 갖춘 다각형 프로파일링 시스템을 사용하여 개발 중인 뇌에서 mRNA의 번역 상태를 평가합니다.

다각형 프로파일링을 사용하여 개발 마우스 뇌의 번역 분석

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

번역 조절은 뇌 발달에 중요한 역할을 합니다. 다각성 프로파일링은 mRNA의 번역 상태를 평가하는 유용하고 강력한 도구를 제공하여 뇌 발달 중에 번역 제어 기능을 검사할 수 있습니다. 이 방법은 자당 그라데이션을 만들고 다일부 분획을 평가하기 위한 쉽고 저렴한 접근 방식입니다.이 프로토콜에서, 개발 중인 마우스 피질을 분석하는 데 사용된다. 그러나 다른 시스템을 연구하기 위해 쉽게 적응할 수 있습니다. 먼저 2.2 어어 자당을 희석하여 6 개의 10 ~ 50 % 자당 그라데이션을 준비하십시오.30 밀리리터 주사기를 약 16밀리리터의 10% 자당으로 채우고 주사기 펌프에 놓고 바늘에 연결합니다. 주사기, 튜브 또는 바늘에 기포가 없는지 확인하고 바늘 끝을 닦아 잔류 용액을 제거하십시오. 바늘 의 끝이 하단에 튜브의 중심에 닿을 수 있도록 전동 단계를 이동합니다.주사기 펌프를 분당 2밀리리터의 유량으로 설정하여 2.3밀리리터의 부피를 설정합니다. 10% 자당 용액의 2.3 밀리리터를 분배한 후, 전동 스테이지를 아래로 이동하고 6개의 그라데이션 모두에 대한 프로세스를 반복합니다. 그런 다음 튜브 바닥에 20% 자당 용액을 넣고 12일째에 CD1 마우스 배아를 수집하고 얼음에 차가운 HBSS를 함유한 10센티미터 플레이트에 넣습니다.해부 범위하에서, 얼음 차가운 HBSS를 포함하는 6센티미터 판으로 1개의 태아를 전송합니다. 21~23게이지 바늘을 사용하여 45도 각도로 눈을 관통하여 머리의 위치를 고정하고 바늘이 플레이트에 고정되도록 힘을 가하십시오. 5번 포셉을 사용하여 가운데에서 측면으로 작동하는 피부와 두개골을 제거한 다음 후각 전구를 자르고 수막을 제거하여 피질 조직을 노출합니다.곡선 된 집게를 사용하여 얼음에 신경 물질 매체의 2 ~ 3 밀리리터로 피질 조직을 잘라. 필요에 따라 다른 배아에서 조직을 당깁니다. 8에서 10개의 태아에서 조직은 일반적으로 총 RNA의 대략 200 마이크로그램을 줍니다.해부된 조직을 가진 신경 물질 배지에 사이클로헨시미드를 넣고 밀리리터당 100 마이크로그램의 최종 농도를, 10분 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. 티슈는 500 x g에서 섭씨 4도에서 5분간 원심분리하고 상체를 폐기합니다. 밀리리터 사이클로헤시미드당 100 마이크로그램으로 보충된 얼음 차가운 PBS로 조직을 두 번 씻으시다.조직을 다시 억제하기 위해 RNase 억제제와 파이펫의 4개의 마이크로리터로 보충된 세포 용해 완충제 500마이크로리터를 추가합니다. 인슐린 바늘을 사용하여 조직을 부드럽게 lyse하십시오. 그런 다음 2~3분마다 간단한 소용돌이로 10분 간 얼음에 배양합니다.인큐베이션 후, 1심분리는 섭씨 4도에서 5분간 2000 x g의 lysate을 원심분리하고 상류체를 얼음 위에 새로운 원심분리기 튜브로 옮긴다. 이 프로세스를 13, 000 x g에서 원심 분리한 후 한 번 더 반복합니다. 얼음에 새로운 원심분리기 튜브로 상체를 옮김한 후 UV-Vis 분광광계를 사용하여 조직의 RNA 농도를 측정합니다.초원심분리기 튜브의 벽에 리자테를 천천히 분배하여 자당 그라데이션 위에 샘플을 적재합니다. 자당 그라데이션을 양동이에 부드럽게 놓고 샘플을 190, 000 x g 및 섭씨 4도에서 90 분 동안 초원심 분리합니다. 튜브 피어서에 빈 초원심분리기 튜브를 놓고 바닥에서 바늘로 튜브를 부드럽게 관통합니다.30 밀리리터 주사기를 60% 자당 추적 용액의 25 밀리리터로 채웁니다. 그런 다음 주사기를 부드럽게 눌러 서채용이 빈 튜브를 채우고 254 나노미터 UV 모니터를 통과하여 검출기준을 설정합니다. UV 모니터에서 자동 0을 눌러 감지 기준선을 등록한 다음 소프트웨어에서 재생을 눌러 녹화를 시작합니다.시스템이 기준선을 설정하면 소프트웨어에서 레코딩을 일시 중지하고 추적 솔루션을 철회하여 잔류 추적 솔루션이 시스템에 남아 있지 않도록 합니다. 튜브 피어서에 샘플 튜브 하나를 로드하고 부드럽게 바닥에서 바늘로 튜브를 관통. 소프트웨어에 녹음을 시작, 라인에 기포가 없는지 확인합니다.그런 다음 주사기 펌프와 분획 수집기를 시작하여 다각형 분획을 수집하여 분수를 30초로 설정합니다. 1.5 밀리리터 튜브로 분수를 수집합니다. 8개의 배아에게서 뽑아낸 RNA를 포함하는 피질 리세트는 12개의 분획으로 자당 그라데이션에 의해 분리되었다.254 나노미터에서 UV 흡광도의 피크는 40S 하위 유닛 60S 하위 단위 및 80S 단조및 다낭을 포함하는 분획을 확인했습니다. 큰 리보솜 서브유닛 Rpl10에 대한 서양 블롯에 의한 분획의 분석은 60S 서브유닛 단조및 다일부에서의 존재를 나타냈다. 대조적으로, 세포질 단백질, Gapdh 및 Csde1는 리보솜과 연관되지 않았지만, 자유 RNA를 포함하는 분수에서 풍부하게 되었다.다른 분획에서 단백질의 분리와 일치, Gapdh와 sox2 mRNAs는 무거운 폴리좀을 포함하는 분획에서 높게 농축되었다, 이러한 mRNAs는 개발 피질에서 효율적으로 번역되는 것을 시사. 대조적으로, rpl7 및 rpl35 mRNAs는 단량체를 포함하는 분획에서 풍부하게 되었다, 억압된 번역을 건의합니다. 재현 가능한 결과를 얻으려면 자당 그라데이션을 만드는 데 일관성을 유지하는 것이 중요합니다.주사기 펌프는 자당을 배출하는 데 사용해야합니다. 분수 및 샘플 수집 중에 RNase가 없는 물로 시스템을 세척하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 이전 샘플에서 남은 잔류 자당이 줄어듭니다.이 방법은 다양한 조직에서 mRNA의 번역 상태를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 플랫폼을 사용하면 다각형 프로파일링을 위한 일관된 그라데이션을 얻을 수 있으며, 이 고전적인 유용한 기술에 대한 저비용 솔루션을 제공합니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

바이러스 기반 Cre 호텔의 재조합을 사용하여 출생 후의 마우스 두뇌 개발의 유전자 기능의 모자이크 분석

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when ...

연구

신경과학

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

개발 마우스 망막의 생체내 Electroporation에

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

개발하고 성숙한 망막 신경 세포의 단일 세포 프로 파일링

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

사용하는 마우스 대뇌 피질과 해마의 시각화 및 Dendrites와 쪽이의 유전자 조작<em&gt; utero에서</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

유전자 독성 스트레스 후 신경 줄기 및 마우스 두뇌 개발의 전구 세포의 사정 세포주기의 진행 상황

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

개발 마우스 배아의 피질 유사 분열의 라이브 영상

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

CLARITY를 사용하여 마우스 척수에서 세로토닌 섬유 이미징 / CUBIC 기술

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

대뇌 Organoids 파생 Zika 바이러스 감염 개발 인간의 두뇌에는 생체 외에서 줄기 세포를 사용 하 여 모델링

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

면역 형광 검사를 사용 하 여 마우스 뇌의 시 냅 스 단백질의 다른 유형의 분포를 측정

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

일반적인 마모 셋에 전체 피 질 Electrocorticographic 배열의 만성 이식

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...