Name: analysis of translation in the developing mouse brain using polysome profiling
Uploaded: 2021-05-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling at JoVE.com

Dette arbeidet ble finansiert av et NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018 til G.Y.). G.Y. er en canada forskningsleder. S.K. ble finansiert av Mitacs Globalink Graduate Fellowship og ACHRI Graduate Student Scholarship.

All dyrebruk ble overvåket av Dyrepleiekomiteen ved Universitetet i Calgary. CD1-mus som ble brukt til eksperimentet ble kjøpt fra kommersiell leverandør.
1. Utarbeidelse av løsninger
MERK For å unngå nedbrytning av RNA, spray arbeidsbenk og alt utstyr med RNase dekontamineringsløsning. RNase-frie tips brukes til eksperimentet. Alle løsninger tilberedes i RNase-fritt vann.
<ol><li>Klargjør cycloheximid lageroppløsning (100 mg/ml) i DMSO og oppbevar ved -...

<ol>
	<li>G&#246;tz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+neurogenesis.">The cell biology of neurogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).</li><li>Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+specification+of+neural+fates+by+transcription+factor+codes.">Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes.</a> Development. 134, 3771-3780 (2007).</li><li>Fiddes, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-Specific+NOTCH2NL+Genes+Affect+Notch+Signaling+and+Cortical+Neurogenesis.">Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis.</a> Cell. 173, 1356-1369 (2018).</li><li>Lennox, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+DDX3X+mutations+impair+RNA+metabolism+and+neurogenesis+during+fetal+cortical+development.">Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development.</a> Neuron. 106, 404-420 (2020).</li><li>Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+control+of+neurogenesis:+A+view+from+the+mammalian+cerebral+cortex.">Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359 (2012).</li><li>Amadei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Smaug2-based+translational+repression+complex+determines+the+balance+between+precursor+maintenance+versus+differentiation+during+mammalian+neurogenesis.">A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis.</a> Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).</li><li>Yang, G., Smibert, C. A., Kaplan, D. R., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+eIF4E1/4E-T+complex+determines+the+genesis+of+neurons+from+precursors+by+translationally+repressing+a+proneurogenic+transcription+program.">An eIF4E1/4E-T complex determines the genesis of neurons from precursors by translationally repressing a proneurogenic transcription program.</a> Neuron. 84, 723-739 (2014).</li><li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Glo1-Methylglyoxal+pathway+that+is+perturbed+in+maternal+diabetes+regulates+embryonic+and+adult+neural+stem+cell+pools+in+murine+offspring.">A Glo1-Methylglyoxal pathway that is perturbed in maternal diabetes regulates embryonic and adult neural stem cell pools in murine offspring.</a> Cell Reports. 17, 1022-1036 (2016).</li><li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+defined+neocortical+translation+and+polysome+assembly+are+determined+by+the+RNA-binding+protein+Hu+antigen+R.">Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).</li><li>Rodrigues, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylglyoxal+couples+metabolic+and+translational+control+of+Notch+signalling+in+mammalian+neural+stem+cells.">Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells.</a> Nature Communications. 11, 2018 (2020).</li><li>Iwasaki, S., Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+toolbox+for+protein+synthesis+studies.">The growing toolbox for protein synthesis studies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).</li><li>Chekulaeva, M., Landthaler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+on+translation.">Eyes on translation.</a> Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).</li><li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Selective+mRNA+Translation+in+Mammalian+Cells+by+Polysome+Profiling.">Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e52295 (2014).</li><li>Chass&#233;, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+using+polysome+profiling.">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45, 15 (2017).</li><li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin.">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).</li><li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamic+WNT3+secretion+spatiotemporally+regulates+the+neocortical+ribosome+signature+and+mRNA+translation+to+specify+neocortical+cell+subtypes.">Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes.</a> Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e51455 (2014).</li></ol>

Polysomprofilering er en vanlig brukt og kraftig teknikk for å vurdere oversettelsesstatusen på både enkeltgen og genom-brede nivåer14 . I denne rapporten presenterer vi en protokoll for polysome profilering ved hjelp av en hjemmemontert plattform og dens anvendelse for å analysere den utviklende musebarken. Denne kostnadseffektive plattformen er enkel å montere og generere robuste, reproduserbare sukrosegradienter og polysomprofilering med høy følsomhet.
Det er...

Under utviklingen av pattedyrhjernen sprer nevrale stamceller seg og differensierer for å generere nevroner og glia1,2 . Perturbasjonen av denne prosessen kan føre til endringer i hjernestruktur og funksjon, som sett i mange nevrodevelopmentale lidelser3,4. Riktig oppførsel av nevrale stamceller krever orkestrert uttrykk for spesifikke gener5. Mens den epigenetiske og transkripsjonelle kontrollen av disse genene har blitt intensivt studert, tyder nyere funn på at genregulering på andre nivåer også bidrar til koordinering av nevral stamcelleproliferasjon og differensiering6,7,8,9,10. Dermed vil adressering av oversettelseskontrollprogrammene i stor grad fremme vår forståelse av mekanismene som ligger til grunn for nevral stamcelle skjebnebeslutning og hjerneutvikling.
Tre hovedteknikker med forskjellige styrker har blitt mye brukt for å vurdere oversettelsesstatusen til mRNA, inkludert ribosomprofilering, oversettelse av ribosole affinitetsrensing (TRAP) og polysomprofilering. Ribosomprofilering bruker RNA-sekvensering for å bestemme ribosombeskyttede mRNA-fragmenter, slik at den globale analysen av antall og plassering av oversettelse av ribosomer på hver transkripsjon indirekte utleder oversettelsesraten ved å sammenligne den med transkripsjonsoverflod11. TRAP utnytter epitopmerkede ribosomale proteiner for å fange ribososombundne mRNAer12. Gitt at de taggede ribosomale proteinene kan uttrykkes i bestemte celletyper ved hjelp av genetiske tilnærminger, tillater TRAP analyse av oversettelse på en celletypespesifikk måte. Til sammenligning gir polysomprofilering, som bruker sukrose tetthet gradient fraksjonering for å skille fri og dårlig oversatt del (lettere monosomer) fra de som blir aktivt oversatt av ribosomer (tyngre polysomer), en direkte måling av ribosomtetthet på mRNA13. En fordel denne teknikken tilbyr er allsidigheten til å studere oversettelsen av spesifikk mRNA av interesse samt genom-bred translatomanalyse14.
I dette dokumentet beskriver vi en detaljert protokoll for polysome profilering for å analysere den utviklende musen cerebral cortex. Vi bruker et hjemmemontert system for å forberede sukrosetetthetsgradienter og samle fraksjoner for nedstrømsapplikasjoner. Protokollen som presenteres her kan enkelt tilpasses for å analysere andre typer vev og organismer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL RNA free microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Greiner-Bio</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M MgCl2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21-23G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M KCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt end needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB2530/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>115-39-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 mouse</td>
			<td></td>
			<td>Charles River Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tip forceps</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#Z168785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td></td>
			<td>Sigma</td>
			<td>66-81-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition software TracerDAQ</td>
			<td>Measurement Computing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital converter</td>
			<td></td>
			<td>Measurement Computing</td>
			<td>USB-1208LS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA miniprep kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>R2070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>12-03-3483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No.5 forceps</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Model 2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-513-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear stage actuator</td>
			<td>Rattmmotor</td>
			<td>CBX1605-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase control RNA</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L4561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima first strand cDNA synthesis kit</td>
			<td>Themo Fisher</td>
			<td>M1681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature V-clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VH1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MSB7515/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series optical post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MS2R/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series pedestal post holder base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MBA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;12.7 mm aluminum post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TRA150/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa SYBR green fastmix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>CA101414-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>58-58-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RA90/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle &#216;1/2&#34; to &#216;6 mm post clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RA90TR/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase AWAY</td>
			<td>Molecular BioProducts</td>
			<td>7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free tips</td>
			<td>Frogga Bio</td>
			<td>FT10, FT200, FT1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free water</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>809-115-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim right-angle bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AB90B/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small V-clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VC1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>302-95-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper motor driver</td>
			<td>SongHe</td>
			<td>TB6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>57501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube piercer</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>BR-184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td></td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>L8-70M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO project super starter kit</td>
			<td>Elegoo</td>
			<td>EL-KIT-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV monitor</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>EM-1 Econo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VB01A/M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of translation in the developing mouse brain using polysome profiling

Den riktige utviklingen av pattedyrhjernen er avhengig av en fin balanse mellom nevral stamcelleproliferasjon og differensiering i forskjellige nevrale celletyper. Denne balansen styres tett av genuttrykk som er finjustert på flere nivåer, inkludert transkripsjon, posttranskripsjon og oversettelse. I denne forbindelse fremhever en voksende mengde bevis en kritisk rolle i oversettelsesreguleringen i koordinering av nevrale stamcelle skjebnebeslutninger. Polysom fraksjonering er et kraftig verktøy for vurdering av mRNA oversettelsesstatus på både globale og individuelle gennivåer. Her presenterer vi en intern polysomprofileringsrørledning for å vurdere translasjonseffektivitet i celler fra den utviklende musen cerebral cortex. Vi beskriver protokollene for sukrose gradient forberedelse, vev lysis, ultracentrifugation og fraksjonering-basert analyse av mRNA oversettelsesstatus.

Som en demonstrasjon ble det kortikale lysatet som inneholder 75 μg RNA (samlet fra 8 embryoer) skilt av sukrosegradienten i 12 fraksjoner. Topper av UV-absorbans ved 254 nm identifiserte brøker som inneholder 40S-underenheten, 60S-underenheten, 80S monosom og polysomer (Figur 4A). Analyse av brøker ved vestlig blot for den store ribosomale underenheten, Rpl10 viste sin tilstedeværelse i 60S-underenheten (brøkdel 3), monosom (brøkdel 4) og polysomer (brøker 5-12) (<strong class="xfig"...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling at JoVE.com

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

Utviklingen av pattedyrhjernen krever riktig kontroll av genuttrykk på oversettelsesnivå. Her beskriver vi et polysome profileringssystem med en lettmontert sukrose gradient-making og fraksjoneringsplattform for å vurdere oversettelsesstatusen til mRNAer i den utviklende hjernen.

Analyse av oversettelse i den utviklende musehjernen ved hjelp av polysome profilering

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

Translasjonsregulering spiller en viktig rolle i hjerneutviklingen. Polysomprofilering gir et nyttig og kraftig verktøy for å vurdere oversettelsesstatusen til mRNA, noe som gjør det mulig å undersøke translasjonskontrollfunksjoner under hjerneutvikling. Denne metoden er en enkel og rimelig tilnærming for å lage sukrose gradienter og vurdere polysom fraksjonering.I denne protokollen brukes den til å analysere den utviklende musebarken. Det kan imidlertid enkelt tilpasses for å studere andre systemer. Begynn med å fortynne 2,2 molar sukrose for å forberede seks 10 til 50% sukrose gradienter.Fyll en 30 milliliter sprøyte med ca. 16 milliliter 10% sukrose, legg den på sprøytepumpen og koble den til nålen. Pass på at det ikke er noen luftbobler i sprøyten, slangen eller nålen, og tørk av nålens spiss for å fjerne restløsning. Beveg det motoriserte stadiet opp slik at spissen av nålen berører midten av røret nederst.Sett sprøytepumpen til en strømningshastighet på to milliliter per minutt for et volum på 2,3 milliliter. Etter å ha dispensert 2,3 milliliter 10% sukroseløsning, flytt ned det motoriserte stadiet og gjenta prosessen for alle seks gradienter. Tilsett deretter 20% sukroseløsning til bunnen av rørene etterfulgt av 30, 40 og 50%Samle CD1 museembryoer på embryonal dag 12 og legg dem i en 10 centimeter plate som inneholder iskald HBSS på is.Under disseksjonsområdet overfører du ett embryo til en seks centimeter plate som inneholder iskald HBSS. Bruk 21 til 23 gauge nåler for å fikse posisjonen til hodet ved å trenge gjennom øynene i en 45 graders vinkel og bruke en kraft for å sikre at nålene er festet på platen. Bruk nummer fem tang for å fjerne huden og skallen som arbeider fra midten til sidene, klipp deretter de olfaktoriske pærene og fjern meningene for å eksponere kortikale vev.Bruk buede tang for å kutte kortikale vev i to til tre milliliter nevrobasal medium på is. Trekk vevet fra forskjellige embryoer etter behov. Vev fra åtte til ti embryoer gir vanligvis ca. 200 mikrogram totalt RNA.Tilsett cycloheximide til nevrobasalmediet med dissekert vev til en endelig konsentrasjon på 100 mikrogram per milliliter og inkuber ved 37 grader Celsius i 10 minutter. Sentrifuger vevet ved 500 x g i fem minutter ved fire grader Celsius og kast supernatanten. Vask vevet to ganger med iskald PBS supplert med 100 mikrogram per milliliter cycloheximid.Tilsett 500 mikroliter cellelysbuffer supplert med fire mikroliter RNase-hemmer og pipette opp og ned for å resuspendere vevet. Bruk en insulinnål til å lyse vevet forsiktig. Deretter inkuberer du på is i 10 minutter med korte virveler hvert annet til tredje minutt.Etter inkubasjonen sentrifugerer du lysatet ved 2000 x g i fem minutter ved fire grader Celsius og overfører supernatanten til et nytt sentrifugerør på is. Gjenta denne prosessen igjen sentrifugering ved 13.000 x g. Etter å ha overført supernatanten til et nytt sentrifugerør på is, måler du RNA-konsentrasjonen i vevslyset ved hjelp av et UV-Vis spektrofotometer.Last prøvene på toppen av sukrosegradientene ved å sakte dispensere lysatet til veggene i ultracentrifuge rørene. Plasser forsiktig sukrosegradientene i bøttene og ultracentrifuge prøvene ved 190,000 x g og fire grader Celsius i 90 minutter. Plasser et tomt ultracentrifuge rør på rørboret og penetrer forsiktig røret med nålen fra bunnen.Fyll en 30 milliliter sprøyte med 25 milliliter 60% sukrose jaktløsning. Trykk deretter forsiktig på sprøyten slik at jaktløsningen fyller det tomme røret og går gjennom UV-skjermen på 254 nanometer for å stille inn grunnlinjen for deteksjon. Trykk automatisk null på UV-skjermen for å registrere en grunnlinje for gjenkjenning, og trykk deretter spill av på programvaren for å starte innspillingen.Når systemet etablerer en basislinje, pauser du opptaket på programvaren og trekker tilbake jaktløsningen, og sørger for at ingen gjenværende jaktløsning forblir i systemet. Last ett prøverør på rørboret og penetrer forsiktig røret med nålen fra bunnen. Begynn å spille inn på programvaren, sørg for at det ikke er noen luftbobler i linjen.Start deretter sprøytepumpen og fraksjonssamleren for å samle polysome fraksjoner, og sett fraksjonatoren til 30 sekunder. Samle fraksjonene i 1,5 milliliter rør. Det kortikale lysatet som inneholder RNA trukket fra åtte embryoer ble skilt av en sukrosegradient i 12 fraksjoner.Topper av UV-absorbans ved 254 nanometer identifiserte fraksjoner som inneholder 40S subenhet 60S subenhet og 80S monosom og polysomer. Analyse av fraksjonene av vestlig blot for den store ribosomale underenheten Rpl10 viste sin tilstedeværelse i 60S subenhet monosomer og polysomer. I motsetning var cytoplasmatiske proteiner, Gapdh og Csde1, ikke forbundet med ribosomer, men ble beriket i fraksjoner som inneholder fri RNA.I samsvar med separasjonen av proteiner i forskjellige fraksjoner, ble Gapdh og sox2 mRNAer sterkt beriket i fraksjonene som inneholder tunge polysomer, noe som tyder på at disse mRNAene effektivt oversettes i utviklingsbarken. I motsetning til dette ble rpl7 og rpl35 mRNAer beriket i fraksjonen som inneholdt monosomer, noe som tyder på undertrykt oversettelse. For å oppnå reproduserbare resultater er det viktig å opprettholde konsistensen i å lage sukrose gradienter.Sprøytepumpene skal brukes til å løse ut sukrose. Under fraksjonering og prøvetaking er det viktig å vaske systemet med RNase-fritt vann. Dette reduserer eventuell gjenværende sukrose som gjenstår fra forrige prøve.Denne metoden kan brukes til å vurdere oversettelsesstatusen til mRNAer i ulike vev. Ved hjelp av plattformen kan konsekvente gradienter for polysomeprofilering oppnås, noe som gir en rimelig løsning for denne klassiske og nyttige teknikken.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Encellet Profiling for å utvikle og modne Retinal Neurons

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisering og genetisk manipulering av dendritter og pigger i Mus hjernebarken og hippocampus hjelp<em&gt; I fosterlivet</em&gt; Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Vurdere Cell Cycle Progresjon av Neural Stem og stamceller i mus utvikling av hjernen etter Gentoksisk Stress

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Levende Imaging av Mitosis i utviklings Mouse Embryonic Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imaging Serotonerge Fibers i Mouse Spinal Cord Bruke CLARITY / CUBIC Technique

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modellering Zika virusinfeksjon på utvikle menneskelige hjerne In Vitro bruke stilk cellen avledet Cerebral Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

Kvantifisere heterogene distribusjon av et Synaptic Protein i musen hjernen ved hjelp av Immunofluorescence

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Kronisk implantering av hele-kortikale Electrocorticographic matrise i den vanlige Marmoset

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...