Name: analysis of translation in the developing mouse brain using polysome profiling
Uploaded: 2021-05-22T14:00:00
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Este trabalho foi financiado por um NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018 para G.Y.). G.Y. é uma cadeira de pesquisa do Canadá. A S.K. foi financiada pela Mitacs Globalink Graduate Fellowship e pela ACHRI Graduate Student Scholarship.

Todo o uso de animais foi supervisionado pelo Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Calgary. Os camundongos CD1 usados para o experimento foram comprados de fornecedor comercial.
1. Preparação de soluções
NOTA Para evitar a degradação do RNA, pulverizar bancada e todos os equipamentos com solução de descontaminação RNase. Dicas sem RNase são usadas para o experimento. Todas as soluções são preparadas em água sem RNase.
<ol><li>Prepare a...

<ol>
	<li>G&#246;tz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+neurogenesis.">The cell biology of neurogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).</li><li>Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+specification+of+neural+fates+by+transcription+factor+codes.">Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes.</a> Development. 134, 3771-3780 (2007).</li><li>Fiddes, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-Specific+NOTCH2NL+Genes+Affect+Notch+Signaling+and+Cortical+Neurogenesis.">Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis.</a> Cell. 173, 1356-1369 (2018).</li><li>Lennox, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+DDX3X+mutations+impair+RNA+metabolism+and+neurogenesis+during+fetal+cortical+development.">Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development.</a> Neuron. 106, 404-420 (2020).</li><li>Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+control+of+neurogenesis:+A+view+from+the+mammalian+cerebral+cortex.">Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359 (2012).</li><li>Amadei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Smaug2-based+translational+repression+complex+determines+the+balance+between+precursor+maintenance+versus+differentiation+during+mammalian+neurogenesis.">A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis.</a> Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).</li><li>Yang, G., Smibert, C. A., Kaplan, D. R., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+eIF4E1/4E-T+complex+determines+the+genesis+of+neurons+from+precursors+by+translationally+repressing+a+proneurogenic+transcription+program.">An eIF4E1/4E-T complex determines the genesis of neurons from precursors by translationally repressing a proneurogenic transcription program.</a> Neuron. 84, 723-739 (2014).</li><li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Glo1-Methylglyoxal+pathway+that+is+perturbed+in+maternal+diabetes+regulates+embryonic+and+adult+neural+stem+cell+pools+in+murine+offspring.">A Glo1-Methylglyoxal pathway that is perturbed in maternal diabetes regulates embryonic and adult neural stem cell pools in murine offspring.</a> Cell Reports. 17, 1022-1036 (2016).</li><li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+defined+neocortical+translation+and+polysome+assembly+are+determined+by+the+RNA-binding+protein+Hu+antigen+R.">Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).</li><li>Rodrigues, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylglyoxal+couples+metabolic+and+translational+control+of+Notch+signalling+in+mammalian+neural+stem+cells.">Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells.</a> Nature Communications. 11, 2018 (2020).</li><li>Iwasaki, S., Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+toolbox+for+protein+synthesis+studies.">The growing toolbox for protein synthesis studies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).</li><li>Chekulaeva, M., Landthaler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+on+translation.">Eyes on translation.</a> Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).</li><li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Selective+mRNA+Translation+in+Mammalian+Cells+by+Polysome+Profiling.">Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e52295 (2014).</li><li>Chass&#233;, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+using+polysome+profiling.">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45, 15 (2017).</li><li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin.">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).</li><li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamic+WNT3+secretion+spatiotemporally+regulates+the+neocortical+ribosome+signature+and+mRNA+translation+to+specify+neocortical+cell+subtypes.">Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes.</a> Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e51455 (2014).</li></ol>

O perfil polimento é uma técnica comumente usada e poderosa para avaliar o status translacional nos níveis de gene único e genoma14 . Neste relatório, apresentamos um protocolo de perfil polisome utilizando uma plataforma montada em casa e seu aplicativo para analisar o córtex do mouse em desenvolvimento. Esta plataforma econômica é fácil de montar e gerar gradientes robustos e reprodutíveis de sacarose e perfil polisso com alta sensibilidade.
Vale ressaltar q...

Durante o desenvolvimento do cérebro mamífero, as células-tronco neurais proliferam e se diferenciam para gerar neurônios e glia1,2 . A perturbação desse processo pode levar a alterações na estrutura e função cerebral, como visto em muitos distúrbios neurodesenvolvimentos3,4. O comportamento adequado das células-tronco neurais requer a expressão orquestrada de genes específicos5. Embora o controle epigenético e transcricional desses genes tenha sido intensamente estudado, achados recentes sugerem que a regulação genética em outros níveis também contribui para a coordenação da proliferação e diferenciação de células-tronco neurais6,7,8,9,10. Assim, abordar os programas de controle translacional avançará muito nossa compreensão dos mecanismos subjacentes à decisão do destino das células-tronco neurais e ao desenvolvimento cerebral.
Três técnicas principais com diferentes pontos fortes foram amplamente aplicadas para avaliar o status translacional do mRNA, incluindo perfil ribossomo, tradução de purificação de afinidade ribossosome (TRAP) e perfil de polimento. O perfil ribossomo usa sequenciamento de RNA para determinar fragmentos de mRNA protegidos por ribossomo, permitindo a análise global do número e localização da tradução de ribossomos em cada transcrição para inferir indiretamente a taxa de tradução, comparando-a à transcrição11. TRAP aproveita as proteínas ribossômicas marcadas por epitope para capturar mRNAs12com limite ribossomo . Dado que as proteínas ribossômicas marcadas podem ser expressas em tipos de células específicas usando abordagens genéticas, o TRAP permite a análise da tradução de forma específica do tipo celular. Em comparação, o perfil polissário, que usa fracionamento de gradiente de densidade de sacarose para separar porção livre e mal traduzida (monossomos mais leves) daqueles que estão sendo ativamente traduzidos por ribossomos (polissomos mais pesados), fornece uma medição direta da densidade ribossomo no mRNA13. Uma vantagem que essa técnica oferece é sua versatilidade para estudar a tradução de mRNA específico de interesse, bem como análise de translatome em todo o genoma14.
Neste artigo, descrevemos um protocolo detalhado de perfil polisso para analisar o córtex cerebral do camundongo em desenvolvimento. Usamos um sistema montado em casa para preparar gradientes de densidade de sacarose e coletar frações para aplicações a jusante. O protocolo aqui apresentado pode ser adaptado facilmente para analisar outros tipos de tecidos e organismos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL RNA free microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Greiner-Bio</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M MgCl2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21-23G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M KCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt end needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB2530/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>115-39-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 mouse</td>
			<td></td>
			<td>Charles River Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tip forceps</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#Z168785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td></td>
			<td>Sigma</td>
			<td>66-81-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition software TracerDAQ</td>
			<td>Measurement Computing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital converter</td>
			<td></td>
			<td>Measurement Computing</td>
			<td>USB-1208LS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA miniprep kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>R2070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>12-03-3483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No.5 forceps</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Model 2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-513-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear stage actuator</td>
			<td>Rattmmotor</td>
			<td>CBX1605-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase control RNA</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L4561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima first strand cDNA synthesis kit</td>
			<td>Themo Fisher</td>
			<td>M1681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature V-clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VH1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MSB7515/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series optical post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MS2R/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series pedestal post holder base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MBA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;12.7 mm aluminum post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TRA150/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa SYBR green fastmix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>CA101414-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>58-58-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RA90/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle &#216;1/2&#34; to &#216;6 mm post clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RA90TR/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase AWAY</td>
			<td>Molecular BioProducts</td>
			<td>7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free tips</td>
			<td>Frogga Bio</td>
			<td>FT10, FT200, FT1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free water</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>809-115-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim right-angle bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AB90B/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small V-clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VC1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>302-95-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper motor driver</td>
			<td>SongHe</td>
			<td>TB6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>57501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube piercer</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>BR-184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td></td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>L8-70M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO project super starter kit</td>
			<td>Elegoo</td>
			<td>EL-KIT-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV monitor</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>EM-1 Econo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VB01A/M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of translation in the developing mouse brain using polysome profiling

O desenvolvimento adequado do cérebro mamífero depende de um bom equilíbrio de proliferação de células-tronco neurais e diferenciação em diferentes tipos de células neurais. Esse equilíbrio é fortemente controlado pela expressão genética que é ajustada em vários níveis, incluindo transcrição, pós-transcrição e tradução. Nesse sentido, um conjunto crescente de evidências destaca um papel crítico da regulação translacional na coordenação das decisões de destino das células-tronco neurais. O fracionamento polissário é uma ferramenta poderosa para a avaliação do status translacional mRNA em níveis genéticos globais e individuais. Aqui, apresentamos um pipeline de perfil de polimento interno para avaliar a eficiência translacional nas células do córtex cerebral do camundongo em desenvolvimento. Descrevemos os protocolos de preparação de gradiente de sacarose, lise tecidual, ultracentrifugação e análise baseada em fracionamento do status translacional mRNA.

Como demonstração, o lysato cortical contendo 75 μg de RNA (agrupado de 8 embriões) foi separado pelo gradiente de sacarose em 12 frações. Picos de absorvância UV a 254 nm identificaram frações contendo a subunidade 40S, subunidade 60S, monossóis 80S e polisomáticos(Figura 4A). Análise de frações por mancha ocidental para a grande subunidade ribossômica, Rpl10 mostrou sua presença na subunidade 60S (fração 3), monossóica (fração 4) e polisomas (frações 5-12)<strong cla...

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Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

O desenvolvimento do cérebro mamífero requer o controle adequado da expressão genética no nível da tradução. Aqui, descrevemos um sistema de perfil polisso com uma plataforma de gradiente e fracionamento de sacarose fácil de montar para avaliar o status translacional de mRNAs no cérebro em desenvolvimento.

Análise da tradução no cérebro do rato em desenvolvimento usando perfil polino

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

A regulação translacional desempenha um papel importante no desenvolvimento cerebral. O perfil polimento fornece uma ferramenta útil e poderosa para avaliar o status translacional do mRNA, possibilitando examinar as funções de controle translacional durante o desenvolvimento cerebral. Este método é uma abordagem fácil e de baixo custo para fazer gradientes de sacarose e avaliar fracionamento polissó.Neste protocolo, é usado para analisar o córtex do rato em desenvolvimento. No entanto, pode ser facilmente adaptado para estudar outros sistemas. Comece diluindo 2,2 sacarose molar para preparar seis gradientes de 10 a 50%.Encha uma seringa de 30 mililitros com aproximadamente 16 mililitros de 10% de sacarose, coloque-a na bomba de seringa e conecte-a à agulha. Certifique-se de que não há bolhas de ar na seringa, tubo ou agulha, e limpe a ponta da agulha para remover qualquer solução residual. Mova o estágio motorizado para cima de tal forma que a ponta da agulha toque o centro do tubo na parte inferior.Ajuste a bomba de seringa a uma taxa de fluxo de dois mililitros por minuto para um volume de 2,3 mililitros. Depois de distribuir 2,3 mililitros de solução de 10% de sacarose, mova-se para baixo do estágio motorizado e repita o processo para todos os seis gradientes. Em seguida, adicione 20% de solução de sacarose ao fundo dos tubos seguido por 30, 40 e 50% Colete embriões de camundongos CD1 no dia 12 embrionário e coloque-os em uma placa de 10 centímetros contendo HBSS gelado no gelo.Sob o escopo de dissecção, transfira um embrião para uma placa de seis centímetros contendo HBSS gelado. Use agulhas de 21 a 23 para fixar a posição da cabeça penetrando através dos olhos em um ângulo de 45 graus e aplique uma força para garantir que as agulhas estejam fixas na placa. Use fórceps número cinco para remover a pele e o crânio trabalhando do meio para os lados, em seguida, corte as lâmpadas olfativas e remova as meninges para expor os tecidos corticais.Use fórceps curvos para cortar os tecidos corticais em dois a três mililitros de meio neurobásal no gelo. Puxe os tecidos de diferentes embriões conforme necessário. Tecidos de oito a 10 embriões geralmente dão aproximadamente 200 microgramas de RNA total.Adicione cicloheximida ao meio neurobásio com os tecidos dissecados a uma concentração final de 100 microgramas por mililitro e incubar a 37 graus Celsius por 10 minutos. Centrifugar o tecido a 500 x g por cinco minutos a quatro graus Celsius e descartar o supernasal. Lave os tecidos duas vezes com PBS gelado suplementado com 100 microgramas por cicloheximida mililitro.Adicione 500 microliters de tampão de lise celular suplementados com quatro microliters de inibidor RNase e pipeta para cima e para baixo para resuspend o tecido. Use uma agulha de insulina para lise suavemente o tecido. Em seguida, incubar no gelo por 10 minutos com breve vórtice a cada dois ou três minutos.Após a incubação, centrifugar o lysate a 2000 x g por cinco minutos a quatro graus Celsius e transferir o supernasce para um novo tubo de centrífuga no gelo. Repita este processo mais uma vez centrifugando a 13.000 x g. Depois de transferir o supernascedor para um novo tubo de centrífuga no gelo, meça a concentração de RNA no tecido lysate usando um espectrofotômetro UV-Vis.Carregue as amostras em cima dos gradientes de sacarose, distribuindo lentamente o lise para as paredes dos tubos ultracentríficos. Coloque suavemente os gradientes de sacarose nos baldes e ultracentrize as amostras a 190,000 x g e quatro graus Celsius por 90 minutos. Coloque um tubo de ultracentrifutura vazio no perfurador do tubo e penetre suavemente o tubo com a agulha de baixo.Encha uma seringa de 30 mililitros com 25 mililitros de solução de perseguição de 60% de sacarose. Em seguida, pressione suavemente a seringa de tal forma que a solução de perseguição encha o tubo vazio e passe pelo monitor UV de 254 nanômetros para definir a linha de base para detecção. Pressione auto zero no monitor UV para registrar uma linha de base para detecção e pressione Play no software para começar a gravar.Uma vez que o sistema estabeleça uma linha de base, pausa a gravação no software e retraia a solução de perseguição, certificando-se de que nenhuma solução de perseguição residual permaneça no sistema. Carregue um tubo de amostra no perfurador do tubo e penetre suavemente o tubo com a agulha de baixo. Comece a gravar no software, certifique-se de que não há bolhas de ar na linha.Em seguida, inicie a bomba de seringa e o coletor de frações para coletar frações de polímio, definindo o fracionador para 30 segundos. Colete as frações em tubos de 1,5 mililitro. O lysato cortical contendo RNA extraído de oito embriões foi separado por um gradiente de sacarose em 12 frações.Picos de absorção UV a 254 nanômetros identificaram frações contendo a subunidade 40S 60S e monossóis e polissomos 80S. A análise das frações por mancha ocidental para a grande subunidade ribossômica Rpl10 mostrou sua presença nos monossómos e polissóis da subunidade 60S. Em contraste, as proteínas citoplasmáticas, Gapdh e Csde1, não foram associadas a ribossomos, mas foram enriquecidas em frações contendo RNA livre.Consistente com a separação de proteínas em diferentes frações, Gapdh e sox2 mRNAs foram altamente enriquecidos nas frações contendo polissomas pesados, sugerindo que esses mRNAs são traduzidos eficientemente no córtex em desenvolvimento. Em contraste, rpl7 e rpl35 mRNAs foram enriquecidos na fração contendo monossomos, sugerindo tradução reprimida. Para obter resultados reprodutíveis, é importante manter a consistência na confecção de gradientes de sacarose.As bombas de seringa devem ser usadas para ejetar a sacarose. Durante o fracionamento e coleta de amostras, é importante lavar o sistema com água sem RNase. Isso reduz qualquer sacarose residual remanescente da amostra anterior.Este método pode ser usado para avaliar o status translacional de mRNAs em vários tecidos. Utilizando a plataforma, podem ser obtidos gradientes consistentes para perfis polissários, o que fornece uma solução de baixo custo para esta técnica clássica e útil.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Análise mosaico de função do gene em desenvolvimento pós-natal do rato do cérebro usando Virus baseado Recombinação Cre

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development when ...

Neurociência

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

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Em Eletroporação vivo de Retina do rato em desenvolvimento

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

De uma única célula perfil de imaturos e maduros neurônios da retina

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualização e manipulação genética de dendritos e espinhas no córtex cerebral e hipocampo do rato usando<em&gt; In utero</em&gt; Eletroporação

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Avaliação da progressão do ciclo celular de células-tronco neurais e células progenitoras no cérebro de camundongos em desenvolvimento após estresse genotóxico

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Imagens ao vivo da mitose no desenvolvimento Cortex embrionárias de camundongos

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imagiologia Fibras Serotoninérgicos na medula espinhal mouse usando o CLARIDADE / Técnica CUBIC

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelagem de infecção de vírus Zika do desenvolvimento cérebro humano In Vitro usando células-tronco derivadas de Organoids Cerebral

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

Quantificar a distribuição heterogênea de uma proteína sináptica no cérebro do rato utilizando imunofluorescência

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Crônica implantação de matriz Electrocorticographic todo-cortical no sagui comum

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...