Name: analysis of translation in the developing mouse brain using polysome profiling
Uploaded: 2021-05-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling at JoVE.com

Эта работа финансировалась грантом NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018). Г.Я. является канадским научным кафедрой. S.K. финансировалась стипендией Mitacs Globalink Graduate Fellowship и стипендией аспиранта ACHRI.

Все виды использования животных контролировались Комитетом по уходу за животными в Университете Калгари. Мыши CD1, используемые для эксперимента, были приобретены у коммерческого поставщика.
1. Подготовка решений
ПРИМЕЧАНИЕ Для предотвращения деградации Р?...

<ol>
	<li>G&#246;tz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+neurogenesis.">The cell biology of neurogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).</li><li>Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+specification+of+neural+fates+by+transcription+factor+codes.">Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes.</a> Development. 134, 3771-3780 (2007).</li><li>Fiddes, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-Specific+NOTCH2NL+Genes+Affect+Notch+Signaling+and+Cortical+Neurogenesis.">Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis.</a> Cell. 173, 1356-1369 (2018).</li><li>Lennox, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+DDX3X+mutations+impair+RNA+metabolism+and+neurogenesis+during+fetal+cortical+development.">Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development.</a> Neuron. 106, 404-420 (2020).</li><li>Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+control+of+neurogenesis:+A+view+from+the+mammalian+cerebral+cortex.">Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359 (2012).</li><li>Amadei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Smaug2-based+translational+repression+complex+determines+the+balance+between+precursor+maintenance+versus+differentiation+during+mammalian+neurogenesis.">A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis.</a> Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).</li><li>Yang, G., Smibert, C. A., Kaplan, D. R., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+eIF4E1/4E-T+complex+determines+the+genesis+of+neurons+from+precursors+by+translationally+repressing+a+proneurogenic+transcription+program.">An eIF4E1/4E-T complex determines the genesis of neurons from precursors by translationally repressing a proneurogenic transcription program.</a> Neuron. 84, 723-739 (2014).</li><li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Glo1-Methylglyoxal+pathway+that+is+perturbed+in+maternal+diabetes+regulates+embryonic+and+adult+neural+stem+cell+pools+in+murine+offspring.">A Glo1-Methylglyoxal pathway that is perturbed in maternal diabetes regulates embryonic and adult neural stem cell pools in murine offspring.</a> Cell Reports. 17, 1022-1036 (2016).</li><li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+defined+neocortical+translation+and+polysome+assembly+are+determined+by+the+RNA-binding+protein+Hu+antigen+R.">Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).</li><li>Rodrigues, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylglyoxal+couples+metabolic+and+translational+control+of+Notch+signalling+in+mammalian+neural+stem+cells.">Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells.</a> Nature Communications. 11, 2018 (2020).</li><li>Iwasaki, S., Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+toolbox+for+protein+synthesis+studies.">The growing toolbox for protein synthesis studies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).</li><li>Chekulaeva, M., Landthaler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+on+translation.">Eyes on translation.</a> Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).</li><li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Selective+mRNA+Translation+in+Mammalian+Cells+by+Polysome+Profiling.">Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e52295 (2014).</li><li>Chass&#233;, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+using+polysome+profiling.">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45, 15 (2017).</li><li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin.">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).</li><li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamic+WNT3+secretion+spatiotemporally+regulates+the+neocortical+ribosome+signature+and+mRNA+translation+to+specify+neocortical+cell+subtypes.">Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes.</a> Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e51455 (2014).</li></ol>

Поликом-профилирование является широко используемым и мощным методом оценки трансляционного статуса как на одном гене, так и на уровнегенома 14. В этом отчете мы представляем протокол полисомного профилирования с помощью домашней платформы и ее применения для анализа раз?...

Во время развития мозга млекопитающих, нервные стволовые клетки размножаются и дифференцируются для генерации нейронов иглии 1,2. Возмущение этого процесса может привести к изменениям в структуре и функции мозга, как видно из многих расстройств нейроразвития3,4. Правильное поведение нервных стволовых клеток требует организованного выражения конкретных генов5. В то время как эпигенетический и транскрипционные контроль этих генов был интенсивно изучен, последние результаты показывают, что регуляции генов на других уровнях также способствует координации пролиферациинервных стволовых клеток и дифференциации6, 7,8,9,10. Таким образом, решение программ трансляционного контроля значительно повысит наше понимание механизмов, лежащих в основе решения судьбы нервных стволовых клеток и развития мозга.
Три основных метода с различными сильными сторонами были широко применены для оценки трансляционного статуса мРНК, включая рибосомное профилирование, перевод очистки рибосомной сродства (TRAP) и профилирование поликомы. Рибосомное профилирование использует секвенирование РНК для определения защищенных рибосомой фрагментов мРНК, что позволяет глобальному анализу количества и местонахождения перевода рибосом на каждой стенограмме косвенно сделать вывод о скорости перевода, сравнив его с изобилиемстенограммы 11. TRAP использует рибосомальные белки с эпитопом, помеченными эпитопом, для захвата рибосомно-связанных мРНК12. Учитывая, что помеченные рибосомные белки могут быть выражены в конкретных типах клеток с использованием генетических подходов, TRAP позволяет анализ перевода в клеточном типе конкретных образом. Для сравнения, поликомное профилирование, которое использует градиентную фракциацию плотности сахарозы для отделить свободную и плохо переведенную часть (легкие моносомы) от тех, которые активно переводятся рибосомами (более тяжелыми полисомами), обеспечивает прямое измерение плотности рибосомы на мРНК13. Одним из преимуществ этого метода является его универсальность для изучения перевода конкретных мРНК, представляющих интерес, а также генома всей перевод анализа14.
В этой статье мы описываем подробный протокол полисомного профилирования для анализа развивающейся коры головного мозга мыши. Мы используем домоборную систему для подготовки градиентов плотности сахарозы и сбора фракций для нисходящих приложений. Представленный здесь протокол можно легко адаптировать для анализа других типов тканей и организмов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL RNA free microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Greiner-Bio</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M MgCl2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21-23G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M KCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt end needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB2530/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>115-39-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 mouse</td>
			<td></td>
			<td>Charles River Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tip forceps</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#Z168785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td></td>
			<td>Sigma</td>
			<td>66-81-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition software TracerDAQ</td>
			<td>Measurement Computing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital converter</td>
			<td></td>
			<td>Measurement Computing</td>
			<td>USB-1208LS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA miniprep kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>R2070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>12-03-3483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No.5 forceps</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Model 2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-513-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear stage actuator</td>
			<td>Rattmmotor</td>
			<td>CBX1605-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase control RNA</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L4561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima first strand cDNA synthesis kit</td>
			<td>Themo Fisher</td>
			<td>M1681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature V-clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VH1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MSB7515/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series optical post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MS2R/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series pedestal post holder base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MBA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;12.7 mm aluminum post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TRA150/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa SYBR green fastmix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>CA101414-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>58-58-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RA90/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle &#216;1/2&#34; to &#216;6 mm post clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RA90TR/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase AWAY</td>
			<td>Molecular BioProducts</td>
			<td>7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free tips</td>
			<td>Frogga Bio</td>
			<td>FT10, FT200, FT1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free water</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>809-115-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim right-angle bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AB90B/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small V-clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VC1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>302-95-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper motor driver</td>
			<td>SongHe</td>
			<td>TB6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>57501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube piercer</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>BR-184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td></td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>L8-70M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO project super starter kit</td>
			<td>Elegoo</td>
			<td>EL-KIT-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV monitor</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>EM-1 Econo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VB01A/M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of translation in the developing mouse brain using polysome profiling

Правильное развитие мозга млекопитающих опирается на тонкий баланс пролиферации нервных стволовых клеток и дифференциации на различные типы нервных клеток. Этот баланс жестко контролируется экспрессией генов, которая достроена на нескольких уровнях, включая транскрипцию, посткриптацию и перевод. В этой связи растущее количество фактических данных подчеркивает важную роль трансляционной регуляции в координации решений о судьбе нервных стволовых клеток. Полисомная фракционирование является мощным инструментом для оценки трансвеститного статуса мРНК как на глобальном, так и на индивидуальном уровне генов. Здесь мы представляем внутриутверенные полисомные профилирования трубопровода для оценки трансляционной эффективности в клетках из развивающейся коры головного мозга мыши. Мы описываем протоколы для подготовки градиента сахарозы, лиза тканей, ультрацентрифугации и дробного анализа переводного статуса мРНК.

В качестве демонстрации корковой лизат, содержащий РНК 75 мкг (с объединением из 8 эмбрионов), был разделен градиентом сахарозы на 12 фракций. Пики поглощения УФ-излучения на 254 нм определили фракции, содержащие 40S подразделение, 60S подразделение, 80S моносомы и полисомы(рисунок 4A</...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling at JoVE.com

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

Развитие мозга млекопитающих требует надлежащего контроля экспрессии генов на уровне перевода. Здесь мы описываем систему поликомного профилирования с помощью простой в сборке градиентной градиентной и фракционной платформы для оценки трансляционного состояния мРНК в развивающемся мозге.

Анализ перевода в развивающемся мозге мыши с использованием полисомного профилирования

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

Переводное регулирование играет важную роль в развитии мозга. Поликом-профилирование является полезным и мощным инструментом для оценки переводного состояния мРНК, что позволяет изучать функции трансляционного контроля при развитии мозга. Этот метод является простым и недорогим подходом, чтобы сделать градиенты сахарозы и оценить полисомную фракциотацию.В этом протоколе он используется для анализа развивающейся коры мыши. Тем не менее, он может быть легко адаптирован для изучения других систем. Начните с разбавления 2,2 молярной сахарозы, чтобы подготовить шесть градиентов 10-50% сахарозы.Заполните 30 миллилитров шприц с примерно 16 миллилитров 10%сахарозы, поместите его на шприц насоса и подключить его к игле. Убедитесь, что в шприце, трубе или игле нет пузырьков воздуха, и протрите кончик иглы, чтобы удалить остаточный раствор. Перемести моторизованную сцену так, чтобы кончик иглы касался центра трубки внизу.Установите шприц-насос до скорости потока в два миллилитров в минуту для объема 2,3 миллилитров. После дозирования 2,3 миллилитров 10% раствора сахарозы, двигаться вниз моторизованной стадии и повторить процесс для всех шести градиентов. Затем добавьте 20%sucrose раствор в нижней части труб, а затем 30, 40 и 50%Collect CD1 эмбрионов мыши в эмбриональный день 12 и поместите их в 10 сантиметров пластины, содержащей ледяной HBSS на льду.Под областью вскрытия перенесите один эмбрион на шестиметровую пластину, содержащую ледяной HBSS. Используйте 21 до 23 иглы датчика, чтобы исправить положение головы, проникая через глаза под углом 45 градусов и применить силу, чтобы убедиться, что иглы закреплены на пластине. Используйте номер пять типсов, чтобы удалить кожу и череп, работающих от середины до сторон, а затем сократить обонятельные луковицы и удалить околис подвергать корковых тканей.Используйте изогнутые типсы, чтобы разрезать корковые ткани на два-три миллилитра нейробазальной среды на льду. Вытяните ткани из разных эмбрионов по мере необходимости. Ткани от восьми до 10 эмбрионов обычно дают около 200 микрограммов общей РНК.Добавьте циклохексимид в нейробазную среду с расчлененными тканями до конечной концентрации 100 микрограмм на миллилитр и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 10 минут. Центрифуга ткани на 500 х г в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию и отказаться от супернатанта. Вымойте ткани дважды с ледяной PBS дополнен 100 микрограммов на миллилитр циклохексимида.Добавьте 500 микролитров буфера клеточного лиза, дополненного четырьмя микролитров ингибитора RNase и пипетки вверх и вниз, чтобы повторно использовать ткани. Используйте инсулиновую иглу, чтобы аккуратно подставить ткань. Затем инкубировать на льду в течение 10 минут с кратким вихрем каждые две-три минуты.После инкубации центрифуга лизировать при 2000 х г в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и перенести супернатант в новую центрифугу на льду. Повторите этот процесс еще раз центрифугирования при 13 000 х г. После переноса супернатанта в новую центрифугу на льду, измерьте концентрацию РНК в лиссате ткани с помощью спектрофотометра UV-Vis.Загрузите образцы поверх градиентов сахарозы, медленно распределяя лизат к стенкам ультрацентрифугных труб. Аккуратно поместите градиенты сахарозы в ведра и ультрацентрифугировать образцы на 190 000 х г и четыре градуса по Цельсию в течение 90 минут. Поместите пустую ультрацентрифугную трубку на трубчатый пирсинг и аккуратно проникните в трубку иглой со дна.Заполните 30 миллилитров шприц с 25 миллилитров 60% сахарозы погони решения. Затем осторожно нажмите шприц так, что решение погони заполняет пустую трубку и проходит через 254 нанометровый УФ-монитор, чтобы установить базовый уровень для обнаружения. Нажмите автоматический ноль на УФ-монитор, чтобы зарегистрировать базовый уровень для обнаружения, а затем нажмите Play на программное обеспечение, чтобы начать запись.Как только система установит базовый уровень, приохтять запись на программное обеспечение и отказаться от решения погони, убедившись, что не остаточный решение погони остается в системе. Загрузите одну пробную трубку на трубчатый пирсинг и аккуратно проникните в трубку иглой со дна. Начните запись на программное обеспечение, убедитесь, что Есть нет пузырьков воздуха в линии.Затем запустите шприц насос и сборщик фракций для сбора полисомных фракций, установив дробитель до 30 секунд. Соберите фракции в 1,5 миллилитровые трубки. Корковой лизат, содержащий РНК, извлеченную из восьми эмбрионов, был разделен градиентом сахарозы на 12 фракций.Пики поглощения УФ на 254 нанометров определили фракции, содержащие 40S подразделение 60S и моносомы и полисомы 80S. Анализ фракций западной помаркой для большого рибосомного подразделения Rpl10 показал его присутствие в моносомах и полисомах 60S. В отличие от этого, цитоплазмические белки, Gapdh и Csde1, не были связаны с рибосомами, но были обогащены фракциями, содержащими свободную РНК.В соответствии с разделением белков на различные фракции, Gapdh и sox2 mRNAs были сильно обогащены фракциями, содержащими тяжелые полисомы, что свидетельствует о том, что эти мРНК эффективно переводятся в развивающаяся кору. В отличие от этого, rpl7 и rpl35 mRNAs были обогащены фракцией, содержащей моносомы, что свидетельствует о репрессированном переводе. Чтобы получить воспроизводимые результаты, важно поддерживать консистенцию в принятии градиентов сахарозы.Шприц насосы должны быть использованы для извлечения сахарозы. Во время фракционации и сбора проб, важно мыть систему с RNase-свободной водой. Это уменьшает остатки сахарозы, оставшиеся от предыдущего образца.Этот метод может быть использован для оценки трансляционного состояния мРНК в различных тканях. Используя платформу, можно получить согласованные градиенты для поликомного профилирования, что обеспечивает недорогое решение для этого классического и полезного метода.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

Мозаика Анализ функции генов в постнатальном развитии мозга мыши с помощью вирусов основан Cre Рекомбинация

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

В естественных условиях Электропорация развивающихся Мышь Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Одноклеточный профилирования развивающихся и зрелых нейронов сетчатки

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Визуализация и генетических манипуляций дендритов и шипы в мышь коры головного мозга и гиппокамп использования<em&gt; Внутриутробное</em&gt; Электропорация

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Оценка клеточного цикла Прогрессирование нервных стволовых и клеток-предшественников в развивающемся мозге мыши после Генотоксические стресса

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Онлайн Визуализация Митоз в развивающихся мышиных эмбриональных Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Визуализация Серотонинергической волокон в спинном мозге мышей Использование Четкость / КУБИЧЕСКИЙ Техника

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Моделирования Зика вирус развивающегося мозга человека в пробирке с помощью стволовых клеток получены мозгового Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

Количественная оценка гетерогенных распределение синаптических белков в мозг мыши, с помощью иммунофлюоресценции

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Хронический имплантации целом корковых Electrocorticographic массива в общей игрунка

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...