Name: analysis of translation in the developing mouse brain using polysome profiling
Uploaded: 2021-05-22T14:00:00
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Este trabajo fue financiado por una NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018 a G.Y.). G.Y. es una Cátedra de Investigación de Canadá. S.K. fue financiado por Mitacs Globalink Graduate Fellowship y ACHRI Graduate Student Scholarship.

Todo el uso de animales fue supervisado por el Comité de Cuidado animal de la Universidad de Calgary. Los ratones CD1 utilizados para el experimento fueron comprados al proveedor comercial.
1. Preparación de soluciones
NOTA Para evitar la degradación del ARN, rocíe la mesa de trabajo y todos los equipos con solución de descontaminación RNase. Los consejos sin RNase se utilizan para el experimento. Todas las soluciones se preparan en agua sin RNase.
<ol><li>P...

<ol>
	<li>G&#246;tz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+neurogenesis.">The cell biology of neurogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).</li><li>Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+specification+of+neural+fates+by+transcription+factor+codes.">Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes.</a> Development. 134, 3771-3780 (2007).</li><li>Fiddes, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-Specific+NOTCH2NL+Genes+Affect+Notch+Signaling+and+Cortical+Neurogenesis.">Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis.</a> Cell. 173, 1356-1369 (2018).</li><li>Lennox, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+DDX3X+mutations+impair+RNA+metabolism+and+neurogenesis+during+fetal+cortical+development.">Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development.</a> Neuron. 106, 404-420 (2020).</li><li>Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+control+of+neurogenesis:+A+view+from+the+mammalian+cerebral+cortex.">Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359 (2012).</li><li>Amadei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Smaug2-based+translational+repression+complex+determines+the+balance+between+precursor+maintenance+versus+differentiation+during+mammalian+neurogenesis.">A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis.</a> Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).</li><li>Yang, G., Smibert, C. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+defined+neocortical+translation+and+polysome+assembly+are+determined+by+the+RNA-binding+protein+Hu+antigen+R.">Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).</li><li>Rodrigues, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylglyoxal+couples+metabolic+and+translational+control+of+Notch+signalling+in+mammalian+neural+stem+cells.">Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells.</a> Nature Communications. 11, 2018 (2020).</li><li>Iwasaki, S., Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+toolbox+for+protein+synthesis+studies.">The growing toolbox for protein synthesis studies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).</li><li>Chekulaeva, M., Landthaler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+on+translation.">Eyes on translation.</a> Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).</li><li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Selective+mRNA+Translation+in+Mammalian+Cells+by+Polysome+Profiling.">Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e52295 (2014).</li><li>Chass&#233;, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+using+polysome+profiling.">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45, 15 (2017).</li><li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin.">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).</li><li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamic+WNT3+secretion+spatiotemporally+regulates+the+neocortical+ribosome+signature+and+mRNA+translation+to+specify+neocortical+cell+subtypes.">Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes.</a> Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e51455 (2014).</li></ol>

El perfilado de polisomas es una técnica comúnmente utilizada y potente para evaluar el estado traslacional en niveles únicos de genes y de todo el genoma14. En este informe, presentamos un protocolo de perfilado de polisoma utilizando una plataforma montada en casa y su aplicación para analizar la corteza del ratón en desarrollo. Esta plataforma rentable es fácil de montar y generar gradientes de sacarosa robustos y reproducibles y perfiles de polisoma con alta sensibilidad.
<p class="j...

Durante el desarrollo del cerebro de los mamíferos, las células madre neurales proliferan y se diferencian para generar neuronas y glia1,2. La perturbación de este proceso puede conducir a alteraciones en la estructura y función cerebral, como se ve en muchos trastornos del neurodesarrollo3,4. El comportamiento adecuado de las células madre neurales requiere la expresión orquestada de genes específicos5. Si bien el control epigenético y transcripcional de estos genes ha sido estudiado intensamente, hallazgos recientes sugieren que la regulación genética a otros niveles también contribuye a la coordinación de la proliferación y diferenciación de células madre neuronales6,7,8,9,10. Por lo tanto, abordar los programas de control traslacional avanzará en gran medida nuestra comprensión de los mecanismos subyacentes a la decisión del destino de las células madre neuronales y el desarrollo del cerebro.
Se han aplicado ampliamente tres técnicas principales con diferentes fortalezas para evaluar el estado traslacional del ARNM, incluyendo la elaboración de perfiles ribosomas, la purificación de afinidad ribosoma traducible (TRAP) y el perfilado de polisomas. La elaboración de perfiles ribosomas utiliza secuenciación de ARN para determinar fragmentos de ARNM protegidos por ribosomas, lo que permite el análisis global del número y la ubicación de los ribosomas traduciendo en cada transcripción para inferir indirectamente la tasa de traducción comparándola con la abundancia de transcripción11. TRAP aprovecha las proteínas ribosomales etiquetadas con epitopos para capturar los mRNAs ribosomas unidos al ribosoma12. Dado que las proteínas ribosomales etiquetadas se pueden expresar en tipos celulares específicos utilizando enfoques genéticos, TRAP permite el análisis de la traducción de una manera específica del tipo celular. En comparación, la elaboración de perfiles de polisomas, que utiliza el fraccionamiento de gradiente de densidad de sacarosa para separar la porción libre y mal traducida (monosomas más ligeros) de aquellos que se traducen activamente por ribosomas (polisomas más pesados), proporciona una medición directa de la densidad ribosoma en el ARNm13. Una ventaja que ofrece esta técnica es su versatilidad para estudiar la traducción de mRNA específica de interés, así como el análisis de translatome en todo el genoma14.
En este artículo, describimos un protocolo detallado de perfilado de polisoma para analizar la corteza cerebral del ratón en desarrollo. Utilizamos un sistema ensamblado en casa para preparar gradientes de densidad de sacarosa y recoger fracciones para aplicaciones posteriores. El protocolo presentado aquí se puede adaptar fácilmente para analizar otros tipos de tejidos y organismos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL RNA free microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Greiner-Bio</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M MgCl2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21-23G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M KCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt end needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB2530/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>115-39-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 mouse</td>
			<td></td>
			<td>Charles River Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tip forceps</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#Z168785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td></td>
			<td>Sigma</td>
			<td>66-81-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition software TracerDAQ</td>
			<td>Measurement Computing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital converter</td>
			<td></td>
			<td>Measurement Computing</td>
			<td>USB-1208LS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA miniprep kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>R2070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>12-03-3483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No.5 forceps</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Model 2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-513-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear stage actuator</td>
			<td>Rattmmotor</td>
			<td>CBX1605-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase control RNA</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L4561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima first strand cDNA synthesis kit</td>
			<td>Themo Fisher</td>
			<td>M1681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature V-clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VH1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MSB7515/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series optical post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MS2R/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series pedestal post holder base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MBA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;12.7 mm aluminum post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TRA150/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa SYBR green fastmix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>CA101414-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>58-58-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RA90/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle &#216;1/2&#34; to &#216;6 mm post clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RA90TR/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase AWAY</td>
			<td>Molecular BioProducts</td>
			<td>7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free tips</td>
			<td>Frogga Bio</td>
			<td>FT10, FT200, FT1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free water</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>809-115-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim right-angle bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AB90B/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small V-clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VC1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>302-95-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper motor driver</td>
			<td>SongHe</td>
			<td>TB6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>57501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube piercer</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>BR-184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td></td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>L8-70M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO project super starter kit</td>
			<td>Elegoo</td>
			<td>EL-KIT-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV monitor</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>EM-1 Econo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VB01A/M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of translation in the developing mouse brain using polysome profiling

El desarrollo adecuado del cerebro de los mamíferos se basa en un fino equilibrio de proliferación de células madre neurales y diferenciación en diferentes tipos de células neuronales. Este equilibrio está estrictamente controlado por la expresión génica que está afinada en múltiples niveles, incluyendo transcripción, post-transcripción y traducción. En este sentido, un creciente cuerpo de evidencia destaca un papel crítico de la regulación traslacional en la coordinación de las decisiones sobre el destino de las células madre neurales. El fraccionamiento de polisomas es una poderosa herramienta para la evaluación del estado traslacional del ARNM tanto a nivel global como individual. Aquí, presentamos una tubería interna de perfiles de polisoma para evaluar la eficiencia traslacional en las células de la corteza cerebral del ratón en desarrollo. Describimos los protocolos para la preparación del gradiente de sacarosa, lisis tisular, ultracentrifugación y análisis basado en fraccionamientos del estado traslacional del ARNm.

Como demostración, el lisato cortical que contenía 75 μg de ARN (agrupado de 8 embriones) fue separado por el gradiente de sacarosa en 12 fracciones. Picos de absorbancia UV a 254 nm identificaron fracciones que contienen el subunidad 40S, subunidad 60S, monosoma 80S y polisomas (Figura 4A). Análisis de fracciones por mancha occidental para la gran subunidad ribosomal, Rpl10 mostró su presencia en la subunidad 60S (fracción 3), monosoma (fracción 4) y polisomas (fracciones 5-12) (<str...

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Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

El desarrollo del cerebro de los mamíferos requiere un control adecuado de la expresión génica a nivel de traducción. Aquí, describimos un sistema de perfilado de polisoma con una plataforma de degradado y fraccionamiento de sacarosa fácil de ensamblar para evaluar el estado traslacional de los ARNM en el cerebro en desarrollo.

Análisis de la traducción en el cerebro del ratón en desarrollo utilizando perfiles de polisoma

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

La regulación traslacional desempeña un papel importante en el desarrollo cerebral. La elaboración de perfiles de polisoma proporciona una herramienta útil y potente para evaluar el estado traslacional del ARNM, lo que permite examinar las funciones de control traslacional durante el desarrollo cerebral. Este método es un enfoque fácil y de bajo costo para hacer gradientes de sacarosa y evaluar el fraccionamiento de polisomas.En este protocolo, se utiliza para analizar la corteza del ratón en desarrollo. Sin embargo, se puede adaptar fácilmente para estudiar otros sistemas. Comience diluyendo 2,2 sacarosa molar para preparar seis gradientes de sacarosa de 10 a 50%.Llene una jeringa de 30 mililitros con aproximadamente 16 mililitros de 10% de sacarosa, colóquela en la bomba de jeringa y conéctelo a la aguja. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la jeringa, tubo o aguja, y limpie la punta de la aguja para eliminar cualquier solución residual. Mueva la etapa motorizada hacia arriba de tal forma que la punta de la aguja toque el centro del tubo en la parte inferior.Ajuste la bomba de jeringa a un caudal de dos mililitros por minuto para un volumen de 2,3 mililitros. Después de dispensar 2,3 mililitros de solución de sacarosa al 10%, baje la etapa motorizada y repita el proceso para los seis gradientes. Luego agrega una solución de sacarosa al 20% a la parte inferior de los tubos seguida de 30, 40 y 50% Colecciona embrionarios de ratón CD1 en el día embrionario 12 y colócalos en una placa de 10 centímetros que contiene HBSS helado sobre hielo.Bajo el alcance de disección, transfiera un embrión a una placa de seis centímetros que contenga HBSS helado. Utilice agujas de calibre 21 a 23 para fijar la posición de la cabeza penetrando a través de los ojos en un ángulo de 45 grados y aplique una fuerza para asegurarse de que las agujas estén fijas en la placa. Utilice fórceps número cinco para eliminar la piel y el cráneo que trabajan desde el centro hasta los lados, luego corte las bombillas olfativas y retire las meninges para exponer los tejidos corticales.Utilice fórceps curvos para cortar los tejidos corticales en dos a tres mililitros de medio neurobasal sobre hielo. Extraiga los tejidos de diferentes embriones según sea necesario. Los tejidos de ocho a 10 embriones generalmente dan aproximadamente 200 microgramos de ARN total.Añadir cicloheximida al medio neurobasal con los tejidos diseccionados a una concentración final de 100 microgramos por mililitro e incubar a 37 grados Centígrados durante 10 minutos. Centrífuga el tejido a 500 x g durante cinco minutos a cuatro grados Centígrados y deseche el sobrenadante. Lave los tejidos dos veces con PBS frío y helado complementado con 100 microgramos por cicloheximida de mililitro.Añadir 500 microlitros de amortiguador de lisis celular complementado con cuatro microlitros de inhibidor de la RNase y pipeta arriba y abajo para resuspend el tejido. Utilice una aguja de insulina para liar suavemente el tejido. Luego incubar en hielo durante 10 minutos con breve vórtice cada dos o tres minutos.Después de la incubación, centrífuga el lisato a 2000 x g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo centrífuga sobre hielo. Repita este proceso una vez más centrifugando a 13.000 x g. Después de transferir el sobrenadante a un nuevo tubo centrífuga sobre hielo, mida la concentración de ARN en el tejido lisato utilizando un espectrofotómetro UV-Vis.Cargue las muestras sobre los gradientes de sacarosa dispensando lentamente el lisato a las paredes de los tubos ultracentrífugas. Coloque suavemente los gradientes de sacarosa en los cubos y ultracentrífuga las muestras a 190.000 x g y cuatro grados Celsius durante 90 minutos. Coloque un tubo de ultracentrífuga vacío en el perforador del tubo y penetre suavemente en el tubo con la aguja desde la parte inferior.Llene una jeringa de 30 mililitros con 25 mililitros de solución de persecución de sacarosa al 60%. A continuación, presione suavemente la jeringa de tal manera que la solución de persecución llene el tubo vacío y pase por el monitor UV de 254 nanómetros para establecer la línea de base para su detección. Pulse auto cero en el monitor UV para registrar una línea base para su detección y, a continuación, pulse Reproducir en el software para comenzar a grabar.Una vez que el sistema establece una línea base, pausa la grabación en el software y retrae la solución de persecución, asegurándose de que no quede ninguna solución de persecución residual en el sistema. Cargue un tubo de muestra en el perforador del tubo y penetre suavemente en el tubo con la aguja desde la parte inferior. Comience a grabar en el software, asegúrese de que no hay burbujas de aire en la línea.A continuación, inicie la bomba de jeringa y el colector de fracción para recoger fracciones de polisoma, estableciendo el fraccionario en 30 segundos. Recoge las fracciones en tubos de 1,5 mililitros. El lisato cortical que contenía ARN extraído de ocho embriones fue separado por un gradiente de sacarosa en 12 fracciones.Picos de absorbancia UV a 254 nanómetros identificaron fracciones que contienen el subunidad 40S subunit 60S y 80S monosoma y polisomas. El análisis de las fracciones por mancha occidental para el gran subunit ribosomal Rpl10 mostró su presencia en los monosomas y polisomas de subbunit 60S. Por el contrario, las proteínas citoplasmáticas, Gapdh y Csde1, no se asociaron con ribosomas, sino que se enriquecieron en fracciones que contenían ARN libre.En consonancia con la separación de proteínas en diferentes fracciones, gapdh y sox2 mRNAs fueron altamente enriquecidos en las fracciones que contienen polisomas pesados, lo que sugiere que estos ARNM se traducen eficientemente en la corteza en desarrollo. Por el contrario, rpl7 y rpl35 mRNAs se enriquecieron en la fracción que contiene monosomas, lo que sugiere una traducción reprimida. Para obtener resultados reproducibles, es importante mantener la consistencia en la fabricación de gradientes de sacarosa.Las bombas de jeringa deben utilizarse para expulsar la sacarosa. Durante el fraccionamiento y la recolección de muestras, es importante lavar el sistema con agua libre de RNase. Esto reduce cualquier sacarosa residual restante de la muestra anterior.Este método se puede utilizar para evaluar el estado traslacional de los mRNAs en varios tejidos. Utilizando la plataforma, se pueden obtener gradientes consistentes para la generación de perfiles de polisomas, lo que proporciona una solución de bajo costo para esta técnica clásica y útil.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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development when ...

Investigación

Neurociencias

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Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

La visualización y la manipulación genética de las dendritas y espinas en la corteza cerebral y el hipocampo del ratón usando<em&gt; En el útero</em&gt; La electroporación

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

La evaluación de la progresión del ciclo celular de la madre neurales y células progenitoras en el cerebro en desarrollo del ratón después de estrés genotóxico

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Imágenes en vivo de la mitosis en el desarrollo de la corteza de embriones de ratón

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Las fibras serotoninérgicos proyección de imagen en la médula espinal de ratón El uso de la claridad / Técnica CÚBICO

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelado de la infección del Virus Zika del desarrollo cerebro humano In Vitro usando células madre derivado Cerebral organitas

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

Cuantificar la distribución heterogénea de una proteína sináptica en el cerebro de ratón mediante inmunofluorescencia

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Implantación crónica de todo cortical matriz electrocorticográfica en el tití común

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...