Name: analysis of translation in the developing mouse brain using polysome profiling
Uploaded: 2021-05-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling at JoVE.com

Detta arbete finansierades av ett NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018 till G.Y.). G.Y. är en kanadensisk forskningsordförande. S.K. finansierades av Mitacs Globalink Graduate Fellowship och ACHRI Graduate Student Scholarship.

Allt djurbruk övervakades av djurvårdskommittén vid University of Calgary. CD1 möss som användes för experimentet köptes från kommersiell leverantör.
1. Utarbetande av lösningar
OBS För att förhindra RNA-nedbrytning, spray arbetsbänk och all utrustning med RNase dekontamineringslösning. RNase-fria tips används för experimentet. Alla lösningar är förberedda i RNase-fritt vatten.
<ol><li>Förbered cykloheximidlagerlösning (100 mg/ml) i DMSO och f...

<ol>
	<li>G&#246;tz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+neurogenesis.">The cell biology of neurogenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).</li><li>Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+specification+of+neural+fates+by+transcription+factor+codes.">Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes.</a> Development. 134, 3771-3780 (2007).</li><li>Fiddes, I. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human-Specific+NOTCH2NL+Genes+Affect+Notch+Signaling+and+Cortical+Neurogenesis.">Human-Specific NOTCH2NL Genes Affect Notch Signaling and Cortical Neurogenesis.</a> Cell. 173, 1356-1369 (2018).</li><li>Lennox, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+DDX3X+mutations+impair+RNA+metabolism+and+neurogenesis+during+fetal+cortical+development.">Pathogenic DDX3X mutations impair RNA metabolism and neurogenesis during fetal cortical development.</a> Neuron. 106, 404-420 (2020).</li><li>Martynoga, B., Drechsel, D., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+control+of+neurogenesis:+A+view+from+the+mammalian+cerebral+cortex.">Molecular control of neurogenesis: A view from the mammalian cerebral cortex.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 4 (10), 008359 (2012).</li><li>Amadei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Smaug2-based+translational+repression+complex+determines+the+balance+between+precursor+maintenance+versus+differentiation+during+mammalian+neurogenesis.">A Smaug2-based translational repression complex determines the balance between precursor maintenance versus differentiation during mammalian neurogenesis.</a> Journal of Neurosci. 35, 15666-15681 (2015).</li><li>Yang, G., Smibert, C. A., Kaplan, D. R., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+eIF4E1/4E-T+complex+determines+the+genesis+of+neurons+from+precursors+by+translationally+repressing+a+proneurogenic+transcription+program.">An eIF4E1/4E-T complex determines the genesis of neurons from precursors by translationally repressing a proneurogenic transcription program.</a> Neuron. 84, 723-739 (2014).</li><li>Yang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Glo1-Methylglyoxal+pathway+that+is+perturbed+in+maternal+diabetes+regulates+embryonic+and+adult+neural+stem+cell+pools+in+murine+offspring.">A Glo1-Methylglyoxal pathway that is perturbed in maternal diabetes regulates embryonic and adult neural stem cell pools in murine offspring.</a> Cell Reports. 17, 1022-1036 (2016).</li><li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporally+defined+neocortical+translation+and+polysome+assembly+are+determined+by+the+RNA-binding+protein+Hu+antigen+R.">Temporally defined neocortical translation and polysome assembly are determined by the RNA-binding protein Hu antigen R.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111, 3815-3824 (2014).</li><li>Rodrigues, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylglyoxal+couples+metabolic+and+translational+control+of+Notch+signalling+in+mammalian+neural+stem+cells.">Methylglyoxal couples metabolic and translational control of Notch signalling in mammalian neural stem cells.</a> Nature Communications. 11, 2018 (2020).</li><li>Iwasaki, S., Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+toolbox+for+protein+synthesis+studies.">The growing toolbox for protein synthesis studies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).</li><li>Chekulaeva, M., Landthaler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyes+on+translation.">Eyes on translation.</a> Molecular Cell. 63, 918-925 (2016).</li><li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Selective+mRNA+Translation+in+Mammalian+Cells+by+Polysome+Profiling.">Assessment of Selective mRNA Translation in Mammalian Cells by Polysome Profiling.</a> Journal of Visualized Experiments. (92), e52295 (2014).</li><li>Chass&#233;, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+translation+using+polysome+profiling.">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45, 15 (2017).</li><li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin.">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nature Chemical Biology. 6, 209-217 (2010).</li><li>Kraushar, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamic+WNT3+secretion+spatiotemporally+regulates+the+neocortical+ribosome+signature+and+mRNA+translation+to+specify+neocortical+cell+subtypes.">Thalamic WNT3 secretion spatiotemporally regulates the neocortical ribosome signature and mRNA translation to specify neocortical cell subtypes.</a> Journal of Neuroscience: Official Journal of Society of Neuroscience. 35, 10911-10926 (2015).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> Journal of Visualized Experiments. (7), e51455 (2014).</li></ol>

Polysome profilering är en vanligt förekommande och kraftfull teknik för att bedöma translationell status på både enda gen och genom-wide nivåer14 . I den här rapporten presenterar vi ett protokoll av polysome profilering med hjälp av en hemmonterad plattform och dess tillämpning för att analysera den utvecklande musbarken. Denna kostnadseffektiva plattform är lätt att montera och generera robusta, reproducerbara sackarosgradienter och polysomeprofilering med hög känslighet.
<p ...

Under utvecklingen av däggdjurshjärnan förökar neurala stamceller och differentierar för att generera nervceller och glia1,2 . Störningen av denna process kan leda till förändringar i hjärnans struktur och funktion, som ses i många neurodevelopmental störningar3,4. Det korrekta beteendet hos neurala stamceller kräver orkestrerat uttryck för specifika gener5. Medan den epigenetiska och transkriptionella kontrollen av dessa gener har studerats intensivt, tyder nya resultat på att genreglering på andra nivåer också bidrar till samordningen av neural stamcellsproliferation och differentiering6,7,8,9,10. Således, ta itu med translationella kontroll program kommer kraftigt att främja vår förståelse av mekanismerna bakom neurala stamcell öde beslut och hjärnans utveckling.
Tre huvudtekniker med olika styrkor har tillämpats i stor utsträckning för att bedöma översättningsstatusen för mRNA, inklusive ribosomprofilering, översättning av ribosom affinitet rening (TRAP) och polysome profilering. Ribosomprofilering använder RNA-sekvensering för att bestämma ribosomskyddade mRNA-fragment, vilket gör det möjligt att jämföra den globala analysen av antalet och platsen för översättning av ribosomer på varje transkript för att indirekt härleda översättningshastigheten genom att jämföra den med transkriptförekomst11. TRAP drar nytta av epitopmärkta ribosomproteiner för att fånga ribosombundna mRNAs12. Med tanke på att de märkta ribosomala proteinerna kan uttryckas i specifika celltyper med hjälp av genetiska metoder, tillåter TRAP analys av översättning på ett celltypspecifikt sätt. I jämförelse ger polysome profilering, som använder sackaros densitet gradient fraktionering för att separera fri och dåligt översatt del (lättare monosomer) från de som aktivt översätts av ribosomer (tyngre polysomes), en direkt mätning av ribosomtäthet på mRNA13. En fördel som denna teknik erbjuder är dess mångsidighet att studera översättningen av specifika mRNA av intresse samt genomomfattande översättningsanalys14.
I detta dokument beskriver vi ett detaljerat protokoll av polysome profilering för att analysera den utvecklande mus hjärnbarken. Vi använder ett hemmonterat system för att förbereda sackarosgradienter och samla in fraktioner för nedströmsapplikationer. Protokollet som presenteras här kan enkelt anpassas för att analysera andra typer av vävnader och organismer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL RNA free microtubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm dish</td>
			<td>Greiner-Bio</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M MgCl2</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>21-23G needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305193</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M KCl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM8640G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunt end needle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20068-781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MB2530/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>115-39-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD1 mouse</td>
			<td></td>
			<td>Charles River Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved tip forceps</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#Z168785</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td></td>
			<td>Sigma</td>
			<td>66-81-9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition software TracerDAQ</td>
			<td>Measurement Computing</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital converter</td>
			<td></td>
			<td>Measurement Computing</td>
			<td>USB-1208LS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Direct-zol RNA miniprep kit</td>
			<td>Zymo</td>
			<td>R2070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>12-03-3483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>67-68-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont No.5 forceps</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#F6521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>Model 2110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-513-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Linear stage actuator</td>
			<td>Rattmmotor</td>
			<td>CBX1605-100A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luciferase control RNA</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L4561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Maxima first strand cDNA synthesis kit</td>
			<td>Themo Fisher</td>
			<td>M1681</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniature V-clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VH1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series breadboard</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MSB7515/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series optical post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MS2R/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini-series pedestal post holder base</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>MBA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#216;12.7 mm aluminum post</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>TRA150/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfeCTa SYBR green fastmix</td>
			<td>Quanta Bio</td>
			<td>CA101414-274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>58-58-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RA90/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Right-angle &#216;1/2&#34; to &#216;6 mm post clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>RA90TR/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rnase AWAY</td>
			<td>Molecular BioProducts</td>
			<td>7002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free tips</td>
			<td>Frogga Bio</td>
			<td>FT10, FT200, FT1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase free water</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>809-115-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNasin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim right-angle bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>AB90B/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small V-clamp</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VC1/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>302-95-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stepper motor driver</td>
			<td>SongHe</td>
			<td>TB6600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>57501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SW 41 Ti rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td>Bio-basic</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermofisher Scientific</td>
			<td>15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube piercer</td>
			<td>Brandel</td>
			<td>BR-184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td></td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>L8-70M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge tubes</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331372</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15567-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UNO project super starter kit</td>
			<td>Elegoo</td>
			<td>EL-KIT-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV monitor</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>EM-1 Econo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical bracket</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>VB01A/M</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of translation in the developing mouse brain using polysome profiling

Den korrekta utvecklingen av däggdjurshjärnan bygger på en fin balans mellan neural stamcellsproliferation och differentiering i olika neurala celltyper. Denna balans styrs tätt av genuttryck som finjusteras på flera nivåer, inklusive transkription, post-transkription och översättning. I detta avseende belyser en växande mängd bevis en kritisk roll av translationell reglering i samordningen av neurala stamcell öde beslut. Polysome fraktionering är ett kraftfullt verktyg för bedömning av mRNA translationell status på både globala och individuella gennivåer. Här presenterar vi en in-house polysome profilering pipeline för att bedöma translationell effektivitet i celler från den utvecklande mus hjärnbarken. Vi beskriver protokollen för sackaros gradient beredning, vävnad lysis, ultracentrifugation och fraktionering-baserade analys av mRNA translationell status.

Som en demonstration separerades det kortikala lysatet som innehåller 75 μg RNA (poolat från 8 embryon) av sackarosgradienten i 12 fraktioner. Toppar av UV-absorbans vid 254 nm identifierade fraktioner som innehåller 40S-underenheten, 60S-underenheten, 80S monosom och polyomer (figur 4A). Analys av fraktioner av western blot för den stora ribosomal underenheten, Rpl10 visade dess närvaro i 60S underenheten (fraktion 3), monosom (fraktion 4) och polysomes (fraktioner 5-12) (<strong clas...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling at JoVE.com

Analysis of Translation in the Developing Mouse Brain using Polysome Profiling

Utvecklingen av däggdjurshjärnan kräver korrekt kontroll av genuttryck på översättningsnivå. Här beskriver vi ett polysome profileringssystem med en lättmonterade sackarosgradienttillverknings- och fraktioneringsplattform för att bedöma mRNAs translationella status i den utvecklande hjärnan.

Analys av översättning i den utvecklande mushjärnan med polysome profilering

The proper development of the mammalian brain relies on a fine balance of neural stem cell proliferation and differentiation into different neural cell ...

Translationell reglering spelar en viktig roll i hjärnans utveckling. Polysome profilering ger ett användbart och kraftfullt verktyg för att bedöma översättningsstatusen för mRNA, vilket gör det möjligt att undersöka translationella kontrollfunktioner under hjärnans utveckling. Denna metod är en enkel och billig metod för att göra sackarosgradienter och bedöma polysome fraktionering.I detta protokoll används det för att analysera den utvecklande musbarken. Det kan dock enkelt anpassas för att studera andra system. Börja med att späda ut 2,2 molar sackaros för att förbereda sex 10 till 50% sackarosgradienter.Fyll en 30 milliliter spruta med cirka 16 milliliter 10% sackaros, placera den på sprutpumpen och anslut den till nålen. Se till att det inte finns några luftbubblor i sprutan, slangen eller nålen och torka av nålens spets för att ta bort eventuell restlösning. Flytta upp det motoriserade stadiet så att nålens spets vidrör rörets mitt i botten.Ställ in sprutpumpen på ett flöde på två milliliter per minut för en volym på 2,3 milliliter. Efter dispensering av 2,3 milliliter 10% sackaroslösning, flytta ner det motoriserade steget och upprepa processen för alla sex lutningar. Tillsätt sedan 20% sackaroslösning till botten av rören följt av 30, 40 och 50%Samla CD1-musembryon på embryonal dag 12 och placera dem i en 10 centimeters tallrik som innehåller iskallt HBSS på is.Under dissekeringsområdet överför du ett embryo till en sex centimeters tallrik som innehåller iskallt HBSS. Använd nålar med 21 till 23 mätare för att fästa huvudets position genom att tränga in genom ögonen i 45 graders vinkel och applicera en kraft för att se till att nålarna är fixerade på plattan. Använd nummer fem tång för att ta bort huden och skallen som arbetar från mitten till sidorna, skär sedan luktlökarna och ta bort hjärnhinnorna för att exponera de kortikala vävnaderna.Använd böjda tångar för att skära de kortikala vävnaderna i två till tre milliliter neurobasalt medium på is. Dra vävnaderna från olika embryon efter behov. Vävnader från åtta till tio embryon ger vanligtvis cirka 200 mikrogram totalt RNA.Tillsätt cykloheximid till det neurobasala mediet med de dissekerade vävnaderna till en slutlig koncentration på 100 mikrogram per milliliter och inkubera vid 37 grader Celsius i 10 minuter. Centrifugera vävnaden vid 500 x g i fem minuter vid fyra grader Celsius och kassera supernaten. Tvätta vävnaderna två gånger med iskallt PBS kompletterat med 100 mikrogram per milliliter cykloheximid.Tillsätt 500 mikroliter celllysbuffert kompletterad med fyra mikroliter RNase-hämmare och pipett upp och ner för att återanvända vävnaden. Använd en insulinnål för att försiktigt lysa vävnaden. Inkubera sedan på is i 10 minuter med kort virvelvind varannan till var tredje minut.Efter inkubationen, centrifugera lysatet vid 2000 x g i fem minuter vid fyra grader Celsius och överför supernatanten till ett nytt centrifugeringsrör på is. Upprepa denna process igen centrifugering vid 13 000 x g. Efter överföring av supernatanten till ett nytt centrifugeringsrör på is, mät RNA-koncentrationen i vävnadslysset med hjälp av en UV-Vis-spektrofotometer.Ladda proverna ovanpå sackarosgradienterna genom att långsamt dela ut lysatet på väggarna i ultracentrifugerören. Placera försiktigt sackarosgradienterna i hinkarna och ultracentrera proverna vid 190, 000 x g och fyra grader Celsius i 90 minuter. Placera ett tomt ultracentrifugerör på rör piercern och penetrera försiktigt röret med nålen från botten.Fyll en 30 milliliter spruta med 25 milliliter 60% sackarosjaktlösning. Tryck sedan försiktigt på sprutan så att jaktlösningen fyller det tomma röret och går igenom 254 nanometers UV-monitor för att ställa in baslinjen för detektion. Tryck på auto zero på UV-monitorn för att registrera en baslinje för detektering och tryck sedan på Spela upp programvaran för att börja spela in.När systemet har upprättat en baslinje pausar du inspelningen av programvaran och drar tillbaka jaktlösningen och ser till att ingen kvarvarande jaktlösning finns kvar i systemet. Ladda ett provrör på rör piercern och penetrera försiktigt röret med nålen från botten. Börja spela in på programvaran, se till att det inte finns några luftbubblor i linjen.Starta sedan sprutpumpen och fraktionssamlaren för att samla polysome fraktioner och ställ in fraktioneraren på 30 sekunder. Samla fraktionerna i 1,5 milliliter rör. När lysat som innehåller RNA som drogs från åtta embryon separerades av en sackarosgradient i 12 fraktioner.Toppar av UV-absorbans vid 254 nanometer identifierade fraktioner som innehåller 40S-underenheten 60S underenhet och 80S monosom och polyomer. Analys av fraktioner av western blot för den stora ribosomal underenheten Rpl10 visade dess närvaro i 60S underavdelning monosomer och polysomes. Cytoplasmaproteiner, Gapdh och Csde1, var däremot inte associerade med ribosomer, men berikades i fraktioner som innehöll fritt RNA.I överensstämmelse med separationen av proteiner i olika fraktioner var Gapdh och sox2 mRNAs mycket berikade i fraktionerna som innehåller tunga polysomer, vilket tyder på att dessa mRNAs effektivt översätts i utvecklingsbarken. Däremot berikades rpl7 och rpl35 mRNAs i fraktionen som innehåller monosomer, vilket tyder på förträngd översättning. För att uppnå reproducerbara resultat är det viktigt att upprätthålla konsekvensen i att göra sackarosgradienter.Sprutpumparna ska användas för att skjuta ut sackarosen. Under fraktionering och provuppsamling är det viktigt att tvätta systemet med RNase-fritt vatten. Detta minskar eventuella kvarvarande sackaros från föregående prov.Denna metod kan användas för att bedöma översättningsstatusen för mRNAs i olika vävnader. Med hjälp av plattformen kan konsekventa gradienter för polysome profilering erhållas, vilket ger en billig lösning för denna klassiska och användbara teknik.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mosaic Analysis of Gene Function in Postnatal Mouse Brain Development by Using Virus-based Cre Recombination

Mosaik analys av geners funktion i Postnatal mus hjärnans utveckling med hjälp av Virus-baserade Cre Rekombination

Normal brain function relies not only on embryonic development when major neuronal pathways are established, but also on postnatal 
development when ...

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

In vivo elektroporering av utvecklingsländer Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Single-cell Profiling of Developing and Mature Retinal Neurons

Encelliga Profilering av u och mogen näthinneneuroner

Highly specialized, but exceedingly small populations of cells play important roles in many tissues. The identification of cell-type specific markers and ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Visualisering och Genetic Manipulation av dendriter och ryggar i mus hjärnbarken och hippocampus med användning av<em&gt; I utero</em&gt; Elektroporering

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Assessing Cell Cycle Progression of Neural Stem and Progenitor Cells in the Mouse Developing Brain after Genotoxic Stress

Uppskatta cellcykelprogression av neurala stam och progenitorceller i musen framkallande hjärnan efter genotoxisk stress

Neurons of the cerebral cortex are generated during brain development from different types of neural stem and progenitor cells (NSPC), which form a ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Live avbildning av Mitos i utvecklings Mouse embryonala Cortex

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Imaging Serotonergic Fibers in the Mouse Spinal Cord Using the CLARITY/CUBIC Technique

Imaging Serotonerga Fibrer i ryggmärgen hos möss med hjälp av CLARITY / CUBIC teknik

Long descending fibers to the spinal cord are essential for locomotion, pain perception, and other behaviors. The fiber termination pattern in the spinal ...

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids

Modellering Zika Virus infektion av utveckla mänskliga hjärnan In Vitro med stamceller härstammar Cerebral Organoids

The recent emergence of Zika virus (ZIKV) in susceptible populations has led to an abrupt increase in microcephaly and other neurodevelopmental conditions ...

Quantifying the Heterogeneous Distribution of a Synaptic Protein in the Mouse Brain Using Immunofluorescence

Kvantifiera heterogen fördelning av ett Synaptic Protein i mus hjärnan med hjälp av immunofluorescens

The presence, absence, or levels of specific synaptic proteins can severely influence synaptic transmission. In addition to elucidating the function of a ...

Chronic Implantation of Whole-cortical Electrocorticographic Array in the Common Marmoset

Kronisk Implantation av hela-kortikala Electrocorticographic matris i Marmosettapa

Electrocorticography (ECoG) allows the monitoring of electrical field potentials from the cerebral cortex with high spatiotemporal resolution. Recent ...