Name: massive pontine hemorrhage by dual injection of autologous blood
Uploaded: 2021-05-29T12:30:00
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Questo studio è stato sostenuto finanziariamente dalla National Science Foundation of China (81471181 e 81870933) e dal Programma di laboratorio di apertura della Guangzhou Medical University (0506308) a Y Jiang, e dalla National Science Foundation of China (81701471) e dal Programma Scientifico della Guangzhou Municipal Health Commission (20191A011083) a Z Qiu e dalla National Science Foundation of China (81501009) a L Wu.

Il protocollo è stato rivisto e approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del secondo ospedale affiliato dell'Università medica di Guangzhou. I ratti sono stati forniti dall'Animal Center della Southern Medical University. Il progetto sperimentale è illustrato nella figura 1.
1. Animali e strumenti
<ol><li>Utilizzare ratti Sprague-Dawley maschi di 8 settimane del peso di 250 ± 10 g.</li>
	<li>Ospitare i ratti per almeno 7 giorni ...

<ol>
	<li>Charidimou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+hemorrhage+recurrence,+small+vessel+disease+type,+and+cerebral+microbleeds:+A+meta-analysis.">Brain hemorrhage recurrence, small vessel disease type, and cerebral microbleeds: A meta-analysis.</a> Neurology. 89 (8), 820-829 (2017).</li><li>Tao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+brainstem+hemorrhage+model+by+autologous+blood+infusion+in+Rat:+White+Matter+Injury,+Magnetic+Resonance+Imaging,+and+Neurobehavioral+features.">A novel brainstem hemorrhage model by autologous blood infusion in Rat: White Matter Injury, Magnetic Resonance Imaging, and Neurobehavioral features.</a> Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 25 (5), 1102-1109 (2016).</li><li>Ichimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+treatment+for+primary+brainstem+hemorrhage+to+improve+postoperative+functional+outcomes.">Surgical treatment for primary brainstem hemorrhage to improve postoperative functional outcomes.</a> World Neurosurgery. 120, 1289-1294 (2018).</li><li>Behrouz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+factors+in+pontine+haemorrhage:+A+systematic+review.">Prognostic factors in pontine haemorrhage: A systematic review.</a> European Stroke Journal. 3 (2), 101-109 (2018).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brainstem+iron+overload+and+injury+in+a+rat+model+of+brainstem+hemorrhage.">Brainstem iron overload and injury in a rat model of brainstem hemorrhage.</a> Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 29 (8), 104956 (2020).</li><li>Chung, Y., Haines, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+brain+stem+surgery.">Experimental brain stem surgery.</a> Neurosurgery Clinics of North America. 4 (3), 405-414 (1993).</li><li>Lekic, T., Tang, J., Zhang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rat+model+of+pontine+hemorrhage.">A rat model of pontine hemorrhage.</a> Acta Neurochirurgica Supplement. 105, 135-137 (2008).</li><li>Lekic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+hematoma+consequences,+neurobehavioral+profiles,+and+histopathology+in+a+rat+model+of+pontine+hemorrhage.">Evaluation of the hematoma consequences, neurobehavioral profiles, and histopathology in a rat model of pontine hemorrhage.</a> Journal of Neurosurgery. 118 (2), 465-477 (2013).</li><li>Shrestha, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+brainstem+hemorrhage+model:+Key+points+to+success+in+modeling.">Rat brainstem hemorrhage model: Key points to success in modeling.</a> World Neurosurgery. 117, 106-116 (2018).</li><li>Luo, M., Tang, X., Zhu, J., Qiu, Z., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+acute+pontine+infarction+in+rats+by+electrical+stimulation.">Establishment of acute pontine infarction in rats by electrical stimulation.</a> Journal of Visualized Experiments. (162), (2020).</li><li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keep+warm+and+get+success:+The+role+of+postischemic+temperature+in+the+mouse+middle+cerebral+artery+occlusion+model.">Keep warm and get success: The role of postischemic temperature in the mouse middle cerebral artery occlusion model.</a> Brain Research Bulletin. 101, 12-17 (2014).</li></ol>

Nel presente studio, abbiamo fornito un protocollo per generare un massiccio modello di ratto emorragico pontino. Questo modello può essere utilizzato per la ricerca sul meccanismo fisiopatrologico e sulla prognosi di emorragia pontina massiccia.
Durante l'esperimento sono stati utilizzati 25 ratti, di cui solo uno è morto. La verifica della risonanza prima, dell'anatomia grossolana e della colorazione HE ha indicato che questo metodo aveva un tasso di mortalità molto basso e un alto tasso ...

L'emorragia intracerebrale rappresenta un quinto dei pazienti con ictus. La prognosi dell'emorragia intracerebrale dipende dalla velocità, dal volume e dalla posizione del sanguinamento1,2. Rispetto all'emorragia delencefalo, l'emorragia del tronco encefalico ha una mortalità e una morbilitàpiù elevate 3. Circa il 40% dell'emorragia del tronco encefalico si verifica nei pons4. L'eziologia e la fisiopatologia dell'emorragia pontina sono molto diverse e meno studiate dell'emorragia di prebrain5.
Esistono due tipi di modelli animali di emorragia pontina. Uno è il modello di emorragia spontanea indotto dall'infusione di collagenasi batterica nei pons6,7,8. Il più grande vantaggio di questo modello è che il sanguinamento è spontaneo. Tuttavia, la collagenasi può indurre solo un piccolo volume di emorragia pontina. Inoltre, la collagenasi potrebbe causare altre lesioni al cervello. L'altro modello è indotto dall'iniezione stereotassica di sangue autologo nei pons9. Il vantaggio di questo modello è che è facile da padroneggiare con un alto tasso di successo. Teoricamente, i ricercatori potrebbero iniettare qualsiasi volume di sangue in qualsiasi posizione di pons. Tuttavia, a causa della perdita posteriore attraverso il percorso dell'ago, il volume iniettato è limitato. Recentemente, il metodo a doppia iniezione è stato promosso per ridurre la perdita di schiena9. Questo metodo inietta sangue autologo due volte con un intervallo di 20 minuti tra le iniezioni. Il metodo a doppia iniezione viene applicato per indurre un'emorragia pontina lieve (30 μL) e moderata (60 μL) ma non massiccia emorragia pontina. In clinica, la maggior parte dei pazienti con emorragia pontina con prognosi infausta ha un'emorragia massiccia (più di 10 mL).
Nello studio precedente, abbiamo fornito un protocollo per stabilire un modello di ictus ischemico pontino nel ratto10. In questo studio, modifichiamo il metodo di doppia iniezione esistente e forniamo un protocollo dettagliato per indurre un'emorragia pontina massiccia in un ratto con doppia iniezione di sangue autologo da 100 μL in due diverse posizioni nei pons.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100ml Saline solution</td>
			<td>Guangdong yixiang</td>
			<td>191222201 C1</td>
			<td>Preparing heparin diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#956;l Microinjector</td>
			<td>Shanghai Gaoge</td>
			<td></td>
			<td>Injection of autologous blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Syringe</td>
			<td>Jiangsu Zhiyu</td>
			<td>20191014</td>
			<td>Withdraw autologous blood from the tail vein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% Alcohol</td>
			<td>Shandong Lierkang</td>
			<td></td>
			<td>Disinfection of rat tail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape</td>
			<td>Shanghai Jinzhong</td>
			<td></td>
			<td>Surgicl instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal anesthesia system</td>
			<td>RWD</td>
			<td>R510-31S-6</td>
			<td>Inducing and maintaining anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance beam</td>
			<td>Jiangsu Saiangsi</td>
			<td></td>
			<td>For neurological deficit scores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades</td>
			<td>Shanghai Feiying</td>
			<td>74-C</td>
			<td>For gross anatomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone cement</td>
			<td>Shanghai Xinshiji</td>
			<td>20180306</td>
			<td>Surgicl instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain tank</td>
			<td>Shenzhen LEIYEA</td>
			<td></td>
			<td>For gross anatomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butorphanol tartrate</td>
			<td>Jiangsu Hengrui</td>
			<td></td>
			<td>For pain management</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric cranial drill</td>
			<td>Nanjing&#160; Darwin biotechnology</td>
			<td>20180090018</td>
			<td>Making a burr hole on the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP tube</td>
			<td>Nantong Surui</td>
			<td></td>
			<td>Transfer autologous blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythromycin eye cream</td>
			<td>Yunnan pharmacy</td>
			<td></td>
			<td>Eyes protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HE dye liquor</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1120</td>
			<td>For HE staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating&#160;pad</td>
			<td>Dangerous Jungle</td>
			<td>JR01</td>
			<td>Keeping warm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium injection</td>
			<td>Chengdu Haitong Pharmacal Company</td>
			<td>190701</td>
			<td>Preparing heparin diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IndoPhors</td>
			<td>Guoyao of China</td>
			<td></td>
			<td>Sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>RWD</td>
			<td>20080701</td>
			<td>Inducing and maintaining anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light dark box</td>
			<td>Jiangsu Saiangsi</td>
			<td></td>
			<td>For neurological deficit scores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-injection pump</td>
			<td>Baoding Leifu</td>
			<td>TFD03-01-C</td>
			<td>Injection of autologous blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRI system</td>
			<td>Philips</td>
			<td></td>
			<td>Confirmation of infarction in vivo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>Shanghai Jinzhong</td>
			<td>J32020</td>
			<td>Surgicl instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin</td>
			<td>Guoyao of China</td>
			<td></td>
			<td>Infection Prevention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-tips</td>
			<td>Jiangxi Songhe</td>
			<td></td>
			<td>Surgicl instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalp heedle</td>
			<td>Jiangxi Hongda</td>
			<td>20200313</td>
			<td>Withdraw autologous blood from the tail vein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Shanghai Kaiyuan</td>
			<td>170902</td>
			<td>Surgicl instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shearing scissors</td>
			<td>Shanghai Jinzhong</td>
			<td>Y00040</td>
			<td>Surgicl instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic apparatus</td>
			<td>RWD</td>
			<td>900-00001-00</td>
			<td>for surgical positioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical towel</td>
			<td>Xinxiang Huakangweicai</td>
			<td>20070601</td>
			<td>Surgicl instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture needle</td>
			<td>Shanghai Jinzhong</td>
			<td></td>
			<td>Surgicl instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture scissors</td>
			<td>Shanghai Jinzhong</td>
			<td>J25041</td>
			<td>Surgicl instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue holding forcepts</td>
			<td>Shanghai Jinzhong</td>
			<td>J31080</td>
			<td>Surgicl instruments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

massive pontine hemorrhage by dual injection of autologous blood

Forniamo un protocollo per stabilire un massiccio modello di emorragia pontina in un topo. In questo studio sono stati utilizzati ratti del peso di circa 250 grammi. Cento microlitri di sangue autologo sono stati prelevati dalla vena della coda e iniettati stereotassicamente nei pons. Il processo di iniezione è stato diviso in 2 fasi: in primo luogo, 10 μL di sangue sono stati iniettati in una posizione specifica, posizione anteroposterior (AP) -9,0 mm; laterale (Lat) 0 mm; verticale (Vert) -9,2 mm, seguito da una seconda iniezione del sangue residuo situato ad AP -9,0 mm; Lat 0 mm; Vert -9,0 mm con un intervallo di 20 minuti. Il test del fascio di equilibrio, il test di posizionamento degli arti e il neuroscore Voestch modificato sono stati utilizzati per valutare la funzione neurologica. La risonanza magnetica (MRI) è stata utilizzata per valutare il volume di emorragia in vivo. I sintomi di questo modello erano in linea con i pazienti con massiccia emorragia pontina.

Sono stati utilizzati complessivamente 25 animali, 3 per il controllo, 6 per 30 μL, 6 per 60 μL e 10 per 100 μL di iniezioni di sangue. Un topo che ha ricevuto un'iniezione di 100 μL di sangue autologo (1/10) è morto entro 24 ore dall'intervento chirurgico.
I test comportamentali sono stati condotti il giorno 1, il giorno 3, il giorno 7 e il giorno 14 dopo l'intervento chirurgico. I punteggi per il gruppo di controllo e i g...

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Massive Pontine Hemorrhage by Dual Injection of Autologous Blood

Presentiamo un protocollo per stabilire un massiccio modello di emorragia pontina in un ratto attraverso la doppia iniezione di sangue autologo.

Emorragia pontina massiccia per doppia iniezione di sangue autologo

We provide a protocol to establish a massive pontine hemorrhage model in a rat. Rats weighing about 250 grams were used in this study. One hundred ...

Forniamo un protocollo per stabilire un'emorragia pontina massiccia in un topo. Questo modello è facile da stabilire, ripetibile e di grande successo. L'iniezione distillata di metodo autologo del ratto potrebbe essere utilizzata per fare emorragia in una qualsiasi delle regioni cerebrali.Le persone che vogliono provare queste tecniche dovrebbero imparare a usare una cornice stereotassica ed avere familiarità con l'anatomia pontina. Inizia posizionando un drappo chirurgico sul topo. Fai un'incisione con un bisturi lungo la linea mediana marcata.Utilizzare un batuffolo di cotone per rimuovere qualsiasi potenziale sangue. Quindi posizionare un pezzo di forcep su ciascun lato del lembo del cuoio capelluto per esporre il cranio. Immergere un batuffolo di cotone nello 0,9% di soluzione salina e rimuovere delicatamente i tessuti connettivi dall'osso cranica.Utilizzare una penna marcatore per contrassegnare il punto centrale del bregma come punto di origine. Eseguire una craniotomia utilizzando un micro trapano, procedendo con attenzione. Al termine rimuovere il micro trapano dal telaio stereotassico.Mettere una siringa Hamilton da 100 microliter nel supporto stereotassico. Accendere l'interruttore della pompa di iniezione. Fare clic sul pulsante di inalazione rapida.Quindi aspirare la soluzione di eparina a 100 microlitri e scaricarla completamente. Applicare la clorexidina e lo scrub chirurgico al 75% di alcol su tutto il racconto dalla radice alla punta almeno tre volte per disinfettare la pelle, ammorbidire l'horniness e dilatare la vena della coda per aumentare il tasso di successo dell'iniezione. Attaccare un'agopuntura del cuoio capelluto a una siringa millilitro, quindi inserire l'agopuntura del cuoio capelluto in una vena laterale della coda a tre centimetri dalla punta della coda e assumere 150 microlitri di sangue.Rimuovere l'agopuntura del cuoio capelluto dalla siringa da un millilitro e trasferire il sangue in un tubo. Lavorare rapidamente per prevenire la coagulazione del sangue. Cambia i guanti chirurgici.Selezionare la modalità di ritiro. Impostare il volume su 100 microlitri e impostare la velocità su 200 microlitri al minuto. Fare clic sul pulsante di corsa e aspirare 100 microlitri di sangue nella siringa Hamilton.Passare alla modalità infuso e impostare la velocità su un microliter al minuto. Far avanzare la siringa fino a raggiungere i 9,2 millimetri sotto la superficie del cervello e iniettare i primi 10 microlitri di sangue. Clicca sul pulsante esegui.Interrompere l'iniezione e lasciare la siringa in posizione per 20 minuti per evitare che il sangue flui nello spazio subaracnoideo. Ritrarre la siringa fino a quando la punta arriva a nove millimetri sotto la superficie del cervello, quindi riavviare l'iniezione alla stessa velocità di un microlitro al minuto fino a quando il sangue residuo non è stato iniettato completamente. Lasciare la siringa in posizione per 10 minuti per evitare il riflusso sanguigno.Rimuovere lentamente la siringa dal cervello. Quindi utilizzare cemento osseo per coprire il foro di craniotomia. Quando il cemento asciuga la sutura la ferita con un filamento di sutura di poliammide a quattro zero.Dopo aver cucito tre o quattro punti legare 2 nodi chirurgici standard uno-uno. Osservare il topo ogni 15 minuti fino a quando non si riprende completamente dall'anestesia, quindi restituirlo alla gabbia originale con una pastiglia riscaldante sotto. Fornire al topo libero accesso a cibo e acqua.Un totale di 25 animali sono stati utilizzati per il controllo di 30 microliter, 60 microliter e 100 iniezioni di sangue di microliter. I test comportamentali sono stati condotti nei giorni uno, tre, sette e 14 dopo l'intervento chirurgico. L'emorragia pontina causò deficit neurologici come un riflesso corneale diminuito e un cerchio.L'iniezione di 100 microlitri di sangue ha anche indotto la miotonia. La risonanza testurica è stata eseguita 24 ore dopo l'intervento chirurgico. Nei gruppi di iniezione di sangue, l'emorragia è stata rilevata come un bordo di ipointense con un nucleo ISO a leggermente iperintense nella parte basiler degli stagni.Il volume dell'emorragia è aumentato con il volume dell'iniezione. I ratti sono stati sacrificati a 24 ore e 14 giorni dopo l'intervento chirurgico. E sono state realizzate due sezioni spesse due millimetri.È stata rilevata un'emorragia che circonda il sito di iniezione e si distribuisce nella base degli stagni. C'è stato un leggero edema intorno all'emorragia nel gruppo di iniezione di sangue da 100 microliter. Alcuni ratti sono stati sacrificati tre giorni dopo l'intervento chirurgico e le sezioni di paraffina sono state fatte per la colorazione HE.I risultati hanno mostrato che nei gruppi di iniezione del sangue le cellule infiammatorie arricchite nella zona di para emorragia l'emoglobina è rimasta contenuta con globuli rossi intatti. Quando si tenta questo protocollo assicurarsi di ricordare la posizione di iniezione. Questo metodo può essere utilizzato per indurre un'emorragia in qualsiasi specifica regione cerebrale.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Dual Somatic Recordings from Gonadotropin-Releasing Hormone GnRH Neurons Identified by Green Fluorescent Protein GFP in Hypothalamic Slices

Doppio registrazioni somatica da Gonadotropina-Releasing Hormone (GnRH) Neuroni Identificato da una proteina fluorescente verde (GFP) in fette ipotalamici

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hemorrhage (ICH) requires a reproducible animal model.  While ICH
accounts for 10-15% ...

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