Name: massive pontine hemorrhage by dual injection of autologous blood
Uploaded: 2021-05-29T12:30:00
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Este estudo foi apoiado financeiramente pela Fundação Nacional de Ciência da China (81471181 e 81870933) e pelo Programa de Laboratório de Abertura da Universidade Médica de Guangzhou (0506308) para Y Jiang, e pela Fundação Nacional de Ciência da China (81701471) e pelo Programa Científico da Comissão Municipal de Saúde de Guangzhou (20191A01083) para Z Qiu, e pela Fundação Nacional de Ciência da China (81501009) para L Wu.

O protocolo foi revisado e aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Segundo Hospital Afiliado da Universidade Médica de Guangzhou. Os ratos foram fornecidos pelo Centro Animal da Universidade Médica do Sul. O design experimental é mostrado na Figura 1.
1. Animais e instrumentos
<ol><li>Use ratos sprague-dawley machos de 8 semanas pesando 250 ± 10 g.</li>
	<li>Abrigar os ratos por pelo menos 7 dias antes da cirurgia sob condições ...

<ol>
	<li>Charidimou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+hemorrhage+recurrence,+small+vessel+disease+type,+and+cerebral+microbleeds:+A+meta-analysis.">Brain hemorrhage recurrence, small vessel disease type, and cerebral microbleeds: A meta-analysis.</a> Neurology. 89 (8), 820-829 (2017).</li><li>Tao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+brainstem+hemorrhage+model+by+autologous+blood+infusion+in+Rat:+White+Matter+Injury,+Magnetic+Resonance+Imaging,+and+Neurobehavioral+features.">A novel brainstem hemorrhage model by autologous blood infusion in Rat: White Matter Injury, Magnetic Resonance Imaging, and Neurobehavioral features.</a> Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 25 (5), 1102-1109 (2016).</li><li>Ichimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+treatment+for+primary+brainstem+hemorrhage+to+improve+postoperative+functional+outcomes.">Surgical treatment for primary brainstem hemorrhage to improve postoperative functional outcomes.</a> World Neurosurgery. 120, 1289-1294 (2018).</li><li>Behrouz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+factors+in+pontine+haemorrhage:+A+systematic+review.">Prognostic factors in pontine haemorrhage: A systematic review.</a> European Stroke Journal. 3 (2), 101-109 (2018).</li><li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brainstem+iron+overload+and+injury+in+a+rat+model+of+brainstem+hemorrhage.">Brainstem iron overload and injury in a rat model of brainstem hemorrhage.</a> Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases. 29 (8), 104956 (2020).</li><li>Chung, Y., Haines, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+brain+stem+surgery.">Experimental brain stem surgery.</a> Neurosurgery Clinics of North America. 4 (3), 405-414 (1993).</li><li>Lekic, T., Tang, J., Zhang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rat+model+of+pontine+hemorrhage.">A rat model of pontine hemorrhage.</a> Acta Neurochirurgica Supplement. 105, 135-137 (2008).</li><li>Lekic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+hematoma+consequences,+neurobehavioral+profiles,+and+histopathology+in+a+rat+model+of+pontine+hemorrhage.">Evaluation of the hematoma consequences, neurobehavioral profiles, and histopathology in a rat model of pontine hemorrhage.</a> Journal of Neurosurgery. 118 (2), 465-477 (2013).</li><li>Shrestha, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rat+brainstem+hemorrhage+model:+Key+points+to+success+in+modeling.">Rat brainstem hemorrhage model: Key points to success in modeling.</a> World Neurosurgery. 117, 106-116 (2018).</li><li>Luo, M., Tang, X., Zhu, J., Qiu, Z., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+acute+pontine+infarction+in+rats+by+electrical+stimulation.">Establishment of acute pontine infarction in rats by electrical stimulation.</a> Journal of Visualized Experiments. (162), (2020).</li><li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keep+warm+and+get+success:+The+role+of+postischemic+temperature+in+the+mouse+middle+cerebral+artery+occlusion+model.">Keep warm and get success: The role of postischemic temperature in the mouse middle cerebral artery occlusion model.</a> Brain Research Bulletin. 101, 12-17 (2014).</li></ol>

No presente estudo, fornecemos um protocolo para gerar um modelo maciço de rato de hemorragia pontina. Este modelo pode ser usado para a pesquisa sobre o mecanismo fisioterásio e prognóstico de hemorragia pontina maciça.
Ao longo do experimento, foram usados 25 ratos, dos quais apenas um morreu. A verificação da ressonância magnética, da anatomia bruta e da coloração do HE indicaram que este método tinha uma taxa de mortalidade muito baixa e uma alta taxa de sucesso. Para estabelece...

Hemorragia intracerebral é responsável por um quinto dos pacientes com AVC. O prognóstico da hemorragia intracerebral depende da velocidade, volume e localização do sangramento1,2. Em comparação com a hemorragia do cérebro, a hemorragia cerebral tem maior mortalidade e morbidade3. Cerca de 40% da hemorragia cerebral ocorre nos pons4. A etiologia e a fisiopatologia da hemorragia pontina são bem diferentes e menos estudadas do que a hemorragia do antebraína5.
Há dois tipos de modelos animais de hemorragia pontina. Um deles é o modelo de hemorragia espontânea induzido pela infusão de colagem bacteriana nos pons6,7,8. A maior vantagem deste modelo é que o sangramento é espontâneo. No entanto, a colagemnase só pode induzir um pequeno volume de hemorragia pontina. Além disso, a colagem pode causar outras lesões no cérebro. O outro modelo é induzido pela injeção estereotática de sangue autólogo no pons9. A vantagem deste modelo é que é fácil dominar com uma alta taxa de sucesso. Teoricamente, os pesquisadores poderiam injetar qualquer volume de sangue em qualquer local de pons. No entanto, devido ao vazamento de volta através da rota da agulha, o volume injetado é limitado. Recentemente, o método de dupla injeção foi promovido para reduzir o vazamento de volta9. Este método injeta sangue autólogo duas vezes com um intervalo de 20 minutos entre as injeções. O método de dupla injeção é aplicado para induzir hemorragia pontina leve (30 μL) e moderada (60 μL), mas não hemorragia pontina maciça. Na clínica, a maioria dos pacientes com hemorragia pontina com prognóstico ruim tem hemorragia maciça (mais de 10 mL).
No estudo anterior, fornecemos um protocolo para estabelecer um modelo de derrame isquêmico pontino no rato10. Neste estudo, modificamos o método de dupla injeção existente, e fornecemos um protocolo detalhado para induzir hemorragia pontina maciça em um rato por injeção dupla de 100 μL de sangue autólogo em dois locais diferentes nos pons.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100ml Saline solution</td>
			<td>Guangdong yixiang</td>
			<td>191222201 C1</td>
			<td>Preparing heparin diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100&#956;l Microinjector</td>
			<td>Shanghai Gaoge</td>
			<td></td>
			<td>Injection of autologous blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1ml Syringe</td>
			<td>Jiangsu Zhiyu</td>
			<td>20191014</td>
			<td>Withdraw autologous blood from the tail vein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75% Alcohol</td>
			<td>Shandong Lierkang</td>
			<td></td>
			<td>Disinfection of rat tail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive tape</td>
			<td>Shanghai Jinzhong</td>
			<td></td>
			<td>Surgicl instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal anesthesia system</td>
			<td>RWD</td>
			<td>R510-31S-6</td>
			<td>Inducing and maintaining anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance beam</td>
			<td>Jiangsu Saiangsi</td>
			<td></td>
			<td>For neurological deficit scores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blades</td>
			<td>Shanghai Feiying</td>
			<td>74-C</td>
			<td>For gross anatomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone cement</td>
			<td>Shanghai Xinshiji</td>
			<td>20180306</td>
			<td>Surgicl instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain tank</td>
			<td>Shenzhen LEIYEA</td>
			<td></td>
			<td>For gross anatomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Butorphanol tartrate</td>
			<td>Jiangsu Hengrui</td>
			<td></td>
			<td>For pain management</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric cranial drill</td>
			<td>Nanjing&#160; Darwin biotechnology</td>
			<td>20180090018</td>
			<td>Making a burr hole on the skull</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EP tube</td>
			<td>Nantong Surui</td>
			<td></td>
			<td>Transfer autologous blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erythromycin eye cream</td>
			<td>Yunnan pharmacy</td>
			<td></td>
			<td>Eyes protection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HE dye liquor</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1120</td>
			<td>For HE staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating&#160;pad</td>
			<td>Dangerous Jungle</td>
			<td>JR01</td>
			<td>Keeping warm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium injection</td>
			<td>Chengdu Haitong Pharmacal Company</td>
			<td>190701</td>
			<td>Preparing heparin diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IndoPhors</td>
			<td>Guoyao of China</td>
			<td></td>
			<td>Sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>RWD</td>
			<td>20080701</td>
			<td>Inducing and maintaining anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light dark box</td>
			<td>Jiangsu Saiangsi</td>
			<td></td>
			<td>For neurological deficit scores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-injection pump</td>
			<td>Baoding Leifu</td>
			<td>TFD03-01-C</td>
			<td>Injection of autologous blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRI system</td>
			<td>Philips</td>
			<td></td>
			<td>Confirmation of infarction in vivo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle holder</td>
			<td>Shanghai Jinzhong</td>
			<td>J32020</td>
			<td>Surgicl instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin</td>
			<td>Guoyao of China</td>
			<td></td>
			<td>Infection Prevention</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-tips</td>
			<td>Jiangxi Songhe</td>
			<td></td>
			<td>Surgicl instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalp heedle</td>
			<td>Jiangxi Hongda</td>
			<td>20200313</td>
			<td>Withdraw autologous blood from the tail vein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Shanghai Kaiyuan</td>
			<td>170902</td>
			<td>Surgicl instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shearing scissors</td>
			<td>Shanghai Jinzhong</td>
			<td>Y00040</td>
			<td>Surgicl instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic apparatus</td>
			<td>RWD</td>
			<td>900-00001-00</td>
			<td>for surgical positioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical towel</td>
			<td>Xinxiang Huakangweicai</td>
			<td>20070601</td>
			<td>Surgicl instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture needle</td>
			<td>Shanghai Jinzhong</td>
			<td></td>
			<td>Surgicl instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture scissors</td>
			<td>Shanghai Jinzhong</td>
			<td>J25041</td>
			<td>Surgicl instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue holding forcepts</td>
			<td>Shanghai Jinzhong</td>
			<td>J31080</td>
			<td>Surgicl instruments</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

massive pontine hemorrhage by dual injection of autologous blood

Nós fornecemos um protocolo para estabelecer um modelo maciço de hemorragia pontina em um rato. Foram utilizados neste estudo ratos com cerca de 250 gramas. Cem microliters de sangue autólogo foram retirados da veia da cauda e estereotipados injetados nos pons. O processo de injeção foi dividido em 2 etapas: Primeiro, 10 μL de sangue foi injetado em um local específico, posição anteroposterior (AP) -9,0 mm; lateral (Lat) 0 mm; vertical (Vert) -9,2 mm, seguida de uma segunda injeção do sangue residual localizado em AP -9,0 mm; Lat 0 mm; Vert -9,0 mm com um intervalo de 20 minutos. O teste do feixe de equilíbrio, o teste de colocação dos membros e o neuroscore Voestch modificado foram utilizados para avaliar a função neurológica. A Ressonância Magnética (RM) foi utilizada para avaliar o volume de hemorragia in vivo. Os sintomas deste modelo estavam em consonância com pacientes com hemorragia pontina maciça.

Foram utilizados 25 animais, 3 para controle, 6 para 30 μL, 6 para 60 μL e 10 para injeções de sangue de 100 μL. Um rato que recebeu uma injeção de 100 μL de sangue autólogo (1/10) morreu dentro de 24 horas após a cirurgia.
Os exames comportamentais foram realizados no dia 1º, dia 3, dia 7 e dia 14 após a cirurgia. As pontuações para o grupo controle e grupos de injeção de sangue em diferentes pontos de tempo ap?...

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Massive Pontine Hemorrhage by Dual Injection of Autologous Blood

Apresentamos um protocolo para estabelecer um modelo maciço de hemorragia pontina em um rato através de dupla injeção de sangue autólogo.

Hemorragia pontina maciça por dupla injeção de sangue autólogo

We provide a protocol to establish a massive pontine hemorrhage model in a rat. Rats weighing about 250 grams were used in this study. One hundred ...

Nós fornecemos um protocolo para estabelecer hemorragia pontina maciça em um rato. Este modelo é fácil de estabelecer, repetível e altamente bem sucedido. Injeção destilada de método de rato autólogo poderia ser usada para causar hemorragia em qualquer uma das regiões cerebrais.As pessoas que querem experimentar essas técnicas devem aprender a usar um quadro estereotaxic, e estar familiarizados com a anatomia pontina. Comece colocando uma cortina cirúrgica sobre o mouse. Faça uma incisão com um bisturi ao longo da linha média marcada.Use um cotonete para remover qualquer sangue em potencial. Em seguida, coloque um pedaço de fórceps em cada lado da aba do couro cabeludo para expor o crânio. Mergulhe um cotonete em 0,9% salino e remova suavemente os tecidos conjuntivos do osso do crânio.Use uma caneta marcadora para marcar o ponto central do bregma como o ponto de origem. Faça uma craniotomia usando uma micro broca, procedendo cuidadosamente. Quando terminar, remova a micro broca do quadro estereotaxic.Coloque uma seringa Hamilton de 100 microliter no suporte estereotipado. Ligue o interruptor da bomba de injeção. Clique no botão de inalação rápida.Em seguida, aspirar a solução de heparina para 100 microliters e drená-la completamente. Aplique clorexidina e 75% de álcool esfoliante cirúrgico em todo o conto da raiz à ponta pelo menos três vezes para desinfetar a pele, suavizar o chifre e dilatar a veia da cauda para aumentar a taxa de sucesso da injeção. Conecte uma acupuntura do couro cabeludo a uma seringa de um mililitro, em seguida, insira a acupuntura do couro cabeludo em uma veia lateral da cauda três centímetros da ponta da cauda e tome 150 microliters de sangue.Remova a acupuntura do couro cabeludo da seringa de um mililitro e transfira o sangue para um tubo. Trabalhando rapidamente para evitar a coagulação do sangue. Troque as luvas cirúrgicas.Selecione o modo de retirada. Defina o volume para 100 microliters e ajuste a velocidade para 200 microliters por minuto. Clique no botão executar e aspire 100 microliters de sangue na seringa Hamilton.Mude para o modo de infusão e ajuste a velocidade para um microliter por minuto. Avance a seringa até que a ponta atinja 9,2 milímetros abaixo da superfície do cérebro e injete os primeiros 10 microliters de sangue. Clique no botão executar.Pare a injeção e deixe a seringa em posição por 20 minutos para evitar que o sangue flua para o espaço subaracnóide. Retraia a seringa até que a ponta chegue a nove milímetros abaixo da superfície do cérebro, em seguida, reinicie a injeção na mesma velocidade de um microliter por minuto até que o sangue residual tenha sido injetado completamente. Deixe a seringa em posição por 10 minutos para evitar o fluxo sanguíneo.Remova a seringa do cérebro lentamente. Em seguida, use cimento ósseo para cobrir o buraco da craniotomia. Quando o cimento seca a ferida com um filamento de sutura de poliamida de quatro zero.Depois de costurar três ou quatro pontos, amarre 2 nós cirúrgicos padrão de um a um. Observe o rato a cada 15 minutos até que ele se recupere totalmente da anestesia, em seguida, devolva-o para a gaiola original com uma almofada de aquecimento por baixo. Forneça ao rato acesso gratuito a comida e água.Foram utilizados 25 animais para controle de 30 microliter, 60 microliter e 100 injeções de sangue de microliter. Os testes comportamentais foram realizados nos dias um, três, sete e 14 após a cirurgia. A hemorragia pontina causou déficits neurológicos como reflexo córnea diminuído e circulação.A injeção de 100 microliters de sangue também induziu a miotonia. A ressonância magnética foi realizada 24 horas após a cirurgia. Nos grupos de injeção de sangue, a hemorragia foi detectada como uma borda de hipointense com iso para núcleo ligeiramente hiperintense na parte basiler das lagoas.O volume de hemorragia aumentou com o volume de injeção. Os ratos foram sacrificados às 24 horas e 14 dias após a cirurgia. E duas seções de espessura foram feitas.Hemorragia foi detectada ao redor do local da injeção e distribuída na base das lagoas. Houve um pequeno edema em torno da hemorragia no grupo de injeção de sangue de 100 microliter. Alguns dos ratos foram sacrificados três dias após a cirurgia e seções de parafina foram feitas para coloração he.Os resultados mostraram que nos grupos de injeção de sangue as células inflamatórias enriquecidas na zona de hemorragia para a hemoglobina permaneceram contidas com glóbulos vermelhos intactos. Ao tentar este protocolo certifique-se de lembrar a posição de injeção. Este método pode ser usado para induzir uma hemorragia em qualquer região cerebral específica.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Dupla Recordings somática de Hormônio Liberador de Gonadotropina (GnRH) Neurônios Identificados por proteína verde fluorescente (GFP) em fatias Hypothalamic

Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) is a small neuropeptide that regulates pituitary release of luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating ...

Neurociência

Gene Delivery to Postnatal Rat Brain by Non-ventricular Plasmid Injection and Electroporation

Entrega de genes ao cérebro pós-natal do rato por Non-ventricular Injection sHRNA e Eletroporação

Creation of transgenic animals is a standard approach in studying functions of a gene of interest in vivo. However, many knockout or transgenic animals ...

Autologous Blood Injection to Model Spontaneous Intracerebral Hemorrhage in Mice

Injeção de sangue autólogo de Modelo hemorragia intracerebral espontânea em ratos

Investigation of the pathophysiology of injury after intracerebral
hemorrhage (ICH) requires a reproducible animal model.  While ICH
accounts for 10-15% ...

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Imagens ao vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larval Neuroblastos

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Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% ...