Name: functional assessment of intestinal permeability and neutrophil transepithelial migration in mice using a standardized intestinal loop model
Uploaded: 2021-02-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model at JoVE.com

يشكر المؤلفون الدكتور سفين فليمنغ من جامعة فيرزبورغ على مساهماته في إنشاء نموذج حلقة القولون القريبة ، وشون واتسون لإدارة مستعمرات الماوس وتشيثرا ك. موراليداران للمساعدة في الحصول على صور نموذج iLoop. تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة الأبحاث الألمانية /DFG (BO 5776/2-1) إلى KB وR01DK079392 وR01DK072564 وR01DK061379 إلى C.A.P.

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية والسياسات للمعاهد الوطنية للصحة ووافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه في جامعة ميشيغان.
1. التحضير قبل الجراحة
ملاحظة: تم إنشاء هذه الطريقة باستخدام الفئران البالغة من خلفية C57BL/6 الوراث...

الآليات المسؤولة عن dysregulation من وظيفة حاجز الأمعاء وتجنيد الخلايا المناعية في ظل ظروف مرضية مثل IBD غير مفهومة بشكل كامل. هنا، ونحن بالتفصيل قوية في نموذج المورين فيفو الذي يستخدم شريحة الأمعاء الخارجية الأوعية الدموية جيدا من القولون إما الايليوم أو قريبة ويسمح لتقييم نفاذية الأمعاء، ودرا...

الغشاء المخاطي المعوي يشمل طبقة واحدة من الخلايا الظهارية المعوية العمودية (IECs)، والخلايا المناعية الكامنة وراء لامينا البربريا والغشاء المخاطي العضلي. إلى جانب دورها في امتصاص المواد الغذائية ، فإن الظهارة المعوية هي حاجز مادي يحمي الجسم الداخلي من البكتيريا commensal الإنارة ، مسببات الأمراض ، والمضادات الغذائية. بالإضافة إلى ذلك، تنسق الخلايا المناعية IECs وlamina propria الاستجابة المناعية التي تحفز إما التسامح أو الاستجابة اعتمادا على السياق والمحفزات. وقد أفيد أن اضطراب الحاجز الظهاري يمكن أن يسبق ظهور التهاب المخاطية المرضية والمساهمة في مرض التهاب الأمعاء (IBD) التي تشمل كل من التهاب القولون التقرحي ومرض كرون1،2،3،4،5،6،7. الأفراد الذين يعانون من التهاب القولون التقرحي تقديم الهجرة عبر الظهارية المفرطة (TEpM) من العدلات متعددة الأشكال (PMN) تشكيل خراجات سرداب, النتيجة التي ارتبطت مع شدة المرض8,9. على الرغم من أن وظيفة الحاجز الظهاري للخطر والاستجابات المناعية المفرطة هي السمات المميزة ل IBD ، إلا أن هناك نقصا في المقايسات التجريبية في الجسم الحي لإجراء تقييمات كمية نفاذية الأمعاء وتجنيد الخلايا المناعية في الغشاء المخاطي المعوي.
الأساليب الأكثر شيوعا المستخدمة لدراسة نفاذية الظهارية المعوية وPMN TEpM توظيف نهج سابقة فيفو غرفة القائمة باستخدام monolayers IEC المستزرعة على غشاء مسامية شبه نفاذية إدراج10،11،12. يتم رصد سلامة الحاجز الظهاري إما عن طريق قياسات المقاومة الكهربائية عبر الإبط (TEER) أو التدفق شبه الخلوي للنظائر الفلوريسين (FITC) المسمى dextran من المقصورة القاعدية13،14،15. وبالمثل، عادة ما تدرس PMN TEpM ردا على chemoattractant التي تضاف في الغرفة السفلى16. يتم وضع PMN في الغرفة العليا وبعد فترة حضانة ، يتم جمع PMN التي هاجرت إلى المقصورة القاعدية وقياسها كميا. في حين أن هذه الأساليب مفيدة وسهلة الأداء وقابلة للاستنساخ للغاية ، فمن الواضح أنها نهج اختزالية ولا تمثل بالضرورة انعكاسا دقيقا للظروف في الجسم الحي.
في الفئران ، والمقايسة الشائعة لدراسة نفاذية الأمعاء paracellular هو عن طريق الفم من gavage FITC - dextran والقياس اللاحقة من FITC - dextran المظهر في مصل الدم13،17. وعيب هذا المقايسة هو أنه يمثل تقييما لسلامة الحاجز العام للجهاز الهضمي بدلا من تقييم المساهمات المعوية الإقليمية. وبالإضافة إلى ذلك، يستخدم ايفانز الأزرق عادة لتقييم تسرب الأوعية الدموية في الجسم الحي18، كما تم استخدامها لتقييم نفاذية المخاطية المعوية في الماوس والفأر19،20،21. يتطلب القياس الكمي لإيفانز الأزرق في الغشاء المخاطي المعوي الاستخراج من الأنسجة التي تستخدم الحضانة في فورماميد بين عشية وضحاها. لذلك ، لا يمكن استخدام نفس النسيج لدراسة نفاذية الظهارية المعوية وتسلل العدلات.
هنا نسلط الضوء على بروتوكول بسيط يقلل من عدد الحيوانات اللازمة لجمع البيانات القابلة للاستنساخ حول نفاذية القولون المخاطية والهجرة عبر الإبطية الكريات البيض في الجسم الحي. لذلك، نوصي باستخدام FITC-dextrans التي يمكن اكتشافها بسهولة في مصل الدم دون المساس بسلامة الحلقات المعوية التي يمكن حصادها لمزيد من التحليل. وتجدر الإشارة إلى أن الحلقات المعوية ذات الخلايا المتوارثة قد استخدمت في أنواع مختلفة (بما في ذلك الماوس والفأر والأرنب والعجل) لدراسة العدوى البكتيرية (مثل السالمونيلا والليستيريا أحادية الخلايا والإشريكية القولونية)22و23و24و25 بالإضافة إلى نفاذية الأمعاء26؛ ومع ذلك، على حد علمنا لا توجد دراسات التحقيق آليات PMN TEpM في مناطق محددة في الأمعاء مثل الإيليوم أو القولون التي تشارك عادة في IBD.
هنا نحن نصف الماوس حلقة معوية (iLoop) نموذج الذي هو microsurgical قوية وموثوق بها في طريقة فيفو الذي يستخدم شريحة الأمعاء جيدا الأوعية الدموية والخارجية من القولون إما الايليوم أو قريبة. نموذج iLoop ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ويسمح بتقييم سلامة حاجز الأمعاء وPMN TEpM على الفئران الحية تحت التخدير. نحن نثبت تطبيقين: 1) القياس الكمي لمستويات المصل من 4 kDa FITC-dextran بعد الإدارة داخل الألومين في iLoop 2) القياس الكمي لPMN المتحولة في تجويف iLoop بعد الحقن داخل الألومين من اللوكوترين القوي الكيميائي B4 (LTB4)27. وعلاوة على ذلك، الاستفادة من نموذج iLoop مع الفئران جام-أ-فارغةأو الفئران التي تؤوي خسارة انتقائية من JAM-A على IECs(Villin-cre; جام-أ fl/fl)بالمقارنةمع الفئران السيطرة، ونحن قادرون على تأكيد الدراسات السابقة التي أبلغت عن مساهمة كبيرة لضيق تقاطع المرتبطة البروتين JAM-A إلى نفاذية الأمعاء وهجر العدلات15،28،29،30،31.
نموذج iLoop هو أسلوب وظيفي وفسيولوجي للغاية يمكن استخدامه لتأكيد المقايسات في المختبر. وعلاوة على ذلك، هذا هو نموذج تجريبي متعدد الاستخدامات التي تسمح لدراسة الكواشف المختلفة التي يمكن حقنها في التجويف حلقة، بما في ذلك chemokines، السيتوكينات، مسببات الأمراض البكتيرية، والسموم، والأجسام المضادة والعلاجات.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment and Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Alcohol Swabs</td>
			<td>BD</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8&#34;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2&#34;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>07-200-592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Non-treated Culture Dish, 10cm</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6&#34;, sterile</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>25806 2WC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2&#34; x 2&#34;</td>
			<td>Medex</td>
			<td>3249-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units)</td>
			<td>E-Z Systems</td>
			<td>EZ-7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tube 50ml&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Colored Labeling Tape</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey Needle Holder (needle holder)&#160;</td>
			<td>FST</td>
			<td>12001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes, small (tissue wipe)</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7ml Microcentrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Thomas Scientific&#160;</td>
			<td>c2170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube)</td>
			<td>Sarstedt&#160;</td>
			<td>41.1501.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14370-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 &#181;m nylon mesh)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>12920060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps (blunt tissue forceps)</td>
			<td>FST</td>
			<td>11103-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>NC9452680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken Forceps (anatomical forceps)</td>
			<td>FST</td>
			<td>1108-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18&#34;, Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting&#160;</td>
			<td>HenrySchein</td>
			<td>SS694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Fine Forceps, Angled</td>
			<td>FST</td>
			<td>91110-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ml Syringe PP/PE without needle</td>
			<td>Millipore Sigma&#160;</td>
			<td>Z248029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm</td>
			<td>Instech</td>
			<td>FTP-20-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions and Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accugene 0.5M EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer</td>
			<td>BioWhittaker</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-023-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>127610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-0112-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotreitol</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, heat inactivated</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>511550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60842-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Halocarbon</td>
			<td>12164-002-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukotriene B4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71160-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>557235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IFN-&#947;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine TNF-&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional assessment of intestinal permeability and neutrophil transepithelial migration in mice using a standardized intestinal loop model

واصطف الغشاء المخاطي المعوي من قبل طبقة واحدة من الخلايا الظهارية التي تشكل حاجزا ديناميكيا يسمح النقل شبه الخلوي من المواد الغذائية والماء مع منع مرور البكتيريا المضيء والمواد الخارجية. يؤدي خرق هذه الطبقة إلى زيادة نفاذية المحتويات الإنارة وتجنيد الخلايا المناعية ، وكلاهما من السمات المميزة للدول المرضية في الأمعاء بما في ذلك مرض الأمعاء الالتهابي (IBD). 
الآليات التي تنظم وظيفة الحاجز الظهاري والهجرة عبر الإبطية (TEpM) من العدلات متعددة الأشكال (PMN) غير مفهومة بشكل كامل بسبب عدم وجود طرق تجريبية في الجسم الحي تسمح بالتحليل الكمي. هنا، ونحن نصف نموذج تجريبي مورين قوية التي توظف الجزء المعوي الخارجي من القولون إما الايليوم أو قريبة. الحلقة المعوية الخارجية (iLoop) هي الأوعية الدموية بالكامل وتوفر مزايا فسيولوجية على النهج القائمة على غرفة الجسم الحي السابق المستخدمة عادة لدراسة نفاذية وهجرة PMN عبر أحاديات الخلايا الظهارية.
نحن نبين تطبيقين لهذا النموذج بالتفصيل: (1) القياس الكمي نفاذية الأمعاء من خلال الكشف عن ديكسترانس المسمى بالفلورسينس في المصل بعد الحقن داخل الألومين ، (2) التقييم الكمي لPMN المهاجرة عبر الظهارة المعوية في تجويف الأمعاء بعد إدخال المضادات الكيميائية داخل الألومين. نحن نظهر جدوى هذا النموذج وتوفير النتائج باستخدام iLoop في الفئران تفتقر إلى الظهارية ضيق تقاطع المرتبطة البروتين JAM-A بالمقارنة مع الضوابط. وقد ثبت JAM-A لتنظيم وظيفة الحاجز الظهاري، فضلا عن PMN TEpM خلال الاستجابات الالتهابية. نتائجنا باستخدام iLoop تؤكد الدراسات السابقة وتسليط الضوء على أهمية JAM-A في تنظيم نفاذية الأمعاء وPMN TEpM في الجسم الحي أثناء التوازن والمرض. 
نموذج iLoop يوفر طريقة موحدة للغاية للاستنساخ في دراسات الجسم الحي من التوازن المعوي والالتهاب، وسوف تعزز بشكل كبير فهم وظيفة حاجز الأمعاء والتهاب المخاطية في أمراض مثل IBD.

يصور تمثيل تخطيطي لنماذج الحلقة الايلية وpcLoop في الشكل 1 والشكل 2، على التوالي. تعرض الصور التشريحية الخطوات الحرجة للإجراء بما في ذلك المظهر الخارجي للجزء المعوي(الشكل 1B والشكل 2B)، وتحديد موقع مناسب للربط الذي يسمح...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model at JoVE.com

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

Dysregulated وظيفة الحاجز الظهاري المعوي والاستجابات المناعية هي السمات المميزة لمرض التهاب الأمعاء التي لا تزال سيئة التحقيق بسبب عدم وجود نماذج فسيولوجية. هنا، ونحن نصف نموذج حلقة الماوس المعوية التي توظف قطاع الأمعاء الأوعية الدموية جيدا والخارجي لدراسة نفاذية المخاطية والتوظيف الكريات البيض في الجسم الحي.

التقييم الوظيفي نفاذية الأمعاء والهجرة العدلية عبر الإبط في الفئران باستخدام نموذج حلقة معوية موحدة

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...

النموذج المعوي هو وسيلة قابلة للتكيف على نطاق واسع وعلم وظائف الأعضاء لقياس مدى تسرب الأمعاء وكيف تهاجر الكريات البيض في الأمعاء في الفئران ، في الجسم الحي. تساعد هذه الطريقة على فهم أفضل للآليات الكامنة وراء زيادة نفاذية الأمعاء والتهاب الأمعاء المرضي. يمكن استخدام هذه التقنية للمساعدة في آليات فهمنا الكامنة وراء وظيفة حاجز الأمعاء ، والالتهاب المرضي ، كما رأينا في التهاب القولون التقرحي ومرض كرون.يستخدم هذا النموذج شريحة الأمعاء الخارجية الوعائية بشكل جيد ، إما من الايليوم أو القولون القريب ، لفحص وظيفة حاجز الأمعاء أو تجنيد الخلايا المناعية في الماوس. مع هذا التطبيق الواسع ، يمكن لنموذج الحلقة المعوية توفير نظرة ثاقبة في الأمراض الناتجة إما عن حاجز الأمعاء المتسرب وكذلك الاستجابة الالتهابية. يمكن التغلب على الصراعات من خلال ممارسة الخطوات الجراحية.من المهم للغاية أن تضفي مظهرا خارجيا على جزء معوي كامل الأوعية الدموية وأن تختار المواقع المناسبة للربط لتجنب النزيف. نموذج حلقة الأمعاء هو تقنية جراحية دقيقة ، وبالتالي ، كما هو الحال مع العمليات الجراحية الأخرى ، فإنه يستفيد بشكل كبير من العرض البصري وعرض خطوة بخطوة للطريقة. بعد تحقيق مستوى جراحي من التخدير ، ابدأ بتنظيف فرو خط منتصف البطن بمسحات كحولية أو إسفنجة شاش غارقة في الإيثانول بنسبة 70٪.لا تبلل مساحة واسعة من الفراء مع الكحول لمنع انخفاض حرارة الجسم. باستخدام مقص، إجراء استئصال البطن خط الوسط. إجراء شق أفقي في منتصف البطن، وفضح الصفاق، مع الحرص على عدم إصابة الأعضاء داخل البطن.ضع شاش القطن الرطب قبل القطع فوق تجويف البطن المكشوف. استخدام مسحات القطن الرطب لتعبئة وخارج الكوم ووضعه بعناية على شاش القطن الرطب. ثم، تعبئة وخارجي بلطف الايليوم.نشر ما لا يقل عن ستة سنتيمترات من الايليوم المحطة على شاش القطن الرطب دون تعطيل الأوعية المتوسطة وإمدادات الدم. الحفاظ على الأنسجة المكشوفة رطبة في جميع الأوقات مع HBSS الدافئة. تحديد الشريان الرئيسي توريد الايليوم في mesentery، على مقربة من cecum.ثم حدد موقعين ربط في mesentery خالية من الأوعية الدموية الحرجة. الاستيلاء بحزم على الايليوم المحطة الطرفية مع ملقط الأنسجة الحادة واستخدام ملقط تلميح غرامة لfenestrate mesentery، وتجنب الأوعية الدموية. ضع خياطة الحرير عبر الثقب ، وربط عقدة جراحية لإنشاء الربط الأول.استخدم المسطرة لقياس أربعة سنتيمترات بعيدا عن الرباط الأول، وإنشاء الرباط الثاني. قطع بعناية بجانب كل ربط مع مقص غرامة لعزل حلقة إيلال أربعة سنتيمترات، والحفاظ على إمدادات الدم والغشاء المساريقي سليمة. قم بتدفق محتوى الجزء الحلقي بلطف باستخدام HBSS الدافئ باستخدام أنبوب تغذية أصفر مرن متصل بحقنة 10 ملليلتر.تأكد من إخراج المحتويات الإنارة من تجويف البطن للحفاظ على نظافة الموقع الجراحي. Ligate طرفي قطع حلقة إيلال مسح مع خياطة الحرير. استخدم حقنة ملليلتر واحدة مع إبرة قياس 30 لحقن 250 ميكرولتر ببطء من الكاشف ، مثل FITC-dextrans أو chemokine ، في التجويف المعوي.سوف تضخم حلقة إيلال، مما تسبب في انتفاخ معتدل من الغشاء المخاطي. أغلق جدار البطن باستخدام حامل إبرة، ملقط تشريحي، و3.0 خياطة حرير غير قابلة للامتصاص بإبرة قطع عكسية. بعد تجفيف الحيوان لمنع انخفاض حرارة الجسم ، ضعه في غرفة تخدير منظمة لدرجة الحرارة لفترة الحضانة.إعداد الماوس لعملية جراحية وخارج cecum كما هو موضح سابقا. باستخدام مسحات القطن الرطب، وخارج الايليوم بأكمله ووضعه على رأس شاش القطن الرطب. تحديد القولون القريبة وإمدادات الدم الموجودة في mesocolon.تعبئة القولون القريبة وخلق الرباط الأول في منطقة خالية من السفن في mesocolon في حوالي 0.5 سنتيمتر من الجانح. قياس سنتيمترين من الرباط الأول وإنشاء رباط الثاني في منطقة خالية من إمدادات الدم في الميوكولون. باستخدام مقص غرامة، وقطع بعناية بجانب كل ربط لعزل pcLoop سنتيمترين طويلة.تدفق بلطف pcLoop مع HBSS الحارة لإزالة البراز باستخدام أنبوب تغذية صفراء مرنة تعلق على حقنة 10 ملليلتر. تأكد من إخراج المحتويات الإنارة من تجويف البطن للحفاظ على نظافة الموقع الجراحي. ثم، ligate طرفي قطع من pcLoop مسح باستخدام خياطة الحرير.استخدم حقنة ملليلتر واحدة مع إبرة قياس 30 لحقن 200 ميكرولتر من الكاشف ببطء، مثل FITC-dextran أو chemokine، في التجويف المعوي. فإن pcLoop تضخيم ، مما تسبب في انتفاخ معتدل من الغشاء المخاطي. استخدام مسحات القطن الرطب لوضع بلطف مرة أخرى pcLoop liga، الييوم، وceum.أغلق جدار البطن باستخدام حامل إبرة، ملقط تشريحي، و3.0 خياطة حرير غير قابلة للامتصاص بإبرة قطع عكسية. بعد فترة الحضانة، قتل الفأر المخدر وجمع الأنسجة للتحليل. من أجل التحقق من دقة نموذج حلقة I لتقييم نفاذية الأمعاء ، تم إجراء فحص PCLoop FITC-dextran لتقييم دور البروتين المرتبط بتقاطع ضيق Jam-a في تنظيم وظيفة الحاجز المعوي في الجسم الحي.مع نموذج pcLoop ، تم قياس زيادة 2.5 أضعاف في مستويات مصل FITC-dextran في الفئران الخالية جام -a مقارنة بالضوابط. تم الحصول على نتائج مماثلة مع الفئران التي تؤوي فقدان انتقائي للجام-أ على الخلايا الظهارية المعوية. تم استخدام نموذج pcLoop لدراسة العدلات متعددة الأشكال ، أو PMN ، والتجنيد في الغشاء المخاطي المعوي والهجرة عبر الظهارية اللاحقة في الجسم الحي.تم قياس عدد PMN في المحتوى الإنارة من pcLoop كميا عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي. كان عدد PMN الموجود في الجزء من القولون القريب منخفضا في ظل الظروف الفسيولوجية. أدى العلاج المسبق مع السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، TNF ألفا وIFN غاما ، قبل الجراحة ، إلى زيادة أعداد PMN المعينين في تجويف pcLoop.إدارة PMN الكيميائية الجذاب LTB4 أدى إلى زيادة كبيرة في عدد PMN. تلطيخ المناعي الكيميائية من PMN في الغشاء المخاطي القولوني تؤكد تجنيد مرتفعة من PMN بعد التحفيز مع السيتوكينات وLTB4. تمت دراسة مساهمة Jam-a في الهجرة عبر الظهارية PMN باستخدام نموذج pcLoop على الفئران التي تؤوي فقدانا انتقائيا للجام-أ على الخلايا الظهارية المعوية.أدى فقدان جام الظهارية إلى انخفاض عدد PMN المتحولة في التجويف القولوني مقارنة بعناصر التحكم في القمامة. الجانب الحاسم لهذه التقنية هو أن نتذكر للحفاظ على إمدادات الدم إلى الجزء المعوي الخارجي عند إجراء الجراحة. بعد هذا البروتوكول، يمكن إجراء طرق أخرى مثل فحص نفاذية الأمعاء ويقايس الهجرة عبر الإبط العدلية للتحقيق في فقدان سلامة الحاجز والتهاب الأمعاء في الجسم الحي.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Ligated تطبيق ماوس الفحص باير لتصحيح حلقة لتقييم امتصاص الأمعاء البكتيرية بواسطة خلايا M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

الغزو الجرثومي المعوي الخلايا الظهارية المعوية<em&gt; في المختبر</em&gt; تتعزز بشكل كبير عن طريق دائرة إنتشار عمودي الموديل

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

في المختبر المقايسة المشتركة لتقييم الهجرة العدلية المستحثة المسببة للأمراض عبر الظهارية

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

التقييم الكمي للهجرة العدلات الإنسان وعبر مثقف المثانة الظهارة

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

التصوير في الوقت الحقيقي من خلايا الدم النخاعي في ديناميات<em&gt; APC<sup&gt; مين / +</sup</em&gt; الأورام المعوية التي كتبها غزل القرص متحد البؤر المجهر

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

المساريقي الليمفاوية القناة مقنى نموذج الفأر: بالتطبيق على تقييم المعوية اللمفاوي النقل المخدرات

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

تحريض الفئران المعوية التهاب عن طريق نقل بالتبني من المستجيب CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; عالية</sup&gt; خلايا T في الفئران العوز المناعي

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

تحليل المناعي من الإجهاد الحبيبية تشكيل بعد تحدي البكتيريا من خلايا الثدييات

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

التعريفي للابتزاز الأمعاء – مقابل – المضيف المرض وتقييمها بالمنظار ميني في الفئران حية

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

مونولاييرس كولونويد البشرية لدراسة التفاعلات بين العوامل الممرضة، كومينسالس، وظهاره الأمعاء المضيف

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...