Name: functional assessment of intestinal permeability and neutrophil transepithelial migration in mice using a standardized intestinal loop model
Uploaded: 2021-02-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model at JoVE.com

作者感谢维尔茨堡大学的斯文·弗莱明博士为建立近亲结肠循环模型做出了贡献，肖恩·沃森对老鼠群落的管理做出了贡献，奇特拉·穆拉利达兰帮助获取了iLoop模型的照片。这项工作得到了德国研究基金会/DFG（BO 5776/2-1）的支持，包括KB、R01DK079392、R01DK072564和R01DK061379到C.A.P.

所有动物实验都是根据国家卫生研究院的指导方针和政策进行的，并经密歇根大学动物护理与使用机构委员会批准。
1. 术前准备
注：这种方法是利用C57BL/6遗传背景的成年小鼠产生的，年龄在8-12周。所有小鼠都处于严格的特定无病原体条件下，并可获得正常的周和水。结果使用C57BL/6，果酱-空小鼠（Jam-a-/-）或在IEC（维林-克里）上有?...

对IBD等病理条件下肠道屏障功能调节不良和免疫细胞招募的机制不完全了解。在这里，我们详细介绍了一个强大的体内粘液模型，它采用了肠道或近端结肠的血管化外化肠道部分，并允许评估肠道渗透性、中性粒细胞迁移研究以及其他应用。
iLoop 是在活体动物身上进行的非恢复性手术。麻醉必须在实验过程中持续监测，并强制评估饱和深度。最关键的步骤包括 （1） iLoop 的?...

肠道粘膜包括单层柱状肠道上皮细胞（IECs）、底层拉米纳丙膜免疫细胞和肌肉粘膜。除了它在营养物质吸收中的作用外，肠道上皮是保护身体内部免受发光共生细菌、病原体和膳食抗原侵害的物理屏障。此外，IEC 和拉米纳丙膜免疫细胞协调免疫反应，根据上下文和刺激诱导耐受性或反应。据报道，上皮屏障的破坏可以先于病理粘膜炎症的发生，并导致炎症性肠病（IBD），包括溃疡性结肠炎和克罗恩病1，2，3，4，5，6，7。溃疡性结肠炎患者出现多态核嗜中性粒细胞（PMN）的过度转导（TEPM），形成隐秘脓肿，这一发现与疾病8、9的严重程度有关。虽然上皮屏障功能受损和免疫反应过度是IBD的标志，但缺乏对肠道渗透性和免疫细胞招募进行肠道粘膜的定量评估的体内检测实验。
最常见的方法用于研究肠道上皮渗透性和PMN TEPM采用前体内室为基础的方法，使用IEC单层培养的半渗透多孔膜插入10，11，12。上皮屏障的完整性通过测量转位电阻 （TEER） 或荧光素异氰酸素 （FITC） 标记的脱氧叶素的准细胞通量从尖顶到基底隔间13、14、15进行监测。同样，PMN TEPM 通常针对下腔16中添加的化疗吸引剂进行研究。PMN 被放置在上室，在潜伏期后，已迁移到基底舱的 PMN 被收集和量化。虽然这些方法是有用的，易于执行和非常可重复的，它们显然是减少的方法，并不一定代表在体内条件的准确反映。
在小鼠中，研究肠道准细胞渗透性的常见检测方法是通过对FITC-dextran的口服测定和随后对血清13、17中FITC-德克斯特兰外观的测量。这种检测的缺点是，它代表了对胃肠道整体屏障完整性的评估，而不是对区域肠道贡献的评估。此外，Evans Blue 常用于评估18号体内的血管渗漏，还用于评估小鼠和19、20、21的肠道粘膜渗透性。肠道粘膜中埃文斯蓝的量化需要从一夜之间在形态酰胺中孵化的组织中提取。因此，同一组织不能用于研究肠道上皮渗透和嗜中性粒细胞渗透。
在这里，我们强调一个简单的协议，减少动物的数量，需要收集可重复的数据，结肠粘膜渗透性和白细胞在体内的转世迁移。因此，我们建议使用在血清中易于检测到的FITC-dextrans，而不损害肠道循环的完整性，这些肠环可以收获作进一步分析。值得注意的是，肠道利口环已用于各种物种（包括老鼠，大鼠，兔子，小牛）研究细菌感染（如沙门氏菌，李斯特菌单细胞基因和大肠杆菌）22，23，24，25以及肠道渗透性26：然而，据我们所知，没有研究调查PMN TEPM在肠道的特定区域的机制，如伊利姆或结肠，通常涉及IBD。
在这里，我们描述了小鼠肠道循环（iLoop）模型，这是一个强大和可靠的显微外科活体方法，采用了良好的血管化和外化肠道部分的肠或近结肠。iLoop 模型在生理上相关，允许评估麻醉下活鼠的肠道屏障完整性和 PMN TEPM。我们演示了两个应用：1） 在 iLoop 2 的血清水平 4 kDa FITC-dextran 后，在 iLoop 2） 中对 iLoop 流明中转移的 PMN 进行量化，在注射强力化学微量微量剂 Leukotriene B4 （LTB4）27后进行。此外，利用iLoop模型与Jam-a-空小鼠或老鼠怀有选择性损失的JAM-A在IEC（维林克里：与对照小鼠相比，我们能够证实先前的研究，这些研究报告对紧结相关蛋白质JAM-A对肠道渗透性和嗜中性粒细胞转运有重大贡献，15、28、29、30、31。
iLoop 模型是一种功能和生理上非常全的方法，可用于证实体外测定。此外，这是一个多功能的实验模型，允许研究各种试剂，可以注射到循环流明，包括化疗因子，细胞因子，细菌病原体，毒素，抗体和治疗。

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment and Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Alcohol Swabs</td>
			<td>BD</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8&#34;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2&#34;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>07-200-592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Non-treated Culture Dish, 10cm</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6&#34;, sterile</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>25806 2WC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2&#34; x 2&#34;</td>
			<td>Medex</td>
			<td>3249-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units)</td>
			<td>E-Z Systems</td>
			<td>EZ-7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tube 50ml&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Colored Labeling Tape</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey Needle Holder (needle holder)&#160;</td>
			<td>FST</td>
			<td>12001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes, small (tissue wipe)</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7ml Microcentrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Thomas Scientific&#160;</td>
			<td>c2170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube)</td>
			<td>Sarstedt&#160;</td>
			<td>41.1501.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14370-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 &#181;m nylon mesh)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>12920060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps (blunt tissue forceps)</td>
			<td>FST</td>
			<td>11103-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>NC9452680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken Forceps (anatomical forceps)</td>
			<td>FST</td>
			<td>1108-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18&#34;, Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting&#160;</td>
			<td>HenrySchein</td>
			<td>SS694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Fine Forceps, Angled</td>
			<td>FST</td>
			<td>91110-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ml Syringe PP/PE without needle</td>
			<td>Millipore Sigma&#160;</td>
			<td>Z248029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm</td>
			<td>Instech</td>
			<td>FTP-20-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions and Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accugene 0.5M EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer</td>
			<td>BioWhittaker</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-023-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>127610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-0112-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotreitol</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, heat inactivated</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>511550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60842-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Halocarbon</td>
			<td>12164-002-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukotriene B4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71160-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>557235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IFN-&#947;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine TNF-&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional assessment of intestinal permeability and neutrophil transepithelial migration in mice using a standardized intestinal loop model

肠道粘膜由一层上皮细胞排列，形成动态屏障，允许球细胞传输营养物质和水，同时防止发光细菌和外源物质的通过。这一层的破坏导致对发光成分的渗透性和免疫细胞的招募增加，这两者都是肠道病理状态的标志，包括炎症性肠病（IBD）。 
由于缺乏允许定量分析的实验性体内方法，对多态核嗜中性粒细胞（PMN）上皮屏障功能和转位迁移（TEpM）的机制不完全了解。在这里，我们描述了一个强大的木质实验模型，它采用了外化肠道部分的肠或近结肠。外化肠道环 （iLoop） 完全血管化，与通常用于研究上皮细胞单层的渗透性和 PMN 迁移的前体内室方法相比，具有生理优势。
我们详细演示了该模型的两种应用：（1） 通过检测血清中的荧光标记的脱氧转体在血清中检测肠道渗透性（2） 在肠道上皮中引入化疗法后对迁移的 PMN 进行定量评估。我们证明了这个模型的可行性，并提供了利用iLoop在小鼠缺乏上皮紧密结相关蛋白质JAM-A相比对照的结果。JAM-A 已被证明在炎症反应期间调节上皮屏障功能以及 PMN TEPM。我们使用 iLoop 的结果证实了以前的研究，并强调了 JAM-A 在调节肠道渗透性和 PMN TEPM 在体温平衡和疾病期间在体内的重要性。 
iLoop模型为肠道平衡和炎症的活体研究提供了高度标准化的方法，将显著提高对IBD等疾病中肠道屏障功能和粘膜炎症的认识。

图1和图2分别描绘了ileal循环和pcLoop模型的示意图。 解剖图片显示了手术的关键步骤，包括肠道部分（图1B和图2B）的外部化，确定一个适当的位置，使血液供应的最小干扰（图1C和图2C）和清洁后，可以充满试剂溶液的iLoop切?...

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Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

受管制的肠道上皮屏障功能和免疫反应是炎症性肠病的标志，由于缺乏生理模型，这些特征仍然调查不力。在这里，我们描述了一个鼠标肠道循环模型，它采用了血管化和外化良好的肠道部分，以研究粘膜渗透性和白细胞在体内的招募。

使用标准化肠道循环模型对小鼠肠道渗透性和中性粒细胞转导的功能评估

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...

肠道模型是一种适应性强、生理上的方法，可以测量肠道的泄漏程度以及白细胞在小鼠肠道中迁移的活体。这种方法有助于更好地了解肠道渗透性和病理性肠道炎症增加的机制。该技术可用于帮助我们理解肠道屏障功能和病理炎症背后的机制，如溃疡性结肠炎和克罗恩病。该模型采用血管化、外化的肠道部分，无论是肠或近结肠，用于检查肠道屏障功能或小鼠免疫细胞的招募。有了这个广泛的应用，肠道循环模型可以提供洞察疾病造成的肠道屏障泄漏以及炎症反应。通过练习手术步骤可以克服斗争。至关重要的是，要使完全血管化的肠道部分外化，并为结节选择合适的位置以避免出血。肠道循环模型是一种显微外科技术，因此，与其他外科手术一样，它从视觉演示和方法的分步演示中获益匪浅。在完成麻醉手术后，首先用酒精拭子或用70%乙醇浸泡的纱布海绵擦洗腹部中线的毛皮。不要用酒精弄湿大面积的毛皮，以防止体温过低。用剪刀，进行中线腹腔切除术。在腹部中间做一个水平切口，并暴露腹膜，注意不要伤害腹内器官。将预切湿棉纱布放在暴露的腹腔上。使用湿棉签来动员和外化塞库姆，并小心地将其放在湿棉纱布上。然后，动员并轻轻地将伊利姆外部化。在湿棉纱布上部署至少六厘米的末端伊利姆，而不会中断血管和血液供应。使用温暖的 HBSS 随时保持暴露的组织湿润。识别在靠近塞库姆的中肠供应伊利姆的主要动脉。然后，在没有关键血管的内河中找到两个连体位点。用钝组织钳牢牢抓住末期的伊利姆，并用细尖钳子来挡住肠胃，避免血管。将丝绸缝合线穿过穿孔，并系上手术结，以创建第一个结扎。使用尺子测量距离第一个连字四厘米的地方，并创建第二个连字。用细剪刀小心地切开每个粘合处旁边，以隔离四厘米的环状环，保持血液供应和中间膜完好无损。使用连接到 10 毫升注射器的柔性黄色喂食管，使用温暖的 HBSS 轻轻冲洗卵石环段的内容。确保将发光物冲出腹腔，保持手术部位清洁。用丝绸缝合线将冲洗的伊利尔环的两端唇裂开。使用一毫升注射器和一根30口径针头，慢慢将250微升试剂（如FITC-dextrans或切莫金）注射到肠道流明中。虚化环会膨胀，导致粘膜的适度分散。使用针架、解剖钳和 3.0 个不可吸收的丝绸缝合线用反向切割针关闭腹壁。干燥动物以防止体温过低后，将其放入温度调节麻醉室进行孵化。准备小鼠手术，并像以前演示的那样将腹腔外部化。使用湿棉签，将整个伊莱姆外部化，并将其放在湿棉纱布上。识别位于中子的近结肠和血液供应。调动近体结肠，在中子克隆中没有船只的区域创建第一个连结体，距离舱位约0.5厘米。测量从第一个连体两厘米，并创建第二个连结在一个区域没有血液供应的中等体。使用细剪刀，小心地切割每个连体旁边，以隔离一个两厘米长的 pcLoop。用温暖的 HBSS 轻轻冲洗 pcLoop，使用连接到 10 毫升注射器的柔性黄色喂食管去除粪便。确保将发光物冲出腹腔，保持手术部位清洁。然后，使用丝绸缝合线将冲洗的 pcLoop 的两端连结。使用一毫升注射器和30米针，慢慢将200微升试剂，如FITC-德克斯特兰或切莫金，注射到肠道流明中。pcLoop 会膨胀， 导致粘膜的适度分散。使用湿棉签轻轻地将唇膏、伊利姆和塞库姆放回。使用针架、解剖钳和 3.0 个不可吸收的丝绸缝合线用反向切割针关闭腹壁。潜伏期后，对麻醉小鼠实施安乐死，并收集组织进行分析。为了验证I环模型评估肠道渗透性的准确性，进行了FITC-dextran pcLoop检测，以评估紧结相关蛋白质Jam-a在体内肠道屏障功能调节中的作用。与 pcLoop 模型相比，在 Jam -a 空鼠中，FITC-dextran 血清水平增加了 2.5 倍。在肠道上皮细胞上有选择性地失去Jam-a的小鼠也取得了类似的结果。pcLoop 模型用于研究多态核中性粒细胞嗜中性粒细胞（PMN），招募到肠道粘膜和随后的体内转世迁移。pcLoop 的发光内容中的 PMN 数通过流细胞学分析进行量化。在生理条件下，近结肠部分的PMN数量很少。手术前用亲炎细胞因子、TNFα和IFN伽马进行预处理，结果在pcLoop流明中招募了更多的PMN。PMN 化疗吸引剂 LTB4 的管理导致 PMN 计数急剧增加。结肠粘膜中PMN的免疫化学染色证实了在对细胞因子和LTB4的刺激后，PMN的招募率上升。使用 pcLoop 模型研究 Jam-a 对 PMN 转皮迁移的贡献，该模型对肠道上皮细胞上有选择性损失的 Jam-a 小鼠进行了研究。上皮果酱的丧失导致结肠流明中移民的 PMN 数量与垃圾控制相比减少。这项技术的一个关键方面是记住在手术时保持对外化肠道段的血液供应。根据本协议，可以执行其他方法，如肠道渗透性检测和中性粒细胞转世迁移检测，以调查体内屏障完整性和肠道炎症的丧失。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

鼠标应用结扎Peyer氏修补肠袢含量评价M细胞的细菌吸收

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

科研

免疫与感染

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

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肠道细菌侵入肠上皮细胞<em&gt;体外</em&gt;使用垂直扩散室模型，显着增强

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

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Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

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