Name: functional assessment of intestinal permeability and neutrophil transepithelial migration in mice using a standardized intestinal loop model
Uploaded: 2021-02-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model at JoVE.com

Forfatterne takker Dr. Sven Flemming fra Universitetet i Wuerzburg for hans bidrag til etableringen af den proksimale kolon loop model, Sean Watson for forvaltningen af musen kolonier og Chithra K. Muraleedharan for at hjælpe med erhvervelsen af billeder af iLoop model. Dette arbejde blev støttet af den tyske Forskningsfond/DFG (BO 5776/2-1) til KB, R01DK079392, R01DK072564 og R01DK061379 til C.A.P.

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne og politikkerne fra National Institutes of Health og godkendt af Institutional Animal Care &use Committee ved University of Michigan.
1. Præoperativ forberedelse
BEMÆRK: Denne metode blev genereret beskæftiger voksne mus fra C57BL / 6 genetisk baggrund, i alderen 8 - 12 uger. Alle mus blev holdt under strenge specifikke patogenfrie forhold med ad libitum adgang til normal chow og vand. Resultater...

De mekanismer, der er ansvarlige for dysregulering af tarmbarrierefunktion og immuncellerekruttering under patologiske tilstande som IBD, forstås ufuldstændigt. Her beskriver vi en robust in vivo murine-model, der anvender et godt vaskulært eksteriøriseret tarmsegment af enten ileum eller proksimal tyktarm og giver mulighed for vurdering af tarmgennemtrængelighed, neutrofile migrationsundersøgelser såvel som andre applikationer.
ILoop er en ikke-genopretningsoperation, der udføres på ...

Tarmslimhinden omfatter et enkelt lag af columnar tarmepitele celler (IECs), underliggende lamina propria immunceller og muscularis slimhinden. Udover sin rolle i absorptionen af næringsstoffer er tarmepitelet en fysisk barriere, der beskytter kroppens indre mod lysmæssige commensale bakterier, patogener og diætantigener. Derudover koordinerer IIC'er og lamina propria immunceller immunresponset, der fremkalder enten tolerance eller respons afhængigt af konteksten og stimuli. Det er blevet rapporteret, at forstyrrelsen af epitelbarrieren kan gå forud for starten af patologisk slimhindebetændelse og bidrage til inflammatorisk tarmsygdom (IBD), der omfatter både colitis ulcerosa og Crohns sygdom1, 2,3,4,5,6,7. Personer med colitis ulcerosa udgør overdreven transepithelial migration (TEpM) af polymorphonuclear neutrofiler (PMN), der danner krypt abscesser, et fund, der har været forbundet med sværhedsgraden af sygdom8,9. Selv om kompromitteret epitel barriere funktion og overdreven immunrespons er kendetegnende for IBD, der er en mangel på eksperimentelle in vivo assays til at udføre kvantitative vurderinger af tarm permeabilitet og immuncelle rekruttering i tarmslimhinden.
De mest almindelige metoder til undersøgelse af tarmepitelet permeabilitet og PMN TEpM anvender ex vivo kammerbaserede metoder ved hjælp af IEC monolayers dyrket på semi-gennemtrængelige porøse membranindsatser10,11,12. Epitelbarrierens integritet overvåges enten ved målinger af transepithelial elektrisk modstand (TEER) eller fluorescein isothiocyanat (FITC) mærket dextran fra apikale til basale rum13,14,15. Tilsvarende er PMN TEpM typisk undersøgt som reaktion på en kemoattratant, der tilsættes i det nederste kammer16. PMN placeres i det øverste kammer, og efter en inkubationsperiode opsamles og kvantificeres PMN, der er migreret ind i det basale rum. Selv om disse metoder er nyttige, lette at udføre og meget reproducerbare, er de naturligvis reduktionistiske tilgange og repræsenterer ikke nødvendigvis en nøjagtig afspejling af in vivo-forholdene.
Hos mus er en almindelig analyse til undersøgelse af tarmparacellulær permeabilitet ved oral sonde af FITC-dextran og efterfølgende måling af FITC-dextran udseende i blodserummet13,17. Ulempen ved denne analyse er, at den repræsenterer en vurdering af gastrointestinale tarmkanalens overordnede barriereintegritet snarere end af regionale tarmbidrag. Derudover er Evans blå almindeligt anvendt til at evaluere vaskulær lækage in vivo18 og har også været ansat til at evaluere tarmslimhindepermeabilitet hos mus og rotte19,20,21. Kvantificeringen af Evans blå i tarmslimhinden kræver ekstraktion fra væv, der anvender inkubation i formamid natten over. Derfor kan det samme væv ikke bruges til at studere tarmepitelelengerbarhed og neutrofil infiltration.
Her fremhæver vi en simpel protokol, der reducerer antallet af dyr, der er nødvendige for at indsamle reproducerbare data om colon slimhindegennemtrængelighed og leukocyttransepithelial migration in vivo. Vi anbefaler derfor brugen af FITC-dextrans, der let kan påvises i blodserum uden at gå på kompromis med integriteten af tarmsløjfer, som kan høstes til yderligere analyse. Det skal bemærkes, at tarmlakerede sløjfer er blevet anvendt i forskellige arter (herunder mus, rotter, kaniner, kalve) til undersøgelse af bakteriel infektion (såsom Salmonella, Listeria monocytogenes og Escherichia coli)22,23,24,25 samt tarmgennemtrængelighed26; Men så vidt vi ved, er der ingen undersøgelser, der undersøger mekanismer af PMN TEpM i specifikke regioner i tarmen, såsom ileum eller tyktarm, der er almindeligt involveret i IBD.
Her beskriver vi musens tarmsløjfe (iLoop) model, der er en robust og pålidelig mikrokirurgisk in vivo-metode, der anvender et godt vaskulært og udvendigt tarmsegment af enten ileum eller proksimal tyktarm. iLoop-modellen er fysiologisk relevant og gør det muligt at vurdere tarmbarrierens integritet og PMN TEpM på levende mus under anæstesi. Vi demonstrerer to anvendelser: 1) kvantificering af serumniveauer på 4 kDa FITC-dextran efter intraluminale administration i iLoop 2) kvantificering af transmigreret PMN i iLoop lumen efter intraluminale injektion af potente chemottractant Leukotriene B4 (LTB4)27. Desuden udnytter iLoop-modellen med Jam-a-nullmus eller mus, der huser selektivt tab af JAM-A på IECs (Villin-cre; Jam-a fl/fl) sammenlignet med kontrolmus er vi i stand til at bekræfte tidligere undersøgelser, der har rapporteret et stort bidrag til stramt krydsrelateret protein JAM-A til tarmgennemtrængelighed og neutrofil transmigration15,28,29,30,31.
iLoop-modellen er en yderst funktionel og fysiologisk metode, der kan bruges til at bekræfte in vitro-assays. Desuden er dette en alsidig eksperimentel model, der gør det muligt at studere forskellige reagenser, der kan injiceres i løkken lumen, herunder kemokiner, cytokiner, bakterielle patogener, toksiner, antistoffer og terapi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment and Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Alcohol Swabs</td>
			<td>BD</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8&#34;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2&#34;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>07-200-592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Non-treated Culture Dish, 10cm</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6&#34;, sterile</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>25806 2WC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2&#34; x 2&#34;</td>
			<td>Medex</td>
			<td>3249-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units)</td>
			<td>E-Z Systems</td>
			<td>EZ-7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tube 50ml&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Colored Labeling Tape</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey Needle Holder (needle holder)&#160;</td>
			<td>FST</td>
			<td>12001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes, small (tissue wipe)</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7ml Microcentrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Thomas Scientific&#160;</td>
			<td>c2170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube)</td>
			<td>Sarstedt&#160;</td>
			<td>41.1501.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14370-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 &#181;m nylon mesh)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>12920060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps (blunt tissue forceps)</td>
			<td>FST</td>
			<td>11103-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>NC9452680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken Forceps (anatomical forceps)</td>
			<td>FST</td>
			<td>1108-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18&#34;, Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting&#160;</td>
			<td>HenrySchein</td>
			<td>SS694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Fine Forceps, Angled</td>
			<td>FST</td>
			<td>91110-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ml Syringe PP/PE without needle</td>
			<td>Millipore Sigma&#160;</td>
			<td>Z248029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm</td>
			<td>Instech</td>
			<td>FTP-20-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions and Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accugene 0.5M EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer</td>
			<td>BioWhittaker</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-023-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>127610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-0112-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotreitol</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, heat inactivated</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>511550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60842-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Halocarbon</td>
			<td>12164-002-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukotriene B4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71160-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>557235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IFN-&#947;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine TNF-&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional assessment of intestinal permeability and neutrophil transepithelial migration in mice using a standardized intestinal loop model

Tarmslimhinden er foret med et enkelt lag epitelceller, der danner en dynamisk barriere, der tillader paracellulær transport af næringsstoffer og vand, samtidig med at passage af luminale bakterier og eksogene stoffer forhindres. Et brud på dette lag resulterer i øget permeabilitet til luminalt indhold og rekruttering af immunceller, som begge er kendetegnende for patologiske tilstande i tarmen, herunder inflammatorisk tarmsygdom (IBD). 
Mekanismer, der regulerer epitelbarrierefunktion og transepithelial migration (TEpM) af polymorphonuclear neutrofiler (PMN), forstås ufuldstændigt på grund af manglen på eksperimentelle in vivo-metoder, der muliggør kvantitative analyser. Her beskriver vi en robust murine eksperimentel model, der anvender en udvendig tarmsegment af enten ileum eller proksimal tyktarm. Den eksektiserede tarmsløjfe (iLoop) er fuldt vaskulær og giver fysiologiske fordele i forhold til ex vivo kammerbaserede tilgange, der almindeligvis anvendes til at studere permeabilitet og PMN-migration på tværs af epitelcellemonomerer.
Vi demonstrerer to anvendelser af denne model i detaljer: (1) kvantitativ måling af tarmgennemtrængelighed gennem påvisning af fluorescensmærket dextrans i serum efter intraluminale injektioner, (2) kvantitativ vurdering af migreret PMN over tarmepitelet i tarmen efter intraluminale indførelse af kemoattratanter. Vi demonstrerer gennemførligheden af denne model og giver resultater ved hjælp af iLoop i mus, der mangler det epiteltheliale stramme krydsrelaterede protein JAM-A sammenlignet med kontroller. JAM-A har vist sig at regulere epitel barriere funktion samt PMN TEpM under inflammatoriske reaktioner. Vores resultater ved hjælp af iLoop bekræfter tidligere undersøgelser og fremhæver vigtigheden af JAM-A i reguleringen af tarm permeabilitet og PMN TEpM in vivo under homøostase og sygdom. 
ILoop-modellen giver en meget standardiseret metode til reproducerbare in vivo-undersøgelser af tarmhomøostase og betændelse og vil forbedre forståelsen af tarmbarrierefunktion og slimhindebetændelse i sygdomme som IBD betydeligt.

En skematisk gengivelse af ileal loop- og pcLoop-modellerne er afbildet i henholdsvis figur 1 og figur 2. De anatomiske billeder viser de kritiske trin i proceduren, herunder exterior af tarmsegmentet (Figur 1B og Figur 2B), identifikation af et passende sted for ligationer, der giver minimal forstyrrelse af blodforsyningen (Figur 1C og Fig...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model at JoVE.com

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

Dysreguleret tarmepitele barrierefunktion og immunrespons er kendetegnende for inflammatorisk tarmsygdom, der forbliver dårligt undersøgt på grund af mangel på fysiologiske modeller. Her beskriver vi en museintestinale loop-model, der anvender et godt vaskulært og eksteriøriseret tarmsegment til at studere slimhindegennemtrængelighed og leukocytrekruttering in vivo.

Funktionel vurdering af tarmgennemtrængelighed og neutrofil transepithelial migration hos mus ved hjælp af en standardiseret tarmsløjfemodel

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...

Tarmmodellen er en bredt tilpasningsbar og fysiologisk måde at måle, hvor utæt tarmen er, og hvordan leukocytter migrerer i tarmen hos mus, in vivo. Denne metode hjælper med bedre at forstå mekanismer, der ligger til grund for øget tarm gennemtrængelighed og patologisk tarmbetændelse. Teknikken kan anvendes til at hjælpe i vores forståelse mekanismer underliggende tarm barriere funktion, og patologisk inflammation, som det ses i colitis ulcerosa og Crohns sygdom.Denne model beskæftiger et godt vaskulært, eksteriøret tarmsegment, enten af ileum eller proksimal tyktarm, til undersøgelse af tarmbarrierefunktionen eller immuncellerekruttering hos mus. Med denne brede applikation kan tarmsløjfemodellen give indsigt i sygdomme, der skyldes enten en utæt tarmbarriere såvel som den inflammatoriske reaktion. Kampe kan overvindes ved at praktisere de kirurgiske trin.Det er af afgørende betydning at eksteriøre et fuldt vaskulært tarmsegment og vælge passende steder, hvor ligationerne kan undgå blødning. Tarmsløjfemodellen er en mikrokirurgisk teknik, således som med andre kirurgiske procedurer drager den stor fordel af visuel demonstration og en trinvis præsentation af metoden. Efter at have opnået et kirurgisk plan af anæstesi, skal du begynde med at skrubbe pelsen på abdominal midterlinjen med alkoholpinde eller en gasbind svamp gennemblødt med 70% ethanol.Våd ikke et stort område af pels med alkohol for at forhindre hypotermi. Brug saks, udføre en midline laparotomi. Lav et vandret snit i midten af maven, og udsæt bughinden, og pas på ikke at skade intra-abdominale organer.Placer precut våd bomuld gaze over den udsatte intra-bug hulrum. Brug våde vatpinde til at mobilisere og eksteriør cecum og omhyggeligt placere den på våd bomuld gaze. Derefter mobilisere og forsigtigt udvendige ileum.Udrulle mindst seks centimeter terminal ileum på den våde bomuld gaze uden at forstyrre mesenteric fartøjer og blodforsyningen. Hold det eksponerede væv fugtigt hele tiden med varm HBSS. Identificer den store arterie, der leverer ileum i mesenteriet, tæt på cecum.Find derefter to ligationssteder i mesenteriet, der er fri for kritiske blodkar. Tag fat i terminalen ileum med stumpe vævs pincet og brug fine spids pincet til at fenestrate mesenteriet, undgå blodkar. Placer silke sutur på tværs af perforering, og binde en kirurgisk knude til at skabe den første ligation.Brug linealen til at måle fire centimeter væk fra den første ligatur, og opret den anden ligatur. Skær forsigtigt ved siden af hver ligation med fin saks for at isolere den fire centimeter ileal loop, holde blodforsyningen og mesenterisk membran intakt. Skyl forsigtigt indholdet af ileal loop-segmentet med varm HBSS ved hjælp af et fleksibelt gult fodringsrør fastgjort til en 10 milliliter sprøjte.Sørg for at skylle det lysstyrkeindhold ud af bughulen for at holde det kirurgiske sted rent. Ligate de to snitender af den skyllede ileal loop med silke sutur. Brug en en milliliter sprøjte med en 30 gauge nål til langsomt at injicere 250 mikroliter reagens, såsom FITC-dextrans eller kemokine, i tarm lumen.Ilealsløjfen vil pustes op, hvilket forårsager en moderat udspiling af slimhinden. Luk bugvæggen ved hjælp af en nåleholder, anatomiske pincet og 3,0 ikke-absorberbare silke suturer med en omvendt skærenål. Efter tørring af dyret for at forhindre hypotermi, skal du placere det i et temperaturreguleret anæstesikammer i inkubationsperioden.Forbered musen til kirurgi og eksteriør cecum som tidligere demonstreret. Brug våde vatpinde, eksteriør hele ileum og læg det oven på en våd bomuldsgas. Identificere den proksimale tyktarm og blodforsyningen placeret i mesocolon.Mobilisere proksimale kolon og skabe den første ligatur i et område fri for fartøjer i mesocolon på omkring 0,5 centimeter distal fra cecum. Mål to centimeter fra den første ligatur og opret en anden ligatur i et område uden blodforsyning i mesocolon. Brug fin saks, omhyggeligt skåret ved siden af hver ligation for at isolere en to centimeter lang pcLoop.Skyl forsigtigt pcLoop med varm HBSS for at fjerne afføring ved hjælp af et fleksibelt gult fodringsrør fastgjort til en 10 milliliter sprøjte. Sørg for at skylle det lysstyrkeindhold ud af bughulen for at holde det kirurgiske sted rent. Derefter ligate de to afskårne ender af den skyllede pcLoop ved hjælp af silke sutur.Brug en en milliliter sprøjte med en 30 gauge nål til langsomt at injicere 200 mikroliter reagens, såsom FITC-dextran eller chemokine, i tarm lumen. PcLoop vil pustes op, hvilket forårsager en moderat udspiling af slimhinden. Brug våde vatpinde til forsigtigt at sætte tilbage ligated pcLoop, ileum, og cecum.Luk bugvæggen ved hjælp af en nåleholder, anatomiske pincet og 3,0 ikke-absorberbare silke suturer med en omvendt skærenål. Efter inkubationsperioden aflives den bedøvede mus og indsamles væv til analyse. For at kontrollere nøjagtigheden af I loop-modellen til vurdering af tarmgennemtrængelighed blev der udført en FITC-dextran pcLoop-analyse for at evaluere den rolle, som tæt sammenslutningsrelateret protein Jam-a spiller i reguleringen af tarmbarrierefunktionen in vivo.Med pcLoop-modellen blev en 2,5 gange stigning i FITC-dextran serumniveauer kvantificeret i Jam-a null mus sammenlignet med kontroller. Lignende resultater blev opnået med mus, der huser selektivt tab af Jam-a på tarmepitele celler. PcLoop-modellen blev brugt til at studere polymorphonuclear neutrophil, eller PMN, rekruttering til tarmslimhinden og efterfølgende transepithelial migration in vivo.Antallet af PMN i pcLoop's lysstyrke blev kvantificeret ved flowcytometrianalyse. Antallet af PMN til stede i segmentet af det proksimale kolon var lavt under fysiologiske forhold. Forbehandling med proinflammatoriske cytokiner, TNF alpha og IFN gamma, før operationen, resulterede i et øget antal PMN rekrutteret i pcLoop lumen.Administration af PMN kemo attractant LTB4 førte til en dramatisk stigning i PMN tæller. Immunohistokemisk farvning af PMN i den colon slimhinde bekræfter den forhøjede rekruttering af PMN efter stimulering med cytokiner og LTB4. Bidraget fra Jam-a til PMN transepithelial migration blev undersøgt ved hjælp af pcLoop model på mus huser selektivt tab af Jam-a på tarm epitelceller.Tab af epitel Jam-a førte til et reduceret antal transmigrerede PMN i colon lumen i forhold til littermate kontrol. Et kritisk aspekt for denne teknik er at huske at bevare blodforsyningen til det ekspærrede tarmsegment, når du udfører operationen. Efter denne protokol kan andre metoder såsom en tarmpermeabilitetsanalyse og en neutrofil transepithelial migrationsanalyse udføres for at undersøge tab af barriereintegritet og tarmbetændelse in vivo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Anvendelse af en mus Ligated Peyer er Patch Intestinal Loop Assay at evaluere Bakteriel Optagelse ved M celler

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Enteriske Bakteriel invasion af tarmepitelceller<em&gt; In Vitro</em&gt; Er dramatisk forøget hjælp af en lodret diffusionskammer Model

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay at vurdere Patogen induceret Neutrophil Trans-epitel Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

Kvantitativ vurdering af human neutrofil migration over en Kulturperler Blære epitel

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time Imaging af myeloide celler dynamik i<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinal Tumorer ved Spinning Disk Konfokal mikroskopi

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

Den mesenterielymfeknuderne Duct kanyle Rat Model: Ansøgning om vurdering af intestinal lymfatisk Drug Transport

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induktion af murine tarmbetændelse ved adoptiv overførsel af effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Høj</sup&gt; T celler i immunsvækkede mus

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Immunofluorescens Analyse af Stress Granulformation Efter Bakteriel Udfordring af Pattedyrceller

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

Induktion af Intestinal Graft - versus host klovesyge og sin Mini-endoskopisk vurdering i levende mus

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Menneskelige Colonoid encellelag at studere samspillet mellem patogener, latente og vært intestinale epitel

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...