Name: functional assessment of intestinal permeability and neutrophil transepithelial migration in mice using a standardized intestinal loop model
Uploaded: 2021-02-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model at JoVE.com

De auteurs danken Dr. Sven Flemming van de Universiteit van Wuerzburg voor zijn bijdragen aan de totstandkoming van het proximale colon loop model, Sean Watson voor het beheer van de muizenkolonies en Chithra K. Muraleedharan voor het helpen bij de aanschaf van de foto's van het iLoop model. Dit werk werd ondersteund door de German Research Foundation/DFG (BO 5776/2-1) aan KB, R01DK079392, R01DK072564 en R01DK061379 aan C.A.P.

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en het beleid van de National Institutes of Health en goedgekeurd door de Institutional Animal Care &Use Committee van de Universiteit van Michigan.
1. Preoperatieve voorbereiding
OPMERKING: Deze methode werd gegenereerd met behulp van volwassen muizen met een C57BL/6 genetische achtergrond, in de leeftijd van 8 - 12 weken. Alle muizen werden gehouden onder strikte specifieke ziekteverwekkervrije...

De mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de ontregeling van de darmbarrièrefunctie en de rekrutering van immuuncellen onder pathologische aandoeningen zoals IBD worden onvolledig begrepen. Hier beschrijven we een robuust in vivo murien model dat een goed gevasculariseerd exteriorized darmsegment van ileum of proximale dikke darm gebruikt en het mogelijk maakt om de darmpermeabiliteit, neutrofiele migratiestudies en andere toepassingen te beoordelen.
De iLoop is een niet-hersteloperatie d...

Het darmslijmvlies omvat een enkele laag zuilvormige intestinale epitheelcellen (IECs), onderliggende lamina propria immuuncellen en het muscularis-slijmvlies. Naast zijn rol in de opname van voedingsstoffen, is het darmepitheel een fysieke barrière die het lichaamsinterieur beschermt tegen luminale commensale bacteriën, pathogenen en voedingsantigenen. Bovendien coördineren IECs en lamina propria immuuncellen de immuunrespons die tolerantie of respons induceert, afhankelijk van de context en stimuli. Er is gemeld dat de verstoring van de epitheliale barrière kan voorafgaan aan het begin van pathologische mucosale ontsteking en kan bijdragen aan inflammatoire darmziekte (IBD) die zowel colitis ulcerosa als de ziekte van Crohnomvat 1,2,3,4,5,6,7. Personen met colitis ulcerosa vertonen overmatige transepitheliale migratie (TEpM) van polymorfonucleaire neutrofielen (PMN) die crypte abcessen vormen, een bevinding die is geassocieerd met de ernst van ziekte8,9. Hoewel gecompromitteerde epitheliale barrièrefunctie en overmatige immuunresponsen kenmerken van IBD zijn, is er een gebrek aan experimentele in vivo assays om kwantitatieve beoordelingen van intestinale permeabiliteit en immuuncelwerving in het darmslijmvlies uit te voeren.
De meest gebruikte methoden voor het bestuderen van intestinale epitheliale permeabiliteit en PMN TEpM maken gebruik van ex vivo kamergebaseerde benaderingen met behulp van IEC-monolagen gekweekt op semi-permeabele poreuze membraaninzetstukken10,11,12. De integriteit van de epitheelbarrière wordt gecontroleerd door metingen van transepitheliale elektrische weerstand (TEER) of de paracellulaire flux van het Fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-gelabelde dextran van apicaal naar basaalcompartiment 13,14,15. Evenzo wordt PMN TEpM meestal bestudeerd als reactie op een chemoattractant dat wordt toegevoegd in de onderste kamer16. PMN wordt in de bovenste kamer geplaatst en na een incubatieperiode wordt PMN dat naar het basale compartiment is gemigreerd verzameld en gekwantificeerd. Hoewel deze methoden nuttig, gemakkelijk uit te voeren en zeer reproduceerbaar zijn, zijn het duidelijk reductionistische benaderingen en vertegenwoordigen ze niet noodzakelijkerwijs een nauwkeurige weerspiegeling van in vivo omstandigheden.
Bij muizen is een veel voorkomende test om de intestinale paracellulaire permeabiliteit te bestuderen door orale gavage van FITC-dextran en daaropvolgende meting van fitc-dextran uiterlijk in het bloedserum13,17. Het nadeel van deze test is dat het een beoordeling is van de algehele barrière-integriteit van het maagdarmkanaal in plaats van die van regionale darmbijdragen. Bovendien wordt Evans blue vaak gebruikt om vasculaire lekkage in vivo18 te evalueren en is het ook gebruikt om de darmslijmvliesdoorlaatbaarheid bij muis en rat19,20,21te evalueren . De kwantificering van Evans blauw in het darmslijmvlies vereist extractie uit weefsel met behulp van incubatie in formamide 's nachts. Daarom kan hetzelfde weefsel niet worden gebruikt om intestinale epitheelpermeabiliteit en neutrofiele infiltratie te bestuderen.
Hier benadrukken we een eenvoudig protocol dat het aantal dieren vermindert dat nodig is om reproduceerbare gegevens te verzamelen over darmslijmvliespermeabiliteit en leukocyten transepitheliale migratie in vivo. Daarom raden we het gebruik van FITC-dextrans aan die gemakkelijk detecteerbaar zijn in bloedserum zonder de integriteit van darmlussen in gevaar te brengen die kunnen worden geoogst voor verdere analyse. Van belang is dat de intestinale ligated loops zijn gebruikt bij verschillende soorten (waaronder muis, rat, konijn, kalf) om bacteriële infecties (zoals Salmonella, Listeria monocytogenes en Escherichia coli)22,23,24,25 en intestinale permeabiliteit26te bestuderen; voor zover wij weten zijn er echter geen studies die mechanismen van PMN TEpM onderzoeken in specifieke regio's in de darm zoals ileum of dikke darm die vaak betrokken zijn bij IBD.
Hier beschrijven we het muis intestinale lus (iLoop) model dat een robuuste en betrouwbare microchirurgische in vivo methode is die een goed gevasculariseerd en exteriorized darmsegment van het ileum of proximale dikke darm gebruikt. Het iLoop-model is fysiologisch relevant en maakt de beoordeling van de integriteit van de darmbarrière en PMN TEpM op levende muizen onder narcose mogelijk. We demonstreren twee toepassingen: 1) kwantificering van serumspiegels van 4 kDa FITC-dextran na intraluminale toediening in de iLoop 2) kwantificering van getransmigreerd PMN in het iLoop lumen na intraluminale injectie van het krachtige chemottractant Leukotriene B4 (LTB4)27. Bovendien, het gebruik van het iLoop-model met Jam-a-null muizen of muizen die selectief verlies van JAM-A op IECs(Villin-cre; Jam-a fl/fl) in vergelijking met controlemuizen, kunnen we eerdere studies bevestigen die een belangrijke bijdrage hebben gemeld voor nauw junction-geassocieerd eiwit JAM-A aan intestinale permeabiliteit en neutrofiele transmigratie15,28,29,30,31.
Het iLoop-model is een zeer functionele en fysiologische methode die kan worden gebruikt om in vitro assays te bevestigen. Bovendien is dit een veelzijdig experimenteel model dat de studie mogelijk maakt van verschillende reagentia die in het luslumen kunnen worden geïnjecteerd, waaronder chemokinen, cytokinen, bacteriële pathogenen, toxines, antilichamen en therapieën.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment and Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Alcohol Swabs</td>
			<td>BD</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8&#34;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2&#34;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>07-200-592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Non-treated Culture Dish, 10cm</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6&#34;, sterile</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>25806 2WC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2&#34; x 2&#34;</td>
			<td>Medex</td>
			<td>3249-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units)</td>
			<td>E-Z Systems</td>
			<td>EZ-7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tube 50ml&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Colored Labeling Tape</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey Needle Holder (needle holder)&#160;</td>
			<td>FST</td>
			<td>12001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes, small (tissue wipe)</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7ml Microcentrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Thomas Scientific&#160;</td>
			<td>c2170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube)</td>
			<td>Sarstedt&#160;</td>
			<td>41.1501.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14370-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 &#181;m nylon mesh)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>12920060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps (blunt tissue forceps)</td>
			<td>FST</td>
			<td>11103-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>NC9452680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken Forceps (anatomical forceps)</td>
			<td>FST</td>
			<td>1108-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18&#34;, Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting&#160;</td>
			<td>HenrySchein</td>
			<td>SS694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Fine Forceps, Angled</td>
			<td>FST</td>
			<td>91110-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ml Syringe PP/PE without needle</td>
			<td>Millipore Sigma&#160;</td>
			<td>Z248029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm</td>
			<td>Instech</td>
			<td>FTP-20-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions and Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accugene 0.5M EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer</td>
			<td>BioWhittaker</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-023-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>127610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-0112-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotreitol</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, heat inactivated</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>511550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60842-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Halocarbon</td>
			<td>12164-002-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukotriene B4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71160-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>557235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IFN-&#947;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine TNF-&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional assessment of intestinal permeability and neutrophil transepithelial migration in mice using a standardized intestinal loop model

Het darmslijmvlies wordt bekleed door een enkele laag epitheelcellen die een dynamische barrière vormt die paracellulair transport van voedingsstoffen en water mogelijk maakt en tegelijkertijd de doorgang van luminale bacteriën en exogene stoffen voorkomt. Een breuk van deze laag resulteert in een verhoogde permeabiliteit van de luminale inhoud en rekrutering van immuuncellen, die beide kenmerken zijn van pathologische toestanden in de darm, waaronder inflammatoire darmziekte (IBD). 
Mechanismen die de epitheliale barrièrefunctie en transepitheliale migratie (TEpM) van polymorfonucleaire neutrofielen (PMN) reguleren, worden onvolledig begrepen vanwege het gebrek aan experimentele in vivo methoden die kwantitatieve analyses mogelijk maken. Hier beschrijven we een robuust murien experimenteel model dat een exteriorized darmsegment van ileum of proximale dikke darm gebruikt. De exteriorized intestinale lus (iLoop) is volledig gevasculariseerd en biedt fysiologische voordelen ten opzichte van ex vivo kamergebaseerde benaderingen die vaak worden gebruikt om permeabiliteit en PMN-migratie over epitheliale celmonolagen te bestuderen.
We demonstreren twee toepassingen van dit model in detail: (1) kwantitatieve meting van intestinale permeabiliteit door detectie van fluorescentie-gelabelde dextrans in serum na intraluminale injectie, (2) kwantitatieve beoordeling van gemigreerd PMN over het darmepitheel in het darmlumen na intraluminale introductie van chemoattractanten. We tonen de haalbaarheid van dit model aan en leveren resultaten met behulp van de iLoop bij muizen die het epitheliale strakke junction-geassocieerde eiwit JAM-A missen in vergelijking met controles. Van JAM-A is aangetoond dat het de epitheliale barrièrefunctie en PMN TEpM reguleert tijdens ontstekingsreacties. Onze resultaten met behulp van de iLoop bevestigen eerdere studies en benadrukken het belang van JAM-A bij de regulering van intestinale permeabiliteit en PMN TEpM in vivo tijdens homeostase en ziekte. 
Het iLoop-model biedt een sterk gestandaardiseerde methode voor reproduceerbare in vivo studies van intestinale homeostase en ontsteking en zal het begrip van de darmbarrièrefunctie en mucosale ontsteking bij ziekten zoals IBD aanzienlijk verbeteren.

Een schematische weergave van de ileale lus- en pcLoop-modellen is weergegeven in respectievelijk figuur 1 en figuur 2. De anatomische afbeeldingen tonen de kritieke stappen van de procedure, waaronder exteriorisatie van het darmsegment (figuur 1B en figuur 2B), identificatie van een geschikte locatie voor ligaties die minimale verstoring van de bloedtoevoer mogelijk maakt (<str...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model at JoVE.com

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

Ontregelde intestinale epitheliale barrièrefunctie en immuunresponsen zijn kenmerken van inflammatoire darmziekten die slecht worden onderzocht vanwege een gebrek aan fysiologische modellen. Hier beschrijven we een muis intestinale lus model dat een goed gevasculariseerd en exteriorized darmsegment gebruikt om mucosale permeabiliteit en leukocyten rekrutering in vivo te bestuderen.

Functionele beoordeling van intestinale permeabiliteit en neutrofiele transepitheliale migratie bij muizen met behulp van een gestandaardiseerd intestinale lusmodel

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...

Het darmmodel is een breed aanpasbare en fysiologische manier om te meten hoe lek de darm is en hoe leukocyten migreren in de darm bij muizen, in vivo. Deze methode helpt om mechanismen die ten grondslag liggen aan verhoogde darmpermeabiliteit en pathologische darmontsteking beter te begrijpen. De techniek kan worden gebruikt om te helpen bij het begrijpen van mechanismen die ten grondslag liggen aan de darmbarrièrefunctie en pathologische ontsteking, zoals te zien is bij colitis ulcerosa en de ziekte van Crohn.Dit model maakt gebruik van een goed gevasculariseerd, exteriorized darmsegment, hetzij van het ileum of proximale dikke darm, voor het onderzoek van de darmbarrièrefunctie of immuuncelwerving bij muizen. Met deze brede toepassing kan het darmlusmodel inzicht geven in ziekten die het gevolg zijn van een lekkende darmbarrière en de ontstekingsreactie. Worstelingen kunnen worden overwonnen door de chirurgische stappen te oefenen.Het is van cruciaal belang om een volledig gevasculariseerd darmsegment te buiten en geschikte locaties voor de ligaties te selecteren om bloedingen te voorkomen. Het intestinale lusmodel is een microchirurgische techniek, dus, net als bij andere chirurgische procedures, profiteert het enorm van visuele demonstratie en een stapsgewijze presentatie van de methode. Na het bereiken van een chirurgisch anesthesievlak, begin met het schrobben van de vacht van de buikmiddenlijn met alcoholdoekjes of een gaasspons gedrenkt in 70% ethanol.Maak een breed stuk bont niet nat met alcohol om onderkoeling te voorkomen. Voer met een schaar een laparotomie in de middellijn uit. Maak een horizontale incisie in het midden van de buik en stel het buikvlies bloot, zorg ervoor dat u geen organen binnen de buik verwondt.Plaats voorgesneden nat katoenen gaas over de blootgestelde intra-abdominale holte. Gebruik natte wattenstaafjes om het cecum te mobiliseren en te exterieuriseren en plaats het voorzichtig op nat katoenen gaas. Mobiliseer vervolgens en maak het ileum voorzichtig buiten.Zet ten minste zes centimeter terminaal ileum in op het natte katoenen gaas zonder de mesenterische vaten en de bloedtoevoer te verstoren. Houd de blootgestelde weefsels te allen tijde vochtig met warme HBSS. Identificeer de grote slagader die het ileum levert in de mesenterie, dicht bij het cecum.Zoek vervolgens twee ligatieplaatsen in de mesenterie die vrij zijn van kritieke bloedvaten. Pak het terminale ileum stevig vast met een stompe weefselduw en gebruik een fijne tip forceps om de mesenterie te fenestreren, waarbij bloedvaten worden vermeden. Plaats zijde hechtdraad over de perforatie en bind een chirurgische knoop om de eerste ligatie te creëren.Gebruik de liniaal om vier centimeter afstand van de eerste ligatuur te meten en de tweede ligatuur te maken. Snijd voorzichtig naast elke ligatie met een fijne schaar om de vier centimeter ileale lus te isoleren, waardoor de bloedtoevoer en het mesenterische membraan intact blijven. Spoel de inhoud van het ileale lussegment voorzichtig door met warme HBSS met behulp van een flexibele gele voedingsbuis die aan een spuit van 10 milliliter is bevestigd.Zorg ervoor dat u de luminale inhoud uit de buikholte spoelt om de chirurgische plaats schoon te houden. Ligateer de twee gesneden uiteinden van de doorgespoelde ileale lus met zijden hechtdraad. Gebruik een spuit van één milliliter met een naald van 30 gauge om langzaam 250 microliter reagens, zoals FITC-dextrans of chemokine, in het darmlumen te injecteren.De ileale lus zal opblazen, waardoor een matige uitzetting van het slijmvlies ontstaat. Sluit de buikwand met een naaldhouder, anatomische tang en 3.0 niet-absorbeerbare zijden hechtingen met een omgekeerde snijnaald. Na het drogen van het dier om onderkoeling te voorkomen, plaatst u het in een temperatuurgereguleerde anesthesiekamer voor de incubatieperiode.Bereid de muis voor op een operatie en maak het cecum buiten zoals eerder aangetoond. Gebruik natte wattenstaafjes, maak het hele ileum buiten en leg het bovenop een nat katoenen gaas. Identificeer de proximale dikke darm en de bloedtoevoer in de mesocolon.Mobiliseer de proximale dikke darm en creëer de eerste ligatuur in een gebied vrij van vaten in de mesocolon op ongeveer 0,5 centimeter distaal van het cecum. Meet twee centimeter van de eerste ligatuur en creëer een tweede ligatuur op een gebied dat vrij is van bloedtoevoer in de mesocolon. Snijd met een fijne schaar voorzichtig naast elke ligatie om een twee centimeter lange pcLoop te isoleren.Spoel de pcLoop voorzichtig door met warme HBSS om uitwerpselen te verwijderen met behulp van een flexibele gele voedingsbuis die aan een spuit van 10 milliliter is bevestigd. Zorg ervoor dat u de luminale inhoud uit de buikholte spoelt om de chirurgische plaats schoon te houden. Ligateer vervolgens de twee gesneden uiteinden van de doorgespoelde pcLoop met behulp van zijden hechtdraad.Gebruik een spuit van één milliliter met een naald van 30 gauge om langzaam 200 microliter reagens, zoals FITC-dextran of chemokine, in het darmlumen te injecteren. De pcLoop zal opblazen, waardoor een matige uitzetting van het slijmvlies ontstaat. Gebruik natte wattenstaafjes om de ligated pcLoop, ileum en cecum voorzichtig terug te zetten.Sluit de buikwand met een naaldhouder, anatomische tang en 3.0 niet-absorbeerbare zijden hechtingen met een omgekeerde snijnaald. Na de incubatieperiode euthanaseert u de verdoofde muis en verzamelt u weefsels voor analyse. Om de nauwkeurigheid van het I-lusmodel voor de beoordeling van de darmpermeabiliteit te verifiëren, werd een FITC-dextran pcLoop-test uitgevoerd om de rol van nauw junction geassocieerd eiwit Jam-a in de regulering van de darmbarrièrefunctie in vivo te evalueren.Met het pcLoop-model werd een 2,5-voudige toename van fitc-dextran serumspiegels gekwantificeerd in Jam-a null muizen in vergelijking met controles. Vergelijkbare resultaten werden verkregen bij muizen die selectief verlies van Jam-a op intestinale epitheelcellen herbergden. Het pcLoop-model werd gebruikt om polymorfonucleaire neutrofiel, of PMN, rekrutering in het darmslijmvlies en daaropvolgende transepitheliale migratie in vivo te bestuderen.Het aantal PMN in de luminale inhoud van de pcLoop werd gekwantificeerd door flow cytometrie analyse. Het aantal PMN in het segment van de proximale dikke darm was laag onder fysiologische omstandigheden. Voorbehandeling met pro-inflammatoire cytokinen, TNF alfa en IFN gamma, voorafgaand aan de operatie, resulteerde in een verhoogd aantal PMN gerekruteerd in de pcLoop lumen.Toediening van de PMN chemo attractant LTB4 leidde tot een dramatische toename van pmn tellingen. Immunohistochemische kleuring van PMN in het darmslijmvlies bevestigt de verhoogde rekrutering van PMN na stimulatie met cytokinen en LTB4. De bijdrage van Jam-a aan PMN transepitheliale migratie werd bestudeerd met behulp van het pcLoop-model op muizen die selectief verlies van Jam-a op intestinale epitheelcellen herbergen.Verlies van epitheliale Jam-a leidde tot een verminderd aantal getransmigreerde PMN in het colonlumen in vergelijking met nestmaatcontroles. Een cruciaal aspect voor deze techniek is om te onthouden om de bloedtoevoer naar het buitenste darmsegment te behouden bij het uitvoeren van de operatie. Volgens dit protocol kunnen andere methoden zoals een intestinale permeabiliteitstest en een neutrofiele transepitheliale migratietest worden uitgevoerd om verlies van barrière-integriteit en darmontsteking in vivo te onderzoeken.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Toepassing van een muis geligateerd Peyer&#39;s Patch Intestinale Loop Assay om Bacteriële opname evalueren door M-cellen

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Enterische Bacteriële invasie van darmepitheelcellen<em&gt; In Vitro</em&gt; Is het drastisch verbeterde Met behulp van een verticale Diffusion Kamer Model

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay om pathogene geïnduceerde neutrofiele trans-epitheliale migratie te beoordelen

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

Kwantitatieve beoordeling van Human migratie van neutrofielen door een Gekweekte blaas epitheel

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time beeldvorming van myeloïde cellen Dynamiek in<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinale Tumoren door draaiende schijf confocale microscopie

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

De Mesenteriale Lymfe Duct gecanuleerde Rat Model: Toepassing op de beoordeling van Intestinal Lymfatische Drug Transport

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Inductie van Muriene darmontsteking door adoptieve overdracht van effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoog</sup&gt; T cellen in immunodeficiënte muizen

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Immunofluorescentie analyse van stress granule vorming na bacteriële uitdaging van zoogdiercellen

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

Inductie van intestinale Graft - versus host klauwzeer en haar Mini-Endoscopische beoordeling in levende muizen

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Menselijke Colonoid Monolayers studie van interacties tussen ziekteverwekkers, Commensals en Host intestinaal epitheel

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...