Name: functional assessment of intestinal permeability and neutrophil transepithelial migration in mice using a standardized intestinal loop model
Uploaded: 2021-02-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model at JoVE.com

Les auteurs remercient le Dr Sven Flemming de l’Université de Wuerzburg pour ses contributions à l’établissement du modèle de boucle proximale du côlon, Sean Watson pour la gestion des colonies de souris et Chithra K. Muraleedharan pour avoir aidé à l’acquisition des images du modèle iLoop. Ce travail a été soutenu par la Fondation allemande pour la recherche/DFG (BO 5776/2-1) à KB, R01DK079392, R01DK072564 et R01DK061379 à C.A.P.

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux lignes directrices et aux politiques des National Institutes of Health et approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université du Michigan.
1. Préparation préopératoire
REMARQUE: Cette méthode a été générée en utilisant des souris adultes issues de l’expérience génétique C57BL/6, âgées de 8 à 12 semaines. Toutes les souris o...

Les mécanismes responsables du dysregulation de la fonction intestinale de barrière et du recrutement de cellules immunitaires dans des conditions pathologiques telles que IBD sont incomplètement compris. Ici, nous détaillons un modèle murin in vivo robuste qui emploie un segment intestinal extériorisé bien vascularisé de l’iléon ou du côlon proximal et permet l’évaluation de la perméabilité intestinale, des études de migration des neutrophiles ainsi que d’autres applications.
<p class="jove_conte...

La muqueuse intestinale englobe une seule couche de cellules épithéliales intestinales conaires (CSI), les cellules immunitaires sous-jacentes de propria de lame et les muqueuses musculaires. Outre son rôle dans l’absorption des nutriments, l’épithélium intestinal est une barrière physique qui protège l’intérieur du corps contre les bactéries commensales luminales, les agents pathogènes et les antigènes alimentaires. En outre, les cellules immunitaires IECs et propria de lame coordonnent la réponse immunitaire induisant la tolérance ou la réponse selon le contexte et les stimuli. Il a été rapporté que la perturbation de la barrière épithéliale peut précéder l’apparition de l’inflammation muqueuse pathologique et contribuer à la maladie inflammatoire de l’intestin (MII) englobant à la fois la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn1,2,3,4,5,6,7. Les individus atteints de colite ulcéreuse présentent une migration transépithéliale excessive (TEpM) de neutrophiles polymorphonucléaires (PMN) formant des abcès de crypte, une conclusion qui a été associée à la gravité de la maladie8,9. Bien que la fonction compromise de barrière épithéliale et les immuno-réactions excessives soient des caractéristiques de IBD, il y a un manque d’essais in vivo expérimentaux pour exécuter des évaluations quantitatives de la perméabilité intestinale et du recrutement de cellules immunitaires dans la muqueuse intestinale.
Les méthodes les plus couramment utilisées pour étudier la perméabilité épithéliale intestinale et pmn TEpM emploient des approches ex vivo à base de chambre utilisant des monocouches IEC cultivées sur des inserts de membrane poreuse semi-perméables10,11,12. L’intégrité de la barrière épithéliale est surveillée soit par des mesures de résistance électrique transépithéliale (TEER), soit par le flux paracellulaire du dextrane marqué par l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) du compartiment apical au compartiment basal13,14,15. De même, le PMN TEpM est typiquement étudié en réponse à un chimioattractant qui est ajouté dans la chambre basse16. Les PMN sont placés dans la chambre haute et après une période d’incubation, les PMN qui ont migré dans le compartiment basal sont collectés et quantifiés. Bien que ces méthodes soient utiles, faciles à réaliser et très reproductibles, elles sont évidemment des approches réductionnistes et ne représentent pas nécessairement un reflet précis des conditions in vivo.
Chez la souris, un dosage courant pour étudier la perméabilité paracellulaire intestinale consiste à gavage oral de FITC-dextrane et mesure ultérieure de l’aspect FITC-dextrane dans le sérum sanguin13,17. L’inconvénient de ce test est qu’il représente une évaluation de l’intégrité globale de la barrière du tractus gastro-intestinal plutôt que celle des contributions intestinales régionales. En outre, le bleu d’Evans est couramment utilisé pour évaluer les fuites vasculaires in vivo18 et a également été utilisé pour évaluer la perméabilité muqueuse intestinale chez la souris et le rat19,20,21. La quantification du bleu d’Evans dans la muqueuse intestinale nécessite une extraction à partir de tissus utilisant l’incubation dans le formamide pendant la nuit. Par conséquent, le même tissu ne peut pas être employé pour étudier la perméabilité épithéliale intestinale et l’infiltration de neutrophile.
Ici nous mettons en évidence un protocole simple qui réduit le nombre d’animaux nécessaires pour collecter des données reproductibles sur la perméabilité muqueuse du côlon et la migration transepithelial de leucocyte in vivo. Nous recommandons donc l’utilisation de FITC-dextrans qui sont facilement discernables dans le sérum sanguin sans compromettre l’intégrité des boucles intestinales qui peuvent être récoltées pour davantage d’analyse. A noter, les boucles ligatures intestinales ont été utilisées chez diverses espèces (dont la souris, le rat, le lapin, le veau) pour étudier les infections bactériennes (telles que Salmonella, Listeria monocytogenes et Escherichiacoli)22,23,24,25 ainsi que la perméabilité intestinale26; cependant, au meilleur de notre connaissance il n’y a aucune étude étudiant des mécanismes de PMN TEpM dans des régions spécifiques dans l’intestin telles que l’iléon ou les deux points qui sont généralement impliqués dans IBD.
Ici nous décrivons le modèle intestinal de boucle intestinale de souris (iLoop) qui est une méthode in vivo microchirurgical robuste et fiable qui emploie un segment intestinal bien-vascularisé et extériorisé de l’iléon ou des deux points proximaux. Le modèle iLoop est physiologiquement pertinent et permet d’évaluer l’intégrité de la barrière intestinale et le PMN TEpM sur des souris vivantes sous anesthésie. Nous démontrons deux applications : 1) quantification des niveaux sériques de 4 kDa FITC-dextrane après administration intraluminale dans l’iLoop 2) quantification de PMN transmigré dans l’iLoop lumen après injection intraluminale du puissant chemottractant LeukotrieneB4 (LTB4)27. De plus, en utilisant le modèle iLoop avec des souris Jam-a-nullou des souris hébergeant une perte sélective de JAM-A sur les IECs (Villin-cre; Jam-a fl/fl)par rapport aux souris témoins, nous sommes en mesure de corroborer des études antérieures qui ont rapporté une contribution majeure pour la protéine JAM-A associée à la jonction serrée à la perméabilité intestinale et à la transmigration des neutrophiles15,28,29,30,31.
Le modèle iLoop est une méthode hautement fonctionnelle et physiologique qui peut être utilisée pour corroborer les essais in vitro. En outre, il s’agit d’un modèle expérimental polyvalent qui permet l’étude de divers réactifs qui peuvent être injectés dans la lumière de l’anse, y compris les chimiokines, les cytokines, les agents pathogènes bactériens, les toxines, les anticorps et les thérapeutiques.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment and Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Alcohol Swabs</td>
			<td>BD</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8&#34;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2&#34;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>07-200-592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Non-treated Culture Dish, 10cm</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6&#34;, sterile</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>25806 2WC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2&#34; x 2&#34;</td>
			<td>Medex</td>
			<td>3249-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units)</td>
			<td>E-Z Systems</td>
			<td>EZ-7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tube 50ml&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Colored Labeling Tape</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey Needle Holder (needle holder)&#160;</td>
			<td>FST</td>
			<td>12001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes, small (tissue wipe)</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7ml Microcentrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Thomas Scientific&#160;</td>
			<td>c2170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube)</td>
			<td>Sarstedt&#160;</td>
			<td>41.1501.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14370-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 &#181;m nylon mesh)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>12920060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps (blunt tissue forceps)</td>
			<td>FST</td>
			<td>11103-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>NC9452680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken Forceps (anatomical forceps)</td>
			<td>FST</td>
			<td>1108-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18&#34;, Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting&#160;</td>
			<td>HenrySchein</td>
			<td>SS694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Fine Forceps, Angled</td>
			<td>FST</td>
			<td>91110-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ml Syringe PP/PE without needle</td>
			<td>Millipore Sigma&#160;</td>
			<td>Z248029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm</td>
			<td>Instech</td>
			<td>FTP-20-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions and Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accugene 0.5M EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer</td>
			<td>BioWhittaker</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-023-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>127610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-0112-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotreitol</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, heat inactivated</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>511550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60842-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Halocarbon</td>
			<td>12164-002-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukotriene B4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71160-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>557235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IFN-&#947;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine TNF-&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional assessment of intestinal permeability and neutrophil transepithelial migration in mice using a standardized intestinal loop model

La muqueuse intestinale est tapée d’une seule couche de cellules épithéliales qui forme une barrière dynamique permettant le transport paracellulaire des nutriments et de l’eau tout en empêchant le passage des bactéries luminales et des substances exogènes. Une violation de cette couche entraîne une perméabilité accrue au contenu luminal et au recrutement de cellules immunitaires, qui sont les caractéristiques des états pathologiques dans l’intestin, y compris la maladie inflammatoire de l’intestin (MII). 
Des mécanismes régulant la fonction épithéliale de barrière et la migration transepithelial (TEpM) des neutrophiles polymorphonucléaires (PMN) sont insuffisamment compris en raison du manque de méthodes in vivo expérimentales permettant des analyses quantitatives. Ici, nous décrivons un modèle expérimental murin robuste qui emploie un segment intestinal extériorisé de l’iléum ou des deux points proximaux. La boucle intestinale extériorisée (iLoop) est entièrement vascularisée et offre des avantages physiologiques par rapport aux approches ex vivo basées sur la chambre couramment utilisées pour étudier la perméabilité et la migration pmn à travers les monocouches de cellules épithéliales.
Nous démontrons deux applications de ce modèle en détail : (1) mesure quantitative de perméabilité intestinale par la détection de dextrans fluorescence-marqué dans le sérum après injection intraluminale, (2) évaluation quantitative de PMN émigré à travers l’épithélium intestinal dans le lumen d’intestin après introduction intraluminale des chemoattractants. Nous démontrons la faisabilité de ce modèle et fournissons des résultats en utilisant l’iLoop chez les souris dépourvues de la protéine JAM-A associée à la jonction serrée épithéliale par rapport aux contrôles. JAM-A a été montré pour réguler la fonction de barrière épithéliale aussi bien que PMN TEpM pendant des réponses inflammatoires. Nos résultats à l’aide de l’iLoop confirment les études précédentes et soulignent l’importance de JAM-A dans la régulation de la perméabilité intestinale et du PMN TEpM in vivo pendant l’homéostasie et la maladie. 
Le modèle iLoop fournit une méthode hautement normalisée pour les études in vivo reproductibles de l’homéostasie intestinale et de l’inflammation et améliorera considérablement la compréhension de la fonction de barrière intestinale et de l’inflammation des muqueuses dans des maladies telles que les MII.

Une représentation schématique des modèles de boucle iléale et de pcLoop est représentée à la figure 1 et à la figure 2,respectivement. Les images anatomiques montrent les étapes critiques de la procédure, y compris l’extériorisation du segment intestinal(figure 1B et figure 2B),l’identification d’un emplacement approprié pour les ligatures qui permet une perturbation ...

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Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

La fonction épithéliale intestinale dérégulée de barrière et les immuno-réactions sont des cachets de la maladie d’entrailles inflammatoire qui restent mal étudiées en raison d’un manque de modèles physiologiques. Ici, nous décrivons un modèle intestinal de boucle de souris qui emploie un segment bien-vascularisé et extériorisé d’entrailles pour étudier la perméabilité muqueuse et le recrutement de leucocyte in vivo.

Évaluation fonctionnelle de la perméabilité intestinale et de la migration transépithéliale des neutrophiles chez la souris à l’aide d’un modèle normalisé de boucle intestinale

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...

Le modèle intestinal est un moyen largement adaptable et physiologique de mesurer à quel point l’intestin est perméable et comment les leucocytes migrent dans l’intestin chez la souris, in vivo. Cette méthode permet de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à l’augmentation de la perméabilité intestinale et à l’inflammation intestinale pathologique. La technique peut être employée pour aider à nos mécanismes de compréhension étant à la base de la fonction de barrière d’intestin, et inflammation pathologique, comme vu dans la colite ulcérative et Crohn' la maladie de s.Ce modèle emploie un segment bien vascularisé et extériorisé d’entrailles, de l’iléon ou du côlon proximal, pour l’examen de la fonction de barrière intestinale ou du recrutement de cellules immunitaires chez la souris. Avec cette large application, le modèle de boucle intestinale peut fournir des informations sur les maladies résultant soit d’une barrière intestinale perméable ainsi que de la réponse inflammatoire. Les difficultés peuvent être surmontées en pratiquant les étapes chirurgicales.Il est en critique important d’extérioriser un segment intestinal entièrement vascularisé et de choisir des endroits appropriés pour que les ligatures évitent le saignement. Le modèle de boucle intestinale est une technique microchirurgicale, ainsi, comme avec d’autres procédures chirurgicales, il bénéficie grandement d’une démonstration visuelle et d’une présentation étape par étape de la méthode. Après avoir atteint un plan chirurgical d’anesthésie, commencez par frotter la fourrure de la ligne médiane abdominale avec des tampons d’alcool ou une éponge de gaze imbibée d’éthanol à 70%.Ne mouillez pas une large zone de fourrure avec de l’alcool pour prévenir l’hypothermie. À l’aide de ciseaux, effectuez une laparotomie médiane. Faites une incision horizontale au milieu de l’abdomen et exposez le péritoine, en prenant soin de ne pas blesser les organes intra-abdominaux.Placez de la gaze de coton humide prédécoupée sur la cavité intra-abdominale exposée. Utilisez des cotons-tiges humides pour mobiliser et extérioriser le caecum et placez-le soigneusement sur de la gaze de coton humide. Ensuite, mobilisez et extériorisez doucement l’iléon.Déployer au moins six centimètres d’iléon terminal sur la gaze de coton humide sans perturber les vaisseaux mésentériques et l’approvisionnement en sang. Gardez les tissus exposés humides en tout temps avec hbss chaud. Identifier l’artère principale fournissant l’iléon dans le mésentère, près du caecum.Ensuite, localisez deux sites de ligature dans le mésentère qui sont exempts de vaisseaux sanguins critiques. Saisissez fermement l’iléon terminal avec une pince tissulaire émoussée et utilisez une pince à pointe fine pour fenêtrer le mésentère, en évitant les vaisseaux sanguins. Placez la suture de soie à travers la perforation et attachez un nœud chirurgical pour créer la première ligature.Utilisez la règle pour mesurer quatre centimètres de la première ligature et créez la deuxième ligature. Coupez soigneusement à côté de chaque ligature avec de fines ciseaux pour isoler la boucle iléale de quatre centimètres, en gardant l’approvisionnement en sang et la membrane mésentérique intacts. Rincer doucement le contenu du segment de la boucle iléale avec hbss chaud à l’aide d’un tube d’alimentation jaune flexible attaché à une seringue de 10 millilitres.Assurez-vous de rincer le contenu luminal de la cavité abdominale pour garder le site chirurgical propre. Liser les deux extrémités coupées de la boucle iléale rougie avec une suture de soie. Utilisez une seringue d’un millilitre avec une aiguille de calibre 30 pour injecter lentement 250 microlitres de réactif, tels que FITC-dextrans ou chimiokine, dans la lumière intestinale.L’anse iléale va gonfler, provoquant une distension modérée de la muqueuse. Fermez la paroi abdominale à l’aide d’un porte-aiguille, d’une pince anatomique et de sutures de soie non absorbables 3.0 à l’aide d’une aiguille de coupe inversée. Après avoir séché l’animal pour prévenir l’hypothermie, placez-le dans une chambre d’anesthésie à température réglée pendant la période d’incubation.Préparez la souris pour la chirurgie et extériorisez le caecum comme démontré précédemment. À l’aide de cotons-tiges humides, extériorisez tout l’iléon et placez-le sur une gaze de coton humide. Identifier le côlon proximal et l’approvisionnement en sang situé dans le mésocolon.Mobiliser les deux points proximaux et créer la première ligature dans une zone exempte de vaisseaux dans le mésocolon à environ 0,5 centimètre distal du caecum. Mesurer deux centimètres à partir de la première ligature et créer une deuxième ligature à une zone exempte d’apport sanguin dans le mésocolon. À l’aide de ciseaux fins, coupez soigneusement à côté de chaque ligature pour isoler un pcLoop de deux centimètres de long.Rincer doucement le pcLoop avec du HBSS chaud pour éliminer les matières fécales à l’aide d’un tube d’alimentation jaune flexible fixé à une seringue de 10 millilitres. Assurez-vous de rincer le contenu luminal de la cavité abdominale pour garder le site chirurgical propre. Ensuite, léguez les deux extrémités coupées du pcLoop rincé à l’aide d’une suture de soie.Utilisez une seringue d’un millilitre avec une aiguille de calibre 30 pour injecter lentement 200 microlitres de réactif, tels que le FITC-dextrane ou la chimiokine, dans la lumière intestinale. Le pcLoop va gonfler, provoquant une distension modérée de la muqueuse. Utilisez des cotons-tiges humides pour remettre doucement le pcLoop, l’iléon et le caecum ligurés.Fermez la paroi abdominale à l’aide d’un porte-aiguille, d’une pince anatomique et de sutures de soie non absorbables 3.0 à l’aide d’une aiguille de coupe inversée. Après la période d’incubation, euthanasier la souris anesthésiée et recueillir des tissus pour analyse. Afin de vérifier l’exactitude du modèle de boucle I pour l’évaluation de la perméabilité intestinale, un essai de PCLoop de FITC-dextrane a été exécuté pour évaluer le rôle de la protéine jam-a associée de jonction serrée dans le règlement de la fonction intestinale de barrière in vivo.Avec le modèle pcLoop, une augmentation de 2,5 fois des niveaux de sérum FITC-dextrane a été quantifiée chez les souris jam-a nulles comparées aux contrôles. Des résultats semblables ont été obtenus avec des souris hébergeant la perte sélective de Jam-a sur les cellules épithéliales intestinales. Le modèle pcLoop a été utilisé pour étudier le recrutement de neutrophiles polymorphonucléaires, ou PMN, dans la muqueuse intestinale et la migration transépithéliale ultérieure in vivo.Le nombre de PMN dans le contenu luminal du pcLoop a été quantifié par analyse cytométrique de flux. Le nombre de PMN présent dans le segment des deux points proximaux était bas dans des conditions physiologiques. Le traitement préparatoire avec les cytokines pro-inflammatoires, l’alpha de TNF et le gamma d’IFN, avant la chirurgie, a eu comme conséquence des nombres augmentés de PMN recrutés dans le lumen de pcLoop.L’administration de l’attractif de chimio PMN LTB4 a mené à une augmentation spectaculaire des comptes de PMN. La souillure d’Immunohistochemical de PMN dans le mucosa du côlon corrobore le recrutement élevé de PMN après stimulation avec des cytokines et LTB4. La contribution de Jam-a à la migration transépithéliale de PMN a été étudiée utilisant le modèle de pcLoop sur des souris hébergeant la perte sélective de Jam-a sur les cellules épithéliales intestinales.La perte de Jam-A épithélial a mené à un nombre réduit de PMN transmigrated dans le lumen du côlon comparé aux commandes de littermate. Un aspect critique de cette technique est de se rappeler de préserver l’approvisionnement en sang au segment intestinal extériorisé lors de l’exécution de la chirurgie. Suivant ce protocole, d’autres méthodes telles qu’un essai de perméabilité intestinale et un essai transepithelial de migration de neutrophile peuvent être exécutées pour étudier la perte d’intégrité de barrière et l’inflammation intestinale in vivo.

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Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...