Name: functional assessment of intestinal permeability and neutrophil transepithelial migration in mice using a standardized intestinal loop model
Uploaded: 2021-02-11T13:00:00
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Die Autoren danken Dr. Sven Flemming von der Universität Würzburg für seine Beiträge zur Etablierung des proximalen Dickdarmschleifenmodells, Sean Watson für das Management der Mauskolonien und Chithra K. Muraleedharan für die Hilfe bei der Anschaffung der Bilder des iLoop-Modells. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft/DFG (BO 5776/2-1) zu KB, R01DK079392, R01DK072564 und R01DK061379 zu C.A.P.

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Richtlinien der National Institutes of Health durchgeführt und vom Institutional Animal Care & Use Committee an der University of Michigan genehmigt.
1. Präoperative Vorbereitung
HINWEIS: Diese Methode wurde mit erwachsenen Mäusen aus dem genetischen Hintergrund C57BL / 6 im Alter von 8 - 12 Wochen entwickelt. Alle Mäuse wurden unter strengen spezifischen pathogenfreien Bedingungen mit ad libitum...

Die Mechanismen, die für die Dysregulation der Darmbarrierefunktion und die Rekrutierung von Immunzellen unter pathologischen Erkrankungen wie IBD verantwortlich sind, sind unvollständig verstanden. Hier beschreiben wir ein robustes in vivo murines Modell, das ein gut vaskularisiertes exteriorisiertes Darmsegment von entweder Ileum oder proximalem Dickdarm verwendet und die Beurteilung der Darmpermeabilität, neutrophilen Migrationsstudien sowie anderer Anwendungen ermöglicht.
Der iLoop ist...

Die Darmschleimhaut umfasst eine einzige Schicht aus säulenförmigen Darmepithelzellen (IECs), darunter liegenden Lamina propria Immunzellen und den Muscularis mucosae. Neben seiner Rolle bei der Aufnahme von Nährstoffen ist das Darmepithel eine physikalische Barriere, die das Körperinnere vor luminalen kommensalen Bakterien, Krankheitserregern und diätetischen Antigenen schützt. Darüber hinaus koordinieren IECs und Lamina propria-Immunzellen die Immunantwort, die je nach Kontext und Reizen entweder Toleranz oder Reaktion induziert. Es wurde berichtet, dass die Störung der Epithelbarriere dem Beginn einer pathologischen Schleimhautentzündung vorausgehen und zu entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) beitragenkann,die sowohl Colitis ulcerosa als auch Morbus Crohnumfassen 1,2,3 ,4,5,6,7. Personen mit Colitis ulcerosa zeigen eine übermäßige transepitheliale Migration (TEpM) von polymorphonukleären Neutrophilen (PMN), die Kryptenabszesse bilden, ein Befund, der mit der Schwere der Erkrankung in Verbindung gebracht wurde8,9. Obwohl eine beeinträchtigte epitheliale Barrierefunktion und übermäßige Immunantworten Kennzeichen von IBD sind, fehlt es an experimentellen In-vivo-Assays, um quantitative Bewertungen der Darmpermeabilität und der Rekrutierung von Immunzellen in die Darmschleimhaut durchzuführen.
Die gebräuchlichsten Methoden zur Untersuchung der intestinalen epithelialen Permeabilität und PMN TEpM verwenden ex vivo kammerbasierte Ansätze unter Verwendung von IEC-Monoschichten, die auf semipermeablen porösen Membraneinsätzen10,11,12kultiviert werden. Die Integrität der epithelialen Barriere wird entweder durch Messungen des transepithelialen elektrischen Widerstands (TEER) oder des parazellulären Flusses des Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-markierten Dextrans vom apikalen zum basalen Kompartiment13,14,15überwacht. In ähnlicher Weise wird PMN TEpM typischerweise als Reaktion auf ein Chemoattraktum untersucht, das in der unteren Kammer16hinzugefügt wird. PMN werden in die obere Kammer gelegt und nach einer Inkubationszeit werden PMN, die in das Basalkompartiment gewandert sind, gesammelt und quantifiziert. Während diese Methoden nützlich, einfach durchzuführen und sehr reproduzierbar sind, sind sie offensichtlich reduktionistische Ansätze und stellen nicht unbedingt eine genaue Reflexion der In-vivo-Bedingungen dar.
Bei Mäusen ist ein gängiger Assay zur Untersuchung der intestinalen parazellulären Permeabilität durch orale Gavage von FITC-Dextran und anschließende Messung des FITC-Dextran-Aussehens im Blutserum13,17. Der Nachteil dieses Assays besteht darin, dass er eine Beurteilung der allgemeinen Barriereintegrität des Magen-Darm-Trakts und nicht die der regionalen Darmbeiträge darstellt. Darüber hinaus wird Evans-Blau häufig verwendet, um vaskuläre Leckagen in vivo18 zu bewerten, und wurde auch verwendet, um die Darmschleimhautpermeabilität bei Maus und Ratte19,20,21zu bewerten . Die Quantifizierung von Evansblau in der Darmschleimhaut erfordert die Extraktion aus Gewebe, das über Nacht in Formamid inkubiert wird. Daher kann das gleiche Gewebe nicht verwendet werden, um die intestinale epitheliale Permeabilität und die Neutrophileninfiltration zu untersuchen.
Hier heben wir ein einfaches Protokoll hervor, das die Anzahl der Tiere reduziert, die benötigt werden, um reproduzierbare Daten über die Durchlässigkeit der Kolonschleimhaut und die transepitheliale Migration von Leukozyten in vivo zu sammeln. Wir empfehlen daher die Verwendung von FITC-Dextrans, die im Blutserum leicht nachweisbar sind, ohne die Integrität der Darmschlingen zu beeinträchtigen, die für weitere Analysen geerntet werden können. Bemerkenswert ist, dass die intestinalen ligaierten Schleifen bei verschiedenen Arten (einschließlich Maus, Ratte, Kaninchen, Kalb) verwendet wurden, um bakterielle Infektionen (wie Salmonellen, Listeria monocytogenes und Escherichia coli)22,23,24,25 sowie Darmpermeabilität26zu untersuchen; Nach unserem besten Wissen gibt es jedoch keine Studien, die Mechanismen von PMN TEpM in bestimmten Regionen des Darms wie Ileum oder Dickdarm untersuchen, die häufig an IBD beteiligt sind.
Hier beschreiben wir das Maus-Darmschleifenmodell (iLoop), das eine robuste und zuverlässige mikrochirurgische In-vivo-Methode ist, die ein gut vaskularisiertes und exteriorisiertes Darmsegment des Ileums oder des proximalen Dickdarms verwendet. Das iLoop-Modell ist physiologisch relevant und ermöglicht die Beurteilung der Darmbarriereintegrität und PMN TEpM an lebenden Mäusen unter Betäubung. Wir zeigen zwei Anwendungen: 1) Quantifizierung der Serumspiegel von 4 kDa FITC-Dextran nach intraluminaler Verabreichung im iLoop 2) Quantifizierung von transmigriertem PMN im iLoop-Lumen nach intraluminaler Injektion des starken Chemottraktans LeukotrienB4 (LTB4)27. Darüber hinaus wird das iLoop-Modell mit Jam-a-null-Mäusenoder Mäusen verwendet, die einen selektiven Verlust von JAM-A auf IECs (Villin-cre; Jam-a fl/fl) im Vergleich zu Kontrollmäusen können wir frühere Studien bestätigen, die einen wichtigen Beitrag für Tight Junction-assoziiertes Protein JAM-A zur Darmpermeabilität und neutrophilen Transmigration berichtet haben15,28,29,30,31.
Das iLoop-Modell ist eine hochfunktionelle und physiologische Methode, mit der In-vitro-Assays bestätigt werden können. Darüber hinaus ist dies ein vielseitiges experimentelles Modell, das die Untersuchung verschiedener Reagenzien ermöglicht, die in das Schleifenlumen injiziert werden können, einschließlich Chemokine, Zytokine, bakterielle Krankheitserreger, Toxine, Antikörper und Therapeutika.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment and Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Alcohol Swabs</td>
			<td>BD</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8&#34;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2&#34;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>07-200-592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Non-treated Culture Dish, 10cm</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6&#34;, sterile</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>25806 2WC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2&#34; x 2&#34;</td>
			<td>Medex</td>
			<td>3249-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units)</td>
			<td>E-Z Systems</td>
			<td>EZ-7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tube 50ml&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Colored Labeling Tape</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey Needle Holder (needle holder)&#160;</td>
			<td>FST</td>
			<td>12001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes, small (tissue wipe)</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7ml Microcentrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Thomas Scientific&#160;</td>
			<td>c2170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube)</td>
			<td>Sarstedt&#160;</td>
			<td>41.1501.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14370-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 &#181;m nylon mesh)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>12920060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps (blunt tissue forceps)</td>
			<td>FST</td>
			<td>11103-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>NC9452680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken Forceps (anatomical forceps)</td>
			<td>FST</td>
			<td>1108-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18&#34;, Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting&#160;</td>
			<td>HenrySchein</td>
			<td>SS694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Fine Forceps, Angled</td>
			<td>FST</td>
			<td>91110-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ml Syringe PP/PE without needle</td>
			<td>Millipore Sigma&#160;</td>
			<td>Z248029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm</td>
			<td>Instech</td>
			<td>FTP-20-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions and Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accugene 0.5M EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer</td>
			<td>BioWhittaker</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-023-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>127610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-0112-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotreitol</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, heat inactivated</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>511550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60842-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Halocarbon</td>
			<td>12164-002-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukotriene B4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71160-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>557235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IFN-&#947;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine TNF-&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional assessment of intestinal permeability and neutrophil transepithelial migration in mice using a standardized intestinal loop model

Die Darmschleimhaut wird von einer einzigen Schicht von Epithelzellen ausgekleidet, die eine dynamische Barriere bildet, die den parazellulären Transport von Nährstoffen und Wasser ermöglicht und gleichzeitig die Passage von leuchtenden Bakterien und exogenen Substanzen verhindert. Ein Bruch dieser Schicht führt zu einer erhöhten Durchlässigkeit für luminalen Inhalt und zur Rekrutierung von Immunzellen, die beide Kennzeichen pathologischer Zustände im Darm einschließlich entzündlicher Darmerkrankungen (IBD) sind. 
Mechanismen, die die epitheliale Barrierefunktion und die transepitheliale Migration (TEpM) von polymorphonukleären Neutrophilen (PMN) regulieren, sind aufgrund des Mangels an experimentellen In-vivo-Methoden, die quantitative Analysen ermöglichen, unvollständig verstanden. Hier beschreiben wir ein robustes murines experimentelles Modell, das ein exteriorisiertes Darmsegment von entweder Ileum oder proximalem Dickdarm verwendet. Die exteriorisierte Darmschleife (iLoop) ist vollständig vaskularisiert und bietet physiologische Vorteile gegenüber ex vivo kammerbasierten Ansätzen, die üblicherweise zur Untersuchung der Permeabilität und PMN-Migration über Epithelzellmonoschichten verwendet werden.
Wir zeigen zwei Anwendungen dieses Modells im Detail: (1) quantitative Messung der Darmpermeabilität durch Nachweis von fluoreszenzmarkiertem Dextrans im Serum nach intraluminaler Injektion, (2) quantitative Beurteilung von migriertem PMN über das Darmepithel in das Darmlumen nach intraluminaler Einführung von Chemoattraktantien. Wir demonstrieren die Machbarkeit dieses Modells und liefern Ergebnisse mit dem iLoop bei Mäusen, denen das epitheliale Tight Junction-assoziierte Protein JAM-A im Vergleich zu Kontrollen fehlt. Es wurde gezeigt, dass JAM-A die epitheliale Barrierefunktion sowie PMN TEpM bei Entzündungsreaktionen reguliert. Unsere Ergebnisse mit dem iLoop bestätigen frühere Studien und unterstreichen die Bedeutung von JAM-A bei der Regulation der Darmpermeabilität und PMN TEpM in vivo während der Homöostase und Erkrankung. 
Das iLoop-Modell bietet eine hochstandardisierte Methode für reproduzierbare In-vivo-Studien der intestinalen Homöostase und Entzündung und wird das Verständnis der Darmbarrierefunktion und der Schleimhautentzündung bei Krankheiten wie IBD deutlich verbessern.

Eine schematische Darstellung der Ilealschleifen- und pcLoop-Modelle ist in Abbildung 1 bzw. Abbildung 2dargestellt. Die anatomischen Bilder zeigen die kritischen Schritte des Verfahrens, einschließlich der Exteriorisierung des Darmsegments (Abbildung 1B und Abbildung 2B), der Identifizierung einer geeigneten Stelle für Ligationen, die eine minimale Störung der Blutversorgung ermögl...

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Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

Dysregulierte intestinale epitheliale Barrierefunktion und Immunantworten sind Kennzeichen entzündlicher Darmerkrankungen, die aufgrund fehlender physiologischer Modelle noch schlecht untersucht sind. Hier beschreiben wir ein Maus-Darmschleifenmodell, das ein gut vaskularisiertes und exteriorisiertes Darmsegment verwendet, um die Schleimhautpermeabilität und die Leukozytenrekrutierung in vivo zu untersuchen.

Funktionelle Beurteilung der Intestinalpermeabilität und der neutrophilen transepithelialen Migration bei Mäusen mit einem standardisierten Darmschleifenmodell

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...

Das Darmmodell ist eine weitgehend anpassungsfähige und physiologische Möglichkeit, um zu messen, wie undicht der Darm ist und wie Leukozyten bei Mäusen in vivo im Darm wandern. Diese Methode hilft, die Mechanismen besser zu verstehen, die einer erhöhten Darmpermeabilität und einer pathologischen Darmentzündung zugrunde liegen. Die Technik kann eingesetzt werden, um die Mechanismen zu verstehen, die der Darmbarrierefunktion und pathologischen Entzündungen zugrunde liegen, wie sie bei Colitis ulcerosa und Morbus Crohn beobachtet werden.Dieses Modell verwendet ein gut vaskularisiertes, exteriorisiertes Darmsegment, entweder des Ileums oder des proximalen Dickdarms, zur Untersuchung der Darmbarrierefunktion oder der Rekrutierung von Immunzellen bei der Maus. Mit dieser breiten Anwendung kann das Darmschleifenmodell Aufschluss über Erkrankungen geben, die entweder aus einer undichten Darmbarriere sowie der Entzündungsreaktion resultieren. Kämpfe können durch das Üben der chirurgischen Schritte überwunden werden.Es ist von entscheidender Bedeutung, ein vollständig vaskularisiertes Darmsegment zu exteriorisieren und geeignete Stellen für die Ligationen auszuwählen, um Blutungen zu vermeiden. Das Darmschleifenmodell ist eine mikrochirurgische Technik, daher profitiert es, wie bei anderen chirurgischen Eingriffen, stark von der visuellen Demonstration und einer schrittweisen Darstellung der Methode. Nachdem Sie eine chirurgische Anästhesieebene erreicht haben, beginnen Sie mit dem Schrubben des Fells der Abdominalmittellinie mit Alkoholtupfern oder einem mit 70% Ethanol getränkten Mullschwamm.Befeuchten Sie einen großen Bereich des Fells nicht mit Alkohol, um Unterkühlung zu verhindern. Führen Sie mit einer Schere eine Midline-Laparotomie durch. Machen Sie einen horizontalen Schnitt in der Mitte des Bauches und legen Sie das Peritoneum frei, wobei Sie darauf achten, die intraabdominalen Organe nicht zu verletzen.Legen Sie vorgeschnittene nasse Baumwollgaze über die freiliegende Intraabdominhöhle. Verwenden Sie nasse Wattestäbchen, um den Blinddarm zu mobilisieren und nach außen zu entfernen, und legen Sie ihn vorsichtig auf nasse Baumwollgaze. Mobilisieren Sie dann das Ileum und äußerlich.Setzen Sie mindestens sechs Zentimeter terminales Ileum auf die nasse Baumwollgaze aus, ohne die Mesenterigefäße und die Blutversorgung zu stören. Halten Sie das exponierte Gewebe jederzeit mit warmem HBSS feucht. Identifizieren Sie die Hauptarterie, die das Ileum im Mesenterium in der Nähe des Blinddarms versorgt.Lokalisieren Sie dann zwei Ligationsstellen im Mesentery, die frei von kritischen Blutgefäßen sind. Greifen Sie das terminale Ileum mit einer stumpfen Gewebezette fest und verwenden Sie eine feine Spitzenzette, um das Mesenterium zu fenestrieren und Blutgefäße zu vermeiden. Legen Sie die Seidennähte über die Perforation und binden Sie einen chirurgischen Knoten, um die erste Ligatur zu erzeugen.Verwenden Sie das Lineal, um vier Zentimeter von der ersten Ligatur entfernt zu messen, und erstellen Sie die zweite Ligatur. Schneiden Sie vorsichtig neben jeder Ligatur mit einer feinen Schere, um die vier Zentimeter große Ilealschleife zu isolieren und die Blutversorgung und die Mesentermembran intakt zu halten. Spülen Sie den Inhalt des Ilealschleifensegments vorsichtig mit warmem HBSS mit einer flexiblen gelben Zuführsonde, die an einer 10-Milliliter-Spritze befestigt ist.Stellen Sie sicher, dass Sie den luminalen Inhalt aus der Bauchhöhle spülen, um die Operationsstelle sauber zu halten. Ligaieren Sie die beiden geschnittenen Enden der gespülten Ilealschlaufe mit Seidennäht. Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 30-Gauge-Nadel, um langsam 250 Mikroliter Reagenz wie FITC-Dextrans oder Chemokin in das Darmlumen zu injizieren.Die Ilealschleife bläst sich auf und verursacht eine moderate Dehnung der Schleimhaut. Schließen Sie die Bauchdecke mit einem Nadelhalter, einer anatomischen Einer zette und 3,0 nicht resorbierbaren Seidennähten mit einer umgekehrten Schneidnadel. Nachdem Sie das Tier getrocknet haben, um eine Hypothermie zu verhindern, legen Sie es für die Inkubationszeit in eine temperaturregulierte Anästhesiekammer.Bereiten Sie die Maus auf die Operation vor und exteriorisieren Sie den Blinddarm, wie zuvor gezeigt. Mit nassen Wattestäbchen das gesamte Ileum außen machen und auf eine nasse Baumwollgaze legen. Identifizieren Sie den proximalen Dickdarm und die Blutversorgung im Mesokolon.Mobilisieren Sie den proximalen Dickdarm und erstellen Sie die erste Ligatur in einem Bereich, der frei von Gefäßen im Mesocolon ist, etwa 0,5 Zentimeter distal vom Blinddarm entfernt. Messen Sie zwei Zentimeter von der ersten Ligatur und erstellen Sie eine zweite Ligatur an einem Bereich, der frei von Blutversorgung im Mesokolon ist. Schneiden Sie mit einer feinen Schere vorsichtig neben jeder Ligatur ab, um eine zwei Zentimeter lange pcLoop zu isolieren.Spülen Sie den pcLoop vorsichtig mit warmem HBSS, um Kot mit einer flexiblen gelben Ernährungssonde zu entfernen, die an einer 10-Milliliter-Spritze befestigt ist. Stellen Sie sicher, dass Sie den luminalen Inhalt aus der Bauchhöhle spülen, um die Operationsstelle sauber zu halten. Dann ligaieren Sie die beiden geschnittenen Enden des gespülten pcLoop mit Seidennäht.Verwenden Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit einer 30-Gauge-Nadel, um langsam 200 Mikroliter Reagenz wie FITC-Dextran oder Chemokin in das Darmlumen zu injizieren. Der pcLoop bläst sich auf, was zu einer moderaten Dehnung der Schleimhaut führt. Verwenden Sie nasse Wattestäbchen, um den ligierten pcLoop, das Ileum und den Blinddarm vorsichtig zurückzulegen.Schließen Sie die Bauchdecke mit einem Nadelhalter, einer anatomischen Einer zette und 3,0 nicht resorbierbaren Seidennähten mit einer umgekehrten Schneidnadel. Nach der Inkubationszeit die anästhesierte Maus einschläfern und Gewebe zur Analyse sammeln. Um die Genauigkeit des I-Schleifenmodells zur Beurteilung der Darmpermeabilität zu überprüfen, wurde ein FITC-Dextran pcLoop-Assay durchgeführt, um die Rolle des Tight Junction-assoziierten Proteins Jam-a bei der Regulation der Darmbarrierefunktion in vivo zu bewerten.Mit dem pcLoop-Modell wurde bei Jam-a-Nullmäusen im Vergleich zu Kontrollpersonen ein 2,5-facher Anstieg der FITC-Dextran-Serumspiegel quantifiziert. Ähnliche Ergebnisse wurden mit Mäusen erzielt, die einen selektiven Verlust von Jam-a auf Darmepithelzellen hatten. Das pcLoop-Modell wurde verwendet, um die Rekrutierung von polymorphonukleären Neutrophilen oder PMN in die Darmschleimhaut und die anschließende transepitheliale Migration in vivo zu untersuchen.Die Anzahl der PMN im Luminalgehalt des pcLoop wurde durch Durchflusszytometrie-Analyse quantifiziert. Die Anzahl der PMN im Segment des proximalen Dickdarms war unter physiologischen Bedingungen gering. Die Vorbehandlung mit entzündungsfördernden Zytokinen, TNF alpha und IFN gamma vor der Operation führte zu einer erhöhten Anzahl von PMN, die im pcLoop-Lumen rekrutiert wurden.Die Verabreichung des PMN-Chemolockstoffs LTB4 führte zu einem dramatischen Anstieg der PMN-Zahlen. Immunhistochemische Färbung von PMN in der Dickdarmschleimhaut bestätigt die erhöhte Rekrutierung von PMN nach Stimulation mit Zytokinen und LTB4. Der Beitrag von Jam-a zur transepithelialen PMN-Migration wurde mit dem pcLoop-Modell an Mäusen untersucht, die einen selektiven Verlust von Jam-a auf Darmepithelzellen beherbergen.Der Verlust von epithelialer Jam-a führte zu einer reduzierten Anzahl von transmigriertem PMN im Dickdarmlumen im Vergleich zu Littermatkontrollen. Ein kritischer Aspekt für diese Technik ist es, bei der Durchführung der Operation daran zu denken, die Blutversorgung des exteriorisierten Darmsegments auf zu erhalten. Nach diesem Protokoll können andere Methoden wie ein Darmpermeabilitätstest und ein neutrophiler transepithelialer Migrationstest durchgeführt werden, um den Verlust der Barriereintegrität und die Darmentzündung in vivo zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

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Die Anwendung eines Maus Ligierte Peyer-Patch-Darmschlinge Assay zu bakterielle Aufnahme von M-Zellen auswerten

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Forschung

Immunologie und Infektion

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

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Enteric bakterielle Invasion von intestinalen Epithelzellen<em&gt; In Vitro</em&gt; Ist erheblich verstärkt unter Verwendung eines vertikalen Diffusion Chamber Modell

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

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