Name: functional assessment of intestinal permeability and neutrophil transepithelial migration in mice using a standardized intestinal loop model
Uploaded: 2021-02-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model at JoVE.com

המחברים מודים לד"ר סוון פלמינג מאוניברסיטת וירצבורג על תרומתו להקמת מודל לולאת המעי הגס הפרוקסימלי, שון ווטסון על ניהול מושבות העכברים וצ'ית'רה ק. מוראלדהרן על שעזרו ברכישת התמונות של מודל iLoop. עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הגרמנית /DFG (BO 5776/2-1) ל- KB, R01DK079392, R01DK072564 ו- R01DK061379 ל- C.A.P.

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות ולמדיניות של המכונים הלאומיים לבריאות ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת מישיגן.
1. הכנה טרום הניתוחית
הערה: שיטה זו נוצרה באמצעות עכברים בוגרים מרקע גנטי C57BL/6, בגילאי 8 - 12 שבועות. כל העכברים הו...

המנגנונים האחראים על dysregulation של תפקוד מחסום המעי וגיוס תאי מערכת החיסון בתנאים פתולוגיים כגון IBD אינם מובנים לחלוטין. כאן, אנו מפרטים מודל חזק ב vivo murine אשר מעסיק קטע מעיים חיצוני היטב של ileum או המעי הגס הפרוקסימלי ומאפשר הערכה של חדירה במעיים, מחקרי הגירה נויטרופילים, כמו גם יישומים אחרים....

רירית המעי מקיפה שכבה אחת של תאי אפיתל מעיים טוריים (IECs), תאי מערכת החיסון הבסיסיים של למינה פרופריה וריריות השרירים. מלבד תפקידו בספיגת חומרים מזינים, אפיתל המעי הוא מחסום פיזי המגן על פנים הגוף מפני חיידקים קומנסליים זוהרים, פתוגנים ואנטיגנים תזונתיים. בנוסף, IECs ותאי חיסון lamina propria לתאם את התגובה החיסונית גרימת סובלנות או תגובה בהתאם להקשר וגירויים. דווח כי ההפרעה של מחסום האפיתל יכולה להקדים את תחילת דלקת רירית פתולוגית ולתרום למחלות מעי דלקתיות (IBD) המקיפה הן קוליטיס כיבית והן מחלת קרוהן1,2,3,4,5,6,7. אנשים עם קוליטיס כיבית מציגים הגירה טרנס-אפיתלאלית מוגזמת (TEpM) של נויטרופילים פולימורפונוקלאריים (PMN) היוצרים מורסות קריפטה, ממצא שנקשר לחומרת המחלה8,9. למרות תפקוד מחסום אפיתל נפגע ותגובות חיסוניות מוגזמות הם סימני היכר של IBD, יש חוסר ניסיוני בדיקות vivo לבצע הערכות כמותיות של חדורות מעיים וגיוס תאי החיסון לתוך רירית המעי.
השיטות הנפוצות ביותר המשמשות לחקר חדירות אפיתל מעיים ו- PMN TEpM משתמשות בגישות מבוססות תא ex vivo באמצעות monolayers של חברת החשמל המתרבתים על קרום נקבובי חדיר למחצה מוסיף10,11,12. שלמות מחסום האפיתל מנוטרת על ידי מדידות של התנגדות חשמלית טרנס-אפיתלית (TEER) או השטף הפאראלי של האיזוטיווציאנאט פלואורסצין (FITC) המסומן על ידי דקסטרן מתא apical לסל13,14,15. באופן דומה, PMN TEpM נחקר בדרך כלל בתגובה כימותרפיה כי הוא הוסיף בתא התחתון16. PMN ממוקמים בתא העליון ולאחר תקופת דגירה, PMN כי היגרו לתוך התא בזאלי נאספים וכימות. בעוד שיטות אלה שימושיות, קלות לביצוע ומאוד ניתנות לשחזור, הן ללא ספק גישות רדוקציוניסטיות ואינן מייצגות בהכרח השתקפות מדויקת של תנאי vivo.
בעכברים, בדיקה נפוצה לחקר חמידות פראלית במעיים היא על ידי gavage אוראלי של FITC-dextran ומדידה לאחר מכן של FITC-dextran מראה בסרום הדם13,17. החיסרון של בדיקת זה הוא שזה מייצג הערכה של שלמות המחסום הכוללת של מערכת העיכול ולא של תרומות מעיים אזוריות. בנוסף, כחול אוונס משמש בדרך כלל להערכת דליפת כלי דם ב vivo18 וגם הועסק כדי להעריך חמלות רירית מעיים בעכבר וחולדה19,20,21. הכימות של כחול אוונס ברירית המעי דורש מיצוי מרקמות המעסיקות דגירה בפורמאמיד בן לילה. לכן, אותה רקמה לא יכולה לשמש לחקר חדירות אפיתל מעיים וחדירת נויטרופילים.
כאן אנו מדגישים פרוטוקול פשוט המפחית את מספר בעלי החיים הדרושים לאיסוף נתונים לשחזור על חלחוביות הרירית המעי הגס ונדידת לויקוציטים טרנספיטהל ב vivo. אנו, אם כן, ממליצים על השימוש FITC-dextrans כי ניתן לזהות בקלות בסרום דם מבלי להתפשר על שלמות לולאות מעיים אשר ניתן לקצור לניתוח נוסף. ראוי לציין, לולאות קשירה מעיים שימשו במינים שונים (כולל עכבר, חולדה, ארנב, עגל) כדי לחקור זיהום חיידקי (כגון סלמונלה, ליסטריה monocytogenes ו Escherichia coli)22,23,24,25, כמו גם חמיצות מעיים26; עם זאת, למיטב ידיעתנו אין מחקרים החוקרים מנגנונים של PMN TEpM באזורים ספציפיים במעי כגון ileum או המעי הגס המעורבים בדרך כלל IBD.
כאן אנו מתארים את מודל לולאת מעי העכבר (iLoop) שהוא שיטת vivo מיקרוכירורגית חזקה ואמינה המעסיקה מקטע מעיים בעל כלי דם וחיצוניים של האיליום או המעי הגס הפרוקסימלי. מודל iLoop רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ומאפשר הערכה של שלמות מחסום המעי ו- PMN TEpM על עכברים חיים תחת הרדמה. אנו מדגימים שני יישומים: 1) כימות של רמות סרום של 4 kDa FITC-dextran לאחר ניהול תוך-אלומינאלי ב- iLoop 2) כימות של PMN transmigrated ב- iLoop לומן לאחר הזרקה תוך-אלומינלית של chemottractant Leukotriene B4 (LTB4)27. יתר על כן, ניצול מודל iLoop עם עכברים או עכברים או עכברים אועכברים המכילים אובדן סלקטיבי של JAM-A על IECs (Villin-cre; Jam-a fl/fl) בהשוואה לעכברי בקרה, אנו מסוגלים לאמת מחקרים קודמים שדיווחו על תרומה משמעותית לחלבון צמוד הקשור לצומת JAM-A לחלחיליות במעיים ולהעברת נויטרופילים15,28,29,30,31.
מודל iLoop הוא שיטה פונקציונלית ופיזיולוגית מאוד שניתן להשתמש בה כדי לאשש במבחנות. יתר על כן, זהו מודל ניסיוני רב-תכליתי המאפשר לחקור ריאגנטים שונים שניתן להזריק ללומן הלולאה, כולל כימותרפיה, ציטוקינים, פתוגנים חיידקיים, רעלנים, נוגדנים וטיפולים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment and Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Alcohol Swabs</td>
			<td>BD</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8&#34;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2&#34;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>07-200-592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Non-treated Culture Dish, 10cm</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6&#34;, sterile</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>25806 2WC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2&#34; x 2&#34;</td>
			<td>Medex</td>
			<td>3249-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units)</td>
			<td>E-Z Systems</td>
			<td>EZ-7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tube 50ml&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Colored Labeling Tape</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey Needle Holder (needle holder)&#160;</td>
			<td>FST</td>
			<td>12001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes, small (tissue wipe)</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7ml Microcentrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Thomas Scientific&#160;</td>
			<td>c2170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube)</td>
			<td>Sarstedt&#160;</td>
			<td>41.1501.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14370-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 &#181;m nylon mesh)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>12920060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps (blunt tissue forceps)</td>
			<td>FST</td>
			<td>11103-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>NC9452680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken Forceps (anatomical forceps)</td>
			<td>FST</td>
			<td>1108-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18&#34;, Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting&#160;</td>
			<td>HenrySchein</td>
			<td>SS694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Fine Forceps, Angled</td>
			<td>FST</td>
			<td>91110-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ml Syringe PP/PE without needle</td>
			<td>Millipore Sigma&#160;</td>
			<td>Z248029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm</td>
			<td>Instech</td>
			<td>FTP-20-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions and Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accugene 0.5M EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer</td>
			<td>BioWhittaker</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-023-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>127610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-0112-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotreitol</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, heat inactivated</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>511550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60842-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Halocarbon</td>
			<td>12164-002-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukotriene B4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71160-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>557235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IFN-&#947;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine TNF-&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional assessment of intestinal permeability and neutrophil transepithelial migration in mice using a standardized intestinal loop model

רירית המעי מרופד בשכבה אחת של תאי אפיתל היוצרת מחסום דינמי המאפשר הובלה paracellular של חומרים מזינים ומים תוך מניעת מעבר של חיידקים זוהרים וחומרים אקסוגניים. הפרה של שכבה זו גורמת לחמיצות מוגברת לתכולה זוהרת וגיוס של תאי מערכת החיסון, שניהם סימני היכר של מצבים פתולוגיים במעיים כולל מחלות מעי דלקתיות (IBD). 
מנגנונים המסדירים את תפקוד מחסום האפיתל ואת ההגירה הטרנס-אפיתלית (TEpM) של נויטרופילים פולימורפונוקלאריים (PMN) אינם מובנים לחלוטין בשל היעדר שיטות ניסיוניות ב- vivo המאפשרות ניתוחים כמותיים. כאן, אנו מתארים מודל ניסיוני מורין חזק המעסיק קטע מעיים חיצוני של ileum או המעי הגס הפרוקסימלי. לולאת המעי החיצונית (iLoop) היא בעלת כלי דם מלאים ומציעה יתרונות פיזיולוגיים על פני גישות מבוססות תא ex vivo המשמשות בדרך כלל לחקר חלחנות ונדידת PMN על פני מונולי תאים אפיתל.
אנו מדגימים שני יישומים של מודל זה בפירוט: (1) מדידה כמותית של חמיטות מעיים באמצעות זיהוי של dextrans תווית פלואורסצנטיות בסרום לאחר הזרקה תוך אלומינלית, (2) הערכה כמותית של PMN נודד על פני אפיתל המעי לתוך לומן המעיים לאחר הקדמה תוך-אלומינלית של כימותרפיה. אנו מדגימים היתכנות של מודל זה ומספקים תוצאות המשתמשות ב- iLoop בעכברים חסר חלבון הקשור לאפיתל הדוק צומת JAM-A בהשוואה לבקרות. JAM-A הוכח לווסת את תפקוד מחסום האפיתל, כמו גם PMN TEpM במהלך תגובות דלקתיות. התוצאות שלנו באמצעות iLoop לאשר מחקרים קודמים ולהדגיש את החשיבות של JAM-A בוויסות של חדירות מעיים PMN TEpM ב vivo במהלך הומאוסטזיס ומחלות. 
מודל iLoop מספק שיטה סטנדרטית מאוד לשחזור במחקרי vivo של הומאוסטזיס מעיים ודלקת וישפר באופן משמעותי את ההבנה של תפקוד מחסום המעי ודלקת ריריים במחלות כגון IBD.

ייצוג סכמטי של דגמי לולאת ileal ו- pcLoop מתואר באיור 1 ובאיור 2, בהתאמה. התמונות האנטומיות מציגות את השלבים הקריטיים של ההליך, כולל חשיש של מקטע המעי (איור 1B ואיור 2B),זיהוי מיקום מתאים לקשירות המאפשר הפרעה מינימלית באספקת ...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model at JoVE.com

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

תפקוד מחסום אפיתל מעיים Dysregulated ותגובות חיסוניות הם סימני היכר של מחלות מעי דלקתיות שנותרו נחקרות בצורה גרועה בשל מחסור במודלים פיזיולוגיים. כאן, אנו מתארים מודל לולאת מעיים של עכברים המעסיק מקטע מעיים בעל כלי דם וחיצוניים כדי לחקור חלחיליות רירית וגיוס לויקוציטים ב- vivo.

הערכה תפקודית של חלחיליות מעיים ונדידה טרנס-אפיתלית נויטרופילית בעכברים באמצעות מודל לולאת מעיים מתוקננת

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...

מודל המעיים הוא דרך מסתגלת ופיזיולוגית נרחבת למדוד עד כמה דולף המעיים וכיצד לויקוציטים נודדים במעי בעכברים, ב- vivo. שיטה זו מסייעת להבין טוב יותר מנגנונים שבבסיס חלחול מעיים מוגבר ודלקת מעיים פתולוגית. ניתן להשתמש בטכניקה כדי לסייע במנגנוני ההבנה שלנו שבבית תפקוד מחסום המעיים, ודלקת פתולוגית, כפי שניתן לראות קוליטיס כיבית ומחלת קרוהן.מודל זה משתמש במגזר מעיים חיצוני בעל כלי דם, או של האיליום או המעי הגס הפרוקסימלי, לבדיקת תפקוד מחסום המעי או גיוס תאי החיסון בעכבר. עם יישום רחב זה, מודל לולאת המעי יכול לספק תובנה במחלות הנובעות ממחסום מעיים דולף, כמו גם את התגובה הדלקתית. מאבקים ניתן להתגבר על ידי תרגול הצעדים הכירורגיים.חשוב מאוד להפוך את מקטע המעי בעל כלי הדם במלואם ולבחור מיקומים מתאימים עבור הקשירות כדי למנוע דימום. מודל לולאת המעיים הוא טכניקה מיקרו-כירורגית, ולכן, כמו עם הליכים כירורגיים אחרים, הוא נהנה מאוד מהדגמה חזותית והצגה צעד אחר צעד של השיטה. לאחר השגת מישור כירורגי של הרדמה, להתחיל על ידי קרצוף הפרווה של קו האמצע הבטן עם ספוגיות אלכוהול או ספוג גזה ספוג עם 70%אתנול.אין להרטיב אזור רחב של פרווה עם אלכוהול כדי למנוע היפותרמיה. באמצעות מספריים, לבצע לפרוסטומיה בקו האמצע. לעשות חתיכה אופקית באמצע הבטן, ולחשוף את צפק, דואג לא לפגוע באיברים תוך בטן.מניחים גזת כותנה רטובה חתוכות מראש על חלל הבטן החשוף. השתמש צמר גפן רטוב כדי לגייס חיצוני cecum ולהניח אותו בזהירות על גזה כותנה רטובה. לאחר מכן, גייסו וחצנו בעדינות את האיליום.לפרוס לפחות שישה סנטימטרים של איליאום סופני על גזת כותנה רטובה מבלי לשבש את כלי mesenteric ואת אספקת הדם. שמור על הרקמות החשופות לחות בכל עת עם HBSS חם. זהה את העורק הראשי המספק את האיליום במזנטריה, קרוב ל cecum.לאחר מכן, אתר שני אתרי קשירה במזנטריה נטולי כלי דם קריטיים. תפס בחוזקה את ileum מסוף עם מלקחיים רקמה קהה ולהשתמש מלקחיים קצה עדין כדי להדוף את mesentery, הימנעות מכלי הדם. מניחים תספורת משי על פני הניחור, וקושרים קשר כירורגי כדי ליצור את הקשירה הראשונה.השתמש בסרגל כדי למדוד ארבעה סנטימטרים מהקשירה הראשונה, וליצור את הקשירה השנייה. חותכים בזהירות ליד כל קשירה עם מספריים עדינים כדי לבודד את לולאת ileal ארבעה סנטימטרים, שמירה על אספקת הדם ואת הממברנה mesenteric ללא פגע. שטף בעדינות את התוכן של קטע לולאת ileal עם HBSS חם באמצעות צינור הזנה צהוב גמיש המחובר מזרק 10 מיליליטר.הקפד לשטוף את התוכן הזוהר מתוך חלל הבטן כדי לשמור על האתר הכירורגי נקי. ליגט את שני קצות החתכים של לולאת האילול הסמוקה עם תפר משי. השתמש מזרק מיליליטר אחד עם מחט 30 מד לאט להזריק 250 microliters של ריאגנט, כגון FITC-dextrans או chemokine, לתוך לומן המעי.לולאת האילול תתנפח, ותגרום להתנפחות מתונה של הרירית. סגור את דופן הבטן באמצעות מחזיק מחט, מלקחיים אנטומיים, 3.0 תפרי משי שאינם נספגים עם מחט חיתוך הפוכה. לאחר ייבוש החיה כדי למנוע היפותרמיה, למקם אותו בתא הרדמה מוסדר טמפרטורה לתקופת הדגירה.הכן את העכבר לניתוח וחוץ את cecum כפי שהוכח בעבר. בעזרת צמר גפן רטוב, יש להפוך את האילול כולו לחוץ ומניחים אותו על גבי גזת כותנה רטובה. זהה את המעי הגס הפרוקסימלי ואת אספקת הדם הממוקמת במזוקולון.גייסו את המעי הגס הפרוקסימלי ויצרו את הקשירה הראשונה באזור נטול כלי שיט במזוקולון בגובה של כ-0.5 ס"מ מהקקום. למדוד שני סנטימטרים מן הקשירה הראשונה וליצור קשירה שנייה באזור ללא אספקת דם ב mesocolon. באמצעות מספריים עדינים, לחתוך בזהירות ליד כל קשירה כדי לבודד pcLoop באורך שני ס"מ.יש לשטוף בעדינות את ה-pcLoop עם HBSS חם כדי להסיר צואה באמצעות צינור האכלה צהוב גמיש המחובר למזרק 10 מיליליטר. הקפד לשטוף את התוכן הזוהר מתוך חלל הבטן כדי לשמור על האתר הכירורגי נקי. לאחר מכן, ליט את שני הקצוות החתוכים של pcLoop הסמוק באמצעות תפר משי.השתמש מזרק מיליליטר אחד עם מחט 30 מד לאט להזריק 200 microliters של ריאגנט, כגון FITC-dextran או chemokine, לתוך לומן המעי. pcLoop יהיה לנפח, גרימת התנערות מתונה של הרירית. השתמשו בצמר גפן רטוב כדי להחזיר בעדינות את המחשב, האילולי והצט'ם.סגור את דופן הבטן באמצעות מחזיק מחט, מלקחיים אנטומיים, 3.0 תפרי משי שאינם נספגים עם מחט חיתוך הפוכה. לאחר תקופת הדגירה, להרדים את העכבר מורדם ולאסוף רקמות לניתוח. על מנת לאמת את הדיוק של מודל לולאת I להערכת חלחיליות מעיים, FITC-dextran pcLoop assay בוצע כדי להעריך את התפקיד של צומת הדוק הקשור חלבון Jam-a ברגולציה של תפקוד מחסום מעיים ב vivo.עם דגם pcLoop, עלייה של פי 2.5 ברמות סרום FITC-dextran כותמה בעכברים ריקים בהשוואה לבקרות. תוצאות דומות התקבלו עם עכברים מחסה אובדן סלקטיבי של Jam-a על תאי אפיתל מעיים. מודל pcLoop שימש לחקר נויטרופיל פולימורפונוקלארי, או PMN, גיוס לתוך רירית המעיים ונדידה טרנס-אפיתלית לאחר מכן ב vivo.מספר PMN בתוכן הזוהר של pcLoop היה לכמת על ידי ניתוח ציטומטריית זרימה. מספר PMN הנוכחי בקטע של המעי הגס הפרוקסימלי היה נמוך בתנאים פיזיולוגיים. טיפול מקדים עם ציטוקינים פרו דלקתיים, TNF אלפא ו- IFN גמא, לפני הניתוח, הביא למספרים מוגברים של PMN שגויסו ב- pcLoop lumen.ניהול הכימותרפיה PMN מושך LTB4 הוביל לעלייה דרמטית בספירת PMN. כתמים אימונוהיסטוכימיים של PMN ברירית המעי הגס מאששים את הגיוס הגבוה של PMN בעקבות גירוי עם ציטוקינים ו- LTB4. התרומה של Jam-a לנדידה טרנס-אפיתלית PMN נחקרה באמצעות מודל pcLoop על עכברים מחסה אובדן סלקטיבי של Jam-a על תאי אפיתל מעיים.אובדן ג'אם-a אפיתל הוביל למספר מופחת של PMN transmiged בלומן המעי הגס לעומת פקדי המלטה. היבט קריטי עבור טכניקה זו היא לזכור לשמר את אספקת הדם למקטע המעי החיצוני בעת ביצוע הניתוח. בעקבות פרוטוקול זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כגון בדיקת חלחלות מעיים ובבדי הגירה טרנס-אפיתל נויטרופילי כדי לחקור אובדן שלמות המחסום ודלקת מעיים ב vivo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

יישום של עכבר Ligated מעיים תיקון של Peyer Assay Loop להערכת ספיגת חיידקים על ידי תאים M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

פלישת חיידקי enteric של תאי אפיתל במעי<em&gt; במבחנה</em&gt; באופן דרמטי משופר תוך שימוש במודל לשכת דיפוזיה אנכי

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

במבחנה Coculture Assay כדי להעריך פתוגן המושרה נדידת נויטרופילים טרנס אפיתל

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

הערכה כמותית של אדם נויטרופילים הגירה מעבר מתורבת שלפוחית ​​השתן האפיתל

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

הדמיה של Dynamics התאים מיאלואידית בזמן אמת<em&gt; Apc<sup&gt; מינימום / +</sup</em&gt; מעיים גידולים על ידי דיסק מסתובב Confocal מיקרוסקופית

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

לימפה Duct cannulated עכברוש דגם mesenteric: בקשה להערכה של המעיים הלימפה תרופות תחבורה

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

אינדוקציה של Murine דלקת מעיים על ידי העברת המאמצת של מפעיל CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; גבוה</sup&gt; תאי T לעכברי immunodeficient

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

ניתוח Immunofluorescence של גרגר מתח גיבוש לאחר האתגר בקטריאלי של תאים יונקים

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

אינדוקציה של מעיים שתל – מול – מארח מחלות והערכה מיני-אנדוסקופית שלה בעכברים בשידור חי

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Monolayers Colonoid האדם ללמוד אינטראקציות בין גורמי מחלה, Commensals אפיתל המעי מארח

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...