Name: functional assessment of intestinal permeability and neutrophil transepithelial migration in mice using a standardized intestinal loop model
Uploaded: 2021-02-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model at JoVE.com

Los autores agradecen al Dr. Sven Flemming de la Universidad de Wuerzburg por sus contribuciones al establecimiento del modelo de bucle de colon proximal, a Sean Watson por el manejo de las colonias de ratones y a Chithra K. Muraleedharan por ayudar con la adquisición de las imágenes del modelo iLoop. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Alemana de Investigación/DFG (BO 5776/2-1) a KB, R01DK079392, R01DK072564, y R01DK061379 a C.A.P.

Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y políticas de los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Michigan.
1. Preparación preoperatoria
NOTA: Este método se generó empleando ratones adultos de fondo genético C57BL/6, de 8 a 12 semanas de edad. Todos los ratones fueron mantenidos bajo condiciones libres específicas estrictas del...

Los mecanismos responsables del dysregulation de la función intestinal de la barrera y del reclutamiento de la célula inmune bajo condiciones patológicas tales como IBD se entienden incompleto. Aquí, detallamos un modelo murino in vivo robusto que emplea un segmento intestinal exteriorizado bien vascularizado de íleon o colon proximal y permite la evaluación de la permeabilidad intestinal, estudios de migración de neutrófilos, así como otras aplicaciones.
El iLoop es una cirugía de n...

La mucosa intestinal abarca una sola capa de células epiteliales intestinales columnares (IECs), las células inmunes subyacentes del propria de la lámina y las mucosas de los muscularis. Además de su papel en la absorción de nutrientes, el epitelio intestinal es una barrera física que protege el interior del cuerpo de las bacterias comensales luminales, patógenos y antígenos dietéticos. Además, los IECs y las células inmunes de la lámina propia coordinan la inmunorespuesta que induce tolerancia o respuesta dependiendo del contexto y de los estímulos. Se ha divulgado que la interrupción de la barrera epitelial puede preceder el inicio de la inflamación de la mucosa patológica y contribuir a la enfermedad de intestino inflamatoria (IBD) que abarca colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn1,2,3,4,5,6,7. Los individuos con colitis ulcerosa presentan migración transepitelial excesiva (TEpM) de neutrófilos polimorfonucleares (PMN) formando abscesos de cripta, hallazgo que se ha asociado con la gravedad de la enfermedad8,9. Aunque la función epitelial comprometida de la barrera y las inmunorespuestas excesivas sean sellos de IBD, hay una carencia de análisis in vivo experimentales para realizar evaluaciones cuantitativas de la permeabilidad intestinal y del reclutamiento de la célula inmune en la mucosa intestinal.
Los métodos más comunes utilizados para estudiar la permeabilidad epitelial intestinal y PMN TEpM emplean enfoques basados en cámaras ex vivo utilizando monocapas IEC cultivadas en insertos de membrana porosa semipermeables10,11,12. La integridad de la barrera epitelial es supervisada por mediciones de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) o el flujo paracelular del isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano marcado desde el compartimento apical al basal13,14,15. Del mismo modo, pmn TEpM se estudia típicamente en respuesta a un quimioatrayente que se añade en la cámara baja16. Los PMN se colocan en la cámara superior y después de un período de incubación, los PMN que han migrado al compartimento basal se recogen y cuantifican. Si bien estos métodos son útiles, fáciles de realizar y muy reproducibles, son obviamente enfoques reduccionistas y no necesariamente representan un reflejo preciso de las condiciones in vivo.
En ratones, un ensayo común para estudiar la permeabilidad paracelular intestinal es por sonda oral de FITC-dextrano y posterior medición de la aparición de FITC-dextrano en el suero sanguíneo13,17. La desventaja de este análisis es que representa una evaluación de la integridad total de la barrera del aparato gastrointestinal bastante que la de contribuciones intestinales regionales. Además, el azul de Evans se utiliza comúnmente para evaluar la fuga vascular in vivo18 y también se ha empleado para evaluar la permeabilidad de la mucosa intestinal en ratones y ratas19,20,21. La cuantificación del azul de Evans en la mucosa intestinal requiere la extracción del tejido que emplea la incubación en formamida durante la noche. Por lo tanto, el mismo tejido no se puede utilizar para estudiar la permeabilidad epitelial intestinal y la infiltración de neutrófilos.
Aquí destacamos un protocolo simple que reduce el número de animales necesarios para recoger datos reproducibles sobre la permeabilidad de la mucosa colónica y la migración transepitelial leucocito in vivo. Por lo tanto, recomendamos el uso de FITC-dextrans que son fácilmente perceptibles en suero sanguíneo sin comprometer la integridad de los lazos intestinales que se pueden cosechar para el análisis adicional. Cabe destacar que los bucles ligados intestinales se han utilizado en varias especies (incluyendo ratón, rata, conejo, ternero) para estudiar la infección bacteriana (como Salmonella, Listeria monocytogenes y Escherichia coli)22,23,24,25, así como la permeabilidad intestinal26; sin embargo, al mejor de nuestro conocimiento no hay estudios que investigan mecanismos de PMN TEpM en regiones específicas en el intestino tal como íleo o dos puntos que están implicados comúnmente en IBD.
Aquí describimos el modelo del lazo intestinal del ratón (iLoop) que es un método in vivo microquirúrgico robusto y confiable que emplea un segmento intestinal bien-vascularizado y exteriorizado del íleon o de los dos puntos próximos. El modelo iLoop es fisiológicamente relevante y permite la evaluación de la integridad de la barrera intestinal y pmn TEpM en ratones vivos bajo anestesia. Demostramos dos aplicaciones: 1) cuantificación de los niveles séricos de 4 kDa FITC-dextrano después de la administración intraluminal en el iLoop 2) cuantificación de PMN transmigrado en el lumen iLoop después de la inyección intraluminal del potente quimiotractor Leucotrieno B4 (LTB4)27. Por otra parte, la utilización del modelo iLoop con Jam-a-null ratones o ratones que albergan la pérdida selectiva de JAM-A en IECs (Villin-cre; Jam-a fl/fl)en comparación con los ratones control, podemos corroborar estudios previos que han reportado una importante contribución de la proteína jam-A asociada a la unión apretada a la permeabilidad intestinal y la transmigración de neutrófilos15,28,29,30,31.
El modelo iLoop es un método altamente funcional y fisiológico que se puede utilizar para corroborar ensayos in vitro. Además, se trata de un modelo experimental versátil que permite el estudio de diversos reactivos que se pueden inyectar en la luz del asa, incluyendo quimiocinas, citoquinas, patógenos bacterianos, toxinas, anticuerpos y terapéuticas.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment and Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Alcohol Swabs</td>
			<td>BD</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8&#34;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2&#34;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>07-200-592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Non-treated Culture Dish, 10cm</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6&#34;, sterile</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>25806 2WC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2&#34; x 2&#34;</td>
			<td>Medex</td>
			<td>3249-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units)</td>
			<td>E-Z Systems</td>
			<td>EZ-7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tube 50ml&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Colored Labeling Tape</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey Needle Holder (needle holder)&#160;</td>
			<td>FST</td>
			<td>12001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes, small (tissue wipe)</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7ml Microcentrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Thomas Scientific&#160;</td>
			<td>c2170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube)</td>
			<td>Sarstedt&#160;</td>
			<td>41.1501.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14370-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 &#181;m nylon mesh)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>12920060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps (blunt tissue forceps)</td>
			<td>FST</td>
			<td>11103-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>NC9452680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken Forceps (anatomical forceps)</td>
			<td>FST</td>
			<td>1108-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18&#34;, Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting&#160;</td>
			<td>HenrySchein</td>
			<td>SS694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Fine Forceps, Angled</td>
			<td>FST</td>
			<td>91110-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ml Syringe PP/PE without needle</td>
			<td>Millipore Sigma&#160;</td>
			<td>Z248029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm</td>
			<td>Instech</td>
			<td>FTP-20-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions and Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accugene 0.5M EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer</td>
			<td>BioWhittaker</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-023-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>127610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-0112-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotreitol</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, heat inactivated</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>511550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60842-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Halocarbon</td>
			<td>12164-002-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukotriene B4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71160-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>557235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IFN-&#947;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine TNF-&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional assessment of intestinal permeability and neutrophil transepithelial migration in mice using a standardized intestinal loop model

La mucosa intestinal está revesteada por una sola capa de células epiteliales que forma una barrera dinámica que permite el transporte paracelular de nutrientes y agua al tiempo que impide el paso de bacterias luminales y sustancias exógenas. Una brecha de esta capa da lugar a permeabilidad creciente al contenido luminal y al reclutamiento de células inmunes, que son sellos de estados patológicos en la tripa incluyendo la enfermedad de intestino inflamatoria (IBD). 
Los mecanismos que regulan la función epitelial de la barrera y la migración transepitelial (TEpM) de los neutrófilos polimorfonucleares (PMN) se entienden incompleto debido a la carencia de métodos in vivo experimentales que permiten análisis cuantitativos. Aquí, describimos un modelo experimental murino robusto que emplea un segmento intestinal exteriorizado del íleon o de los dos puntos próximos. El asa intestinal exteriorizado (iLoop) está completamente vascularizado y ofrece ventajas fisiológicas sobre los enfoques basados en cámaras ex vivo comúnmente utilizados para estudiar la permeabilidad y la migración de PMN a través de monocapas de células epiteliales.
Demostramos dos usos de este modelo detalladamente: (1) medida cuantitativa de la permeabilidad intestinal con la detección de dextrans fluorescencia-etiquetado en suero después de la inyección intramural, (2) evaluación cuantitativa de PMN emigrado a través del epitelio intestinal en el lumen de la tripa después de la introducción intramural de quimioatrayentes. Se demuestra la viabilidad de este modelo y proporcionar resultados utilizando el iLoop en ratones que carecen de la proteína epitelial asociada a la unión apretada JAM-A en comparación con los controles. JAM-A se ha mostrado para regular la función epitelial de la barrera así como PMN TEpM durante respuestas inflamatorias. Nuestros resultados utilizando el iLoop confirman estudios previos y destacan la importancia de JAM-A en la regulación de la permeabilidad intestinal y pmn TEpM in vivo durante la homeostasis y la enfermedad. 
El modelo iLoop proporciona un método altamente estandarizado para estudios reproducibles in vivo de la homeostasis intestinal y la inflamación y mejorará significativamente la comprensión de la función de barrera intestinal y la inflamación de la mucosa en enfermedades como la EII.

Una representación esquemática de los modelos de bucle ilérico y pcLoop se representa en la Figura 1 y la Figura 2,respectivamente. Las imágenes anatómicas muestran los pasos críticos del procedimiento incluyendo la exteriorización del segmento intestinal (Figura 1B y Figura 2B), la identificación de una ubicación adecuada para las ligaduras que permita una mínima perturbació...

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Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

La función epitelial intestinal desregulada de la barrera y las inmunorespuestas son sellos de la enfermedad de intestino inflamatoria que siguen siendo investigados mal debido a una carencia de modelos fisiológicos. Aquí, se describe un modelo de asa intestinal de ratón que emplea un segmento intestinal bien vascularizado y exteriorizado para estudiar la permeabilidad de la mucosa y el reclutamiento de leucocitos in vivo.

Evaluación Funcional De La Permeabilidad Intestinal Y La Migración Transepitelial Neutrófilo En Ratones Usando Un Modelo De Bucle Intestinal Estandarizado

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...

El modelo intestinal es una forma ampliamente adaptable y fisiológica de medir qué tan permeable es el intestino y cómo los leucocitos migran en el intestino en ratones, in vivo. Este método ayuda a comprender mejor los mecanismos subyacentes al aumento de la permeabilidad intestinal y la inflamación intestinal patológica. La técnica se puede emplear para ayudar en nuestros mecanismos de comprensión que son la base de la función de la barrera de la tripa, y la inflamación patológica, según lo considerado en colitis ulcerosa y Crohn' enfermedad de s.Este modelo emplea un segmento bien vascularizado, exteriorizado del intestino, del íleon o de los dos puntos próximos, para la examinación de la función intestinal de la barrera o del reclutamiento inmune de la célula en ratón. Con esta amplia aplicación, el modelo de asa intestinal puede proporcionar información sobre las enfermedades resultantes de una barrera intestinal permeable, así como la respuesta inflamatoria. Las luchas se pueden superar practicando los pasos quirúrgicos.Es críticamente importante exteriorizar un segmento intestinal completamente vascularizado y seleccionar las localizaciones apropiadas para que las ligaduras eviten la sangría. El modelo intestinal del asa es una técnica microsurgical, así, como con otros procedimientos quirúrgicos, se beneficia grandemente de la demostración visual y de una presentación paso a paso del método. Después de lograr un plano quirúrgico de anestesia, comience por fregar el pelaje de la línea media abdominal con hisopos de alcohol o una esponja de gasa empapada con etanol al 70%.No moje una amplia área de piel con alcohol para prevenir la hipotermia. Usando tijeras, realice una laparotomía de la línea media. Haga una incisión horizontal en el centro del abdomen y exponga el peritoneo, teniendo cuidado de no lesionar los órganos intraabdominales.Coloque una gasa de algodón húmeda precortado sobre la cavidad intraabdominal expuesta. Use hisopos de algodón húmedos para movilizar y exteriorizar el ciego y colóquelo cuidadosamente en una gasa de algodón húmeda. Luego, movilice y exteriorice suavemente el íleon.Despliegue al menos seis centímetros de íleon terminal en la gasa de algodón húmeda sin interrumpir los vasos mesentéricos y el suministro de sangre. Mantenga los tejidos expuestos húmedos en todo momento con HBSS caliente. Identifique la arteria principal que suministra el íleon en el mesenterio, cerca del ciego.Luego, localice dos sitios de ligadura en el mesenterio que estén libres de vasos sanguíneos críticos. Agarre firmemente el íleon terminal con fórceps de tejido romo y use fórceps de punta fina para fenestrar el mesenterio, evitando los vasos sanguíneos. Coloque la sutura de seda a través de la perforación y ate un nudo quirúrgico para crear la primera ligadura.Utilice la regla para medir cuatro centímetros de distancia de la primera ligadura y crear la segunda ligadura. Corte cuidadosamente junto a cada ligadura con tijeras finas para aislar el asa iléica de cuatro centímetros, manteniendo intacto el suministro de sangre y la membrana mesentérica. Enjuague suavemente el contenido del segmento del asa ilérea con HBSS caliente usando un tubo de alimentación amarillo flexible unido a una jeringuilla del 10 mililitros.Asegúrese de eliminar el contenido luminal de la cavidad abdominal para mantener limpio el sitio quirúrgico. Ligar los dos extremos cortados del lazo iléleo enrojecido con sutura de seda. Use una jeringa de un mililitro con una aguja calibre 30 para inyectar lentamente 250 microlitros de reactivo, como FITC-dextrans o quimioquina, en la luz intestinal.El asa ilél se inflará, causando una distensión moderada de la mucosa. Cierre la pared abdominal con un porta agujas, espérceps anatómicos y 3.0 suturas de seda no absorbibles con una aguja de corte inverso. Después de secar el animal para prevenir la hipotermia, colóquelo en una cámara de anestesia regulada por temperatura durante el período de incubación.Prepare el ratón para la cirugía y exteriorice el ciego como se ha demostrado anteriormente. Usando hisopos de algodón húmedos, exteriorice todo el íleon y colócelo encima de una gasa de algodón húmeda. Identificar el colon proximal y el suministro de sangre localizado en el mesocolon.Movilizar el colon proximal y crear la primera ligadura en un área libre de vasos en el mesocolon a unos 0,5 centímetros distales del ciego. Mida dos centímetros de la primera ligadura y cree una segunda ligadura en un área libre de suministro de sangre en el mesocolon. Usando tijeras finas, corte cuidadosamente al lado de cada ligadura para aislar un pcLoop de dos centímetros de largo.Enjuague suavemente el pcLoop con HBSS caliente para eliminar las heces usando una sonda de alimentación amarilla flexible conectada a una jeringa de 10 mililitros. Asegúrese de eliminar el contenido luminal de la cavidad abdominal para mantener limpio el sitio quirúrgico. Luego, ligar los dos extremos de corte del pcLoop enrojecido usando sutura de seda.Use una jeringa de un mililitro con una aguja calibre 30 para inyectar lentamente 200 microlitros de reactivo, como FITC-dextrano o quimioquina, en la luz intestinal. El pcLoop se inflará, causando una distensión moderada de la mucosa. Use hisopos de algodón húmedos para volver a colocar suavemente el pcLoop, el íleon y el ciego ligados.Cierre la pared abdominal con un porta agujas, espérceps anatómicos y 3.0 suturas de seda no absorbibles con una aguja de corte inverso. Después del período de incubación, eutanasiar el ratón anestesiado y recoger los tejidos para el análisis. Con el fin de verificar la precisión del modelo de bucle I para la evaluación de la permeabilidad intestinal, se realizó un ensayo FITC-dextran pcLoop para evaluar el papel de la proteína asociada a unión estrecha Jam-a en la regulación de la función de barrera intestinal in vivo.Con el modelo del pcLoop, un aumento del doblez 2,5 en niveles del suero del FITC-dextrano fue cuantificado en los ratones nulos del Atasco-a comparados a los controles. Los resultados similares fueron obtenidos con los ratones que abrigaban la pérdida selectiva de Atasco-a en las células epiteliales intestinales. El modelo del pcLoop fue utilizado para estudiar el neutrófilo polimorfonuclear, o PMN, el reclutamiento en la mucosa intestinal y la migración transepithelial subsecuente in vivo.El número de PMN en el contenido luminal del pcLoop fue cuantificado por análisis cytometry de flujo. El número de PMN presente en el segmento de los dos puntos próximos era bajo condiciones fisiológicas. El tratamiento previo con cytokines favorable-inflamatorios, la alfa de TNF y la gamma de IFN, antes de cirugía, dio lugar a números aumentados de PMN reclutados en el lumen del pcLoop.La administración del atrayente LTB4 del chemo de PMN llevó a un aumento dramático en cuentas de PMN. La coloración de Immunohistochemical de PMN en la mucosa colónica corrobora el reclutamiento elevado de PMN después del estímulo con cytokines y LTB4. La contribución de Jam-a la migración transepitelial pmn se estudió utilizando el modelo pcLoop en ratones que albergan la pérdida selectiva de Jam-a en las células epiteliales intestinales.La pérdida de atasco-a epitelial llevó a un número reducido de PMN transmigrated en el lumen colónico comparado a los controles del littermate. Un aspecto crítico para esta técnica es recordar preservar el suministro de sangre al segmento intestinal exteriorizado al realizar la cirugía. Siguiendo este protocolo, otros métodos tales como un análisis intestinal de la permeabilidad y un análisis transepithelial de la migración del neutrófilo se pueden realizar para investigar la pérdida de integridad de barrera y de inflamación intestinal in vivo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

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La aplicación de un ratón ligado Ensayo placas de Peyer asa intestinal para evaluar la absorción por las células bacterianas M

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Investigación

Inmunología e Infección

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

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Entérica invasión bacteriana de las células epiteliales intestinales<em&gt; In Vitro</em&gt; Se ha mejorado considerablemente gracias a un modelo de cámara de difusión vertical

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In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

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In vitro Ensayo de cocultivo para evaluar la migración transepitelial de neutrófilos inducida por patógenos

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

Evaluación cuantitativa de neutrófilo humano migración a través de una vejiga cultivada Epitelio

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