Name: functional assessment of intestinal permeability and neutrophil transepithelial migration in mice using a standardized intestinal loop model
Uploaded: 2021-02-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model at JoVE.com

Yazarlar, proksimal kolon döngüsü modelinin kurulmasına katkılarından dolayı Wuerzburg Üniversitesi'nden Dr. Sven Flemming'e, fare kolonilerinin yönetimi için Sean Watson'a ve iLoop modelinin resimlerinin alınmasına yardımcı olduğu için Chithra K. Muraleedharan'a teşekkür ediyor. Bu çalışma Alman Araştırma Vakfı/DFG (BO 5776/2-1) tarafından KB, R01DK079392, R01DK072564 ve R01DK061379 ila C.A.P.

Tüm hayvan deneyleri Ulusal Sağlık Enstitülerinin yönergelerine ve politikalarına uygun olarak yapılmış ve Michigan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. Ameliyat öncesi hazırlık
NOT: Bu yöntem, 8 -12 haftalık C57BL/6 genetik geçmişinden yetişkin fareler istihdam ederek oluşturulmuştır. Tüm fareler, normal yemek ve suya ad libitum erişimi ile katı spesifik patojensiz koşullar altında tutuld...

IBD gibi patolojik koşullar altında bağırsak bariyeri fonksiyonunun düzensizliği ve immün hücre alımından sorumlu mekanizmalar eksik anlaşılmaktadır. Burada, ileum veya proksimal kolonun iyi damarlı dışlanmış bir bağırsak segmentini kullanan ve bağırsak geçirgenliğinin, nötrofil göç çalışmalarının ve diğer uygulamaların değerlendirilmesine izin veren sağlam bir in vivo murine modelini detaylandırırız.
iLoop, canlı hayvanlara yapılan iyileşmeyen bir ame...

Bağırsak mukozası, tek bir sütunlu bağırsak epitel hücrelerini (IECs), alttaki lamina propria bağışıklık hücrelerini ve kas mukozasını kapsar. Bağırsak epitel, besinlerin emiliminde rolünün yanı sıra, vücut içini ışıksal kommensal bakterilerden, patojenlerden ve diyet antijenlerinden koruyan fiziksel bir bariyerdir. Ek olarak, IEC'ler ve lamina propria immün hücreleri, bağlam ve uyaranlara bağlı olarak tolerans veya yanıt indükleyen immün yanıtı koordine edin. Epitel bariyerinin bozulmasının patolojik mukozal inflamasyonun başlangıcından önce gelebileceği ve hem ülseratif kolit hem de Crohn hastalığı 1 ,2 ,3,4,5,6,7'yi kapsayan enflamatuar bağırsak hastalığına (IBD) katkıda bulunabileceği bildirilmiştir. Ülseratif kolitli bireyler, kript apseleri oluşturan polimorfonuklear nötrofillerin (PMN) aşırı transepithelial göçünü (TEpM) sunar, hastalığın şiddeti ile ilişkili bir bulgu8,9. Her ne kadar tehlikeye atılmış epitel bariyer fonksiyonu ve aşırı immün yanıtlar IBD'nin ayırt edici özellikleri olsa da, bağırsak geçirgenliği ve bağırsak mukozasına bağışıklık hücresi alımının nicel değerlendirmelerini yapmak için deneysel in vivo testlerin eksikliği vardır.
Bağırsak epitel geçirgenliğini ve PMN TEpM'yi incelemek için kullanılan en yaygın yöntemler, yarı geçirgen gözenekli membran ekler10 , 11,12üzerinde kültürlenmiş IEC monolayerlerini kullanarak ex vivo oda bazlı yaklaşımlar kullanmaktadır. Epitel bariyer bütünlüğü, transepithelial elektrik direnci (TEER) ölçümleri veya Floresan izotiyosiyanat (FITC) etiketli dektranın apikal bölme13, 14,15ölçümleri ile izlenir. Benzer şekilde, PMN TEpM genellikle alt oda16'yaeklenen bir kemoattractant'a yanıt olarak çalışılmıştır. PMN üst bölmeye yerleştirilir ve bir kuluçka döneminden sonra bazal bölmeye taşınan PMN toplanır ve ölçülür. Bu yöntemler yararlı, gerçekleştirilmesi kolay ve çok tekrarlanabilir olsa da, açıkça indirgemeci yaklaşımlardır ve mutlaka in vivo koşulların doğru bir yansımasını temsil etmezler.
Farelerde, bağırsak parasellüler geçirgenliğini incelemek için yaygın bir test, FITC-dektran oral gavage ve daha sonra kan serumunda FITC-dektran görünümünün ölçülmesiile 13,17. Bu testin dezavantajı, bölgesel bağırsak katkılarından ziyade gastrointestinal sistemin genel bariyer bütünlüğünün bir değerlendirmesini temsil ediyor olmasıdır. Ek olarak, Evans mavisi yaygın olarak vasküler sızıntıyı değerlendirmek için kullanılır vivo 18 ve ayrıca fare ve sıçan19 , 20,21'dekibağırsak mukozal geçirgenliğini değerlendirmek içinkullanılmıştır. Evans mavisinin bağırsak mukozasında nicelemesi, bir gecede formamid inkübasyon kullanan dokudan ekstraksiyon gerektirir. Bu nedenle, aynı doku bağırsak epitel geçirgenliği ve nötrofil infiltrasyonunu incelemek için kullanılamaz.
Burada, kolon mukozal geçirgenlik ve lökosit transepithelial göç hakkında tekrarlanabilir veri toplamak için gereken hayvan sayısını azaltan basit bir protokolü vurguluyoruz. Bu nedenle, daha fazla analiz için hasat edilebilen bağırsak döngülerinin bütünlüğünden ödün vermeden kan serumunda kolayca tespit edilebilen FITC-dekstrans kullanılmasını öneririz. Not olarak, bağırsak ligli döngüler bakteriyel enfeksiyonu incelemek için çeşitli türlerde (fare, sıçan, tavşan, buzağı dahil) kullanılmıştır (Salmonella, Listeria monocytogenes ve Escherichia coligibi)22,23,24,25 ve bağırsak geçirgenliği26; bununla birlikte, en iyi bilgimize göre, bağırsakta yaygın olarak IBD'de yer alan ileum veya kolon gibi belirli bölgelerde PMN TEpM mekanizmalarını araştıran hiçbir çalışma yoktur.
Burada, ileum veya proksimal kolonun iyi damarlanmış ve dışlanmış bir bağırsak segmentini kullanan sağlam ve güvenilir bir mikrocerrahi in vivo yöntemi olan fare bağırsak döngüsü (iLoop) modelini açıklıyoruz. iLoop modeli fizyolojik olarak ilgilidir ve anestezi altında yaşayan fareler üzerinde bağırsak bariyeri bütünlüğünün ve PMN TEpM'nin değerlendirilmesine izin verir. İki uygulama gösteriyoruz: 1) iLoop 2'de intralüminal uygulamadan sonra 4 kDa FITC-dektran serum seviyelerinin nicelemesi) güçlü kemotottractant Lökotrien B 4 (LTB4 )27'ninintralüminal enjeksiyonundan sonra iLoop lümeninde transmigrated PMN'nin nicelemesi. Ayrıca, iLoop modelini Jam-a-null fareler veya IEC'lerde seçici JAM-A kaybı barındıran farelerle kullanmak (Villin-cre; Jam-a fl/fl) kontrol farelerine kıyasla, sıkı kavşak ilişkili protein JAM-A'nın bağırsak geçirgenliğine ve nötrofil transmijasyonuna15,28 , 29,30,31için büyük bir katkı olduğunu bildiren önceki çalışmaları doğrulayabiliyoruz.
iLoop modeli, in vitro tahlilleri doğrulamak için kullanılabilecek son derece işlevsel ve fizyolojik bir yöntemdir. Ayrıca, bu, kemokinler, sitokinler, bakteriyel patojenler, toksinler, antikorlar ve terapötikler de dahil olmak üzere döngü lümenine enjekte edilebilen çeşitli reaktiflerin incelenmesine izin veren çok yönlü bir deneysel modeldir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment and Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Alcohol Swabs</td>
			<td>BD</td>
			<td>326895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8&#34;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2&#34;</td>
			<td>BD</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15ml Centrifuge Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>07-200-592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Non-treated Culture Dish, 10cm</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>CLS430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6&#34;, sterile</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>25806 2WC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2&#34; x 2&#34;</td>
			<td>Medex</td>
			<td>3249-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units)</td>
			<td>E-Z Systems</td>
			<td>EZ-7000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Centrifuge Tube 50ml&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Colored Labeling Tape</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Halsey Needle Holder (needle holder)&#160;</td>
			<td>FST</td>
			<td>12001-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes, small (tissue wipe)</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>06-666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.7ml Microcentrifuge Tubes&#160;</td>
			<td>Thomas Scientific&#160;</td>
			<td>c2170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube)</td>
			<td>Sarstedt&#160;</td>
			<td>41.1501.105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moria Fine Scissors</td>
			<td>FST</td>
			<td>14370-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 &#181;m nylon mesh)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>12920060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring Forceps (blunt tissue forceps)</td>
			<td>FST</td>
			<td>11103-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>NC9452680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken Forceps (anatomical forceps)</td>
			<td>FST</td>
			<td>1108-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18&#34;, Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting&#160;</td>
			<td>HenrySchein</td>
			<td>SS694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Fine Forceps, Angled</td>
			<td>FST</td>
			<td>91110-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10ml Syringe PP/PE without needle</td>
			<td>Millipore Sigma&#160;</td>
			<td>Z248029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well Cell Culture Plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm</td>
			<td>Instech</td>
			<td>FTP-20-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solutions and Buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accugene 0.5M EDTA</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>51201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer</td>
			<td>BioWhittaker</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-023-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>127610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>12-0112-81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CountBright Absolute Counting Beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C36950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotreitol</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>BP172-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, heat inactivated</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>511550</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>60842-46-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Halocarbon</td>
			<td>12164-002-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leukotriene B4</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>71160-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11)</td>
			<td>BD Pharmingen</td>
			<td>557235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block)</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>553142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine IFN-&#947;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Murine TNF-&#945;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-01A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional assessment of intestinal permeability and neutrophil transepithelial migration in mice using a standardized intestinal loop model

Bağırsak mukozası, luminal bakterilerin ve eksojen maddelerin geçişini önlerken besinlerin ve suyun paraselüller taşınmasına izin veren dinamik bir bariyer oluşturan tek bir epitel hücre tabakası ile kaplıdır. Bu tabakanın ihlali, her ikisi de inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD) da dahil olmak üzere bağırsaktaki patolojik durumların ayırt edici özellikleri olan ışık içeriğine geçirgenliğin artmasına ve bağışıklık hücrelerinin işe alınmasına neden olur. 
Polimorfonuklear nötrofillerin (PMN) epitel bariyer fonksiyonunu ve transepithelial göçlerini (TEpM) düzenleyen mekanizmalar, nicel analizlere izin eden deneysel in vivo yöntemlerin eksikliği nedeniyle eksik anlaşılmaktadır. Burada, ileum veya proksimal kolonun dışlanmış bir bağırsak segmentini kullanan sağlam bir murine deneysel modelini tarif ediyoruz. Dışsallaştırılmış bağırsak döngüsü (iLoop) tamamen damarlıdır ve epitel hücre monolayerleri arasında geçirgenlik ve PMN göçünü incelemek için yaygın olarak kullanılan ex vivo oda bazlı yaklaşımlara göre fizyolojik avantajlar sunar.
Bu modelin iki uygulamasını ayrıntılı olarak gösteriyoruz: (1) intralüminal enjeksiyondan sonra serumda floresan etiketli dekstransın tespiti yoluyla bağırsak geçirgenliğinin nicel ölçümü, (2) böbrek içi kemoattratantların intralüminal girişinden sonra bağırsak lümenine göç eden PMN'nin nicel değerlendirmesi. Bu modelin fizibilitesini gösteriyoruz ve kontrollere kıyasla epitel sıkı kavşakla ilişkili protein JAM-A'dan yoksun farelerde iLoop'u kullanarak sonuçlar sağlıyoruz. JAM-A'nın enflamatuar yanıtlar sırasında PMN TEpM'nin yanı sıra epitel bariyer fonksiyonunu da düzenlediği gösterilmiştir. iLoop'u kullanan sonuçlarımız önceki çalışmaları doğrular ve homeostaz ve hastalık sırasında bağırsak geçirgenliğinin düzenlenmesinde JAM-A'nın ve in vivo PMN TEpM'nin önemini vurgular. 
iLoop modeli, bağırsak homeostazı ve iltihabının tekrarlanabilir in vivo çalışmaları için son derece standartlaştırılmış bir yöntem sağlar ve IBD gibi hastalıklarda bağırsak bariyeri fonksiyonu ve mukozal inflamasyonun anlaşılmasını önemli ölçüde artıracaktır.

İleal döngünün ve pcLoop modellerinin şematik bir gösterimi sırasıyla Şekil 1 ve Şekil 2'detasvir edilir. Anatomik resimler, bağırsak segmentinin dışsallaştırılması ( Şekil 1B ve Şekil 2B),kan akışının en az bozulmasına izin veren ligasyonlar için uygun bir yerin tanımlanması (Şekil 1C ve Şekil 2C</stro...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model at JoVE.com

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

Düzensiz bağırsak epitel bariyer fonksiyonu ve immün yanıtlar, fizyolojik modellerin eksikliği nedeniyle kötü araştırılmaya devam eden enflamatuar bağırsak hastalığının ayırt edici özellikleridir. Burada, mukozal geçirgenliği ve lökosit işe alımını vivo olarak incelemek için iyi vaskülerleştirilmiş ve dışlanmış bir bağırsak segmenti kullanan bir fare bağırsak döngüsü modelini tarif ediyoruz.

Standartlaştırılmış Bağırsak Döngüsü Modeli Kullanılarak Farelerde Bağırsak Geçirgenliği ve Nötrofil Transepithelial Göçün Fonksiyonel Değerlendirmesi

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...

Bağırsak modeli, bağırsakların ne kadar sızdırıcı olduğunu ve lökositlerin farelerde bağırsakta nasıl göç ederek in vivo olduğunu ölçmek için yaygın olarak uyarlanabilir ve fizyolojik bir yoldur. Bu yöntem, artan bağırsak geçirgenliği ve patolojik bağırsak iltihabının altında kalan mekanizmaların daha iyi anlaşılmasına yardımcı olur. Teknik, ülseratif kolit ve Crohn hastalığında görüldüğü gibi bağırsak bariyeri fonksiyonunun altında kalan mekanizmaları ve patolojik inflamasyonu anlama mekanizmalarımıza yardımcı olmak için kullanılabilir.Bu model, bağırsak bariyeri fonksiyonunun incelenmesi veya farede bağışıklık hücresi alımı için ileum veya proksimal kolondan oluşan iyi damarlı, dışlanmış bir bağırsak segmenti kullanır. Bu geniş uygulama ile bağırsak döngüsü modeli, sızdıran bir bağırsak bariyerinin yanı sıra enflamatuar yanıttan kaynaklanan hastalıklar hakkında fikir verebilir. Cerrahi adımlarla mücadeleler aşılabilir.Tamamen damarlı bir bağırsak segmentini dışsallaştırmak ve kanamayı önlemek için ligasyonlar için uygun yerleri seçmek kritik öneme sahiptir. Bağırsak döngüsü modeli mikrocerrahi bir tekniktir, bu nedenle diğer cerrahi işlemlerde olduğu gibi, görsel gösteriden ve yöntemin adım adım sunumundan büyük fayda sağlar. Cerrahi bir anestezi düzlemine ulaştıktan sonra, karın orta çizgisinin kürkünü alkol sürüntüleri veya% 70 etanol ile ıslatılmış bir gazlı bez süngeri ile ovalayarak başlayın.Hipotermiyi önlemek için geniş bir kürk alanını alkolle ıslatmayın. Makas kullanarak, orta hat laparotomi gerçekleştirin. Karnın ortasında yatay bir kesi yapın ve karın içi organları yaralamamaya dikkat ederek peritonun ortaya çıkarılması.Açıkta kalan karın içi boşluğun üzerine önceden kesilmiş ıslak pamuklu gazlı bez yerleştirin. Cecum'u harekete geçirmek ve dışlamak için ıslak pamuklu çubuklar kullanın ve ıslak pamuklu gazlı bez üzerine dikkatlice yerleştirin. Ardından, ileumu harekete geçirin ve hafifçe dışlayın.Mezenterik damarları ve kan akışını bozmadan ıslak pamuklu gazlı bez üzerine en az altı santimetre terminal ileum dağıtın. Sıcak HBSS ile maruz kalan dokuları her zaman nemli tutun. Mezentery'deki ileum'dan sağlayan ana atardamarı tanımlayın, cecum'a yakın.Daha sonra, mezentery'de kritik kan damarlarından arındırılmış iki ligasyon bölgesi bulun. Terminal ileumu künt doku tokaları ile sıkıca tutun ve kan damarlarından kaçınarak mezenteri fenestrat etmek için ince uçlu önseziler kullanın. Perforasyon boyunca ipek dikiş yerleştirin ve ilk ligasyonu oluşturmak için cerrahi bir düğüm bağlayın.İlk bağdan dört santimetre uzağı ölçmek ve ikinci ligatürü oluşturmak için cetveli kullanın. Kan akışını ve mezenterik zarı sağlam tutarak dört santimetre ileal döngüyü izole etmek için her ligasyonun yanında ince makasla dikkatlice kesin. 10 mililitrelik bir şırınna bağlı esnek bir sarı besleme tüpü kullanarak ileal döngü segmentinin içeriğini ılık HBSS ile hafifçe yıkayın.Cerrahi bölgeyi temiz tutmak için ışık içeriğini karın boşluğundan temiz tuttuğunuzdan emin olun. Yıkanmış ileal halkanın iki kesik ucunu ipek dikişle bir arayan. Fitc-dekstrans veya kemokin gibi 250 mikrolitre reaktifi yavaşça bağırsak lümenine enjekte etmek için 30 kalibrelik iğneli bir mililitre şırınga kullanın.İleal döngü şişecek ve mukozanın ılımlı bir şekilde dağılmasına neden olacaktır. Ters kesme iğnesi ile bir iğne tutucu, anatomik tokmaklar ve 3.0 emilemez ipek dikiş kullanarak karın duvarını kapatın. Hipotermiyi önlemek için hayvanı kuruttuktan sonra, kuluçka süresi boyunca sıcaklık düzenlemeli bir anestezi odasına yerleştirin.Fareyi ameliyata hazırlayın ve daha önce gösterildiği gibi cecum'un dış cephesini kullanın. Islak pamuklu çubuklar kullanarak, tüm ileumu dışlaştırın ve ıslak bir pamuklu gazlı bezin üzerine yerleştirin. Proksimal kolonu ve mezokolonda bulunan kan akışını tanımlayın.Proksimal kolonu harekete geçirin ve mezokolondaki damarlardan arındırılmış bir alanda ilk ligatürü cecumdan yaklaşık 0,5 santimetre distal olarak oluşturun. İlk bağdan iki santimetre ölçün ve mezokolondaki kan kaynağı olmayan bir alanda ikinci bir bağ oluşturun. İnce makas kullanarak, iki santimetre uzunluğunda bir pcLoop'ı izole etmek için her ligasyonun yanında dikkatlice kesin.10 mililitrelik bir şırıngana bağlı esnek bir sarı besleme tüpü kullanarak dışkıyı çıkarmak için pcLoop'u ılık HBSS ile hafifçe yıkayın. Cerrahi bölgeyi temiz tutmak için ışık içeriğini karın boşluğundan temiz tuttuğunuzdan emin olun. Ardından, ipek dikiş kullanarak yıkanmış pcLoop'un iki kesme ucunu ligat.Fitc-dektran veya kemokin gibi 200 mikrolitre reaktifi yavaşça bağırsak lümenine enjekte etmek için 30 kalibrelik iğneli bir mililitre şırınga kullanın. pcLoop şişirilecek ve mukozanın orta derecede dağılmasına neden olacaktır. Ligated pcLoop, ileum ve cecum'u hafifçe geri koymak için ıslak pamuklu çubuklar kullanın.Ters kesme iğnesi ile bir iğne tutucu, anatomik tokmaklar ve 3.0 emilemez ipek dikiş kullanarak karın duvarını kapatın. Kuluçka döneminden sonra, uyuşturuldu fareyi ötenazi yapın ve analiz için dokuları toplayın. Bağırsak geçirgenliğinin değerlendirilmesi için I döngü modelinin doğruluğunu doğrulamak için, in vivo bağırsak bariyer fonksiyonunun düzenlenmesinde sıkı kavşak ilişkili protein Jam-a'nın rolünü değerlendirmek için bir FITC-dextran pcLoop tahlil işlemi gerçekleştirildi.pcLoop modeli ile Jam-a null farelerde kontrollere kıyasla FITC-dextran serum seviyelerinde 2,5 kat artış ölçüldü. Benzer sonuçlar, bağırsak epitel hücreleri üzerinde seçici Jam-a kaybı barındıran farelerle elde edildi. pcLoop modeli polimorfonuclear nötrofil veya PMN, bağırsak mukozasına işe alım ve daha sonra transepithelial göç in vivo incelemek için kullanıldı.pcLoop'un ışık içeriğindeki PMN sayısı akış sitometrisi analizi ile ölçüldü. Proksimal kolon segmentinde mevcut PMN sayısı fizyolojik koşullar altında düşüktü. Pro-enflamatuar sitokinler, TNF alfa ve IFN gama ile ameliyat öncesi ön işlem, pcLoop lümeninde işe alınan PMN sayısının arttırıldığı sonucuna vardı.PMN kemoterapi çekici LTB4'ün yönetimi PMN sayılarında çarpıcı bir artışa yol açtı. Kolonik mukozada PMN'nin immünohistokimyasal lekelenmesi sitokinler ve LTB4 ile uyarılmasını takiben PMN'nin yüksek işe alımını doğrulamaz. Jam-a'nın PMN transepithelial göçüne katkısı, bağırsak epitel hücreleri üzerinde seçici Jam-a kaybı barındıran fareler üzerinde pcLoop modeli kullanılarak çalışılmıştır.Epitel Jam-a kaybı, kolon lümeninde çöp atma kontrollerine kıyasla transmigran PMN sayısının azalmasına yol açtı. Bu teknik için kritik bir husus, ameliyatı gerçekleştirirken dışlanmış bağırsak segmentine kan akışını korumayı hatırlamaktır. Bu protokolün ardından, bariyer bütünlüğü kaybını ve in vivo bağırsak iltihabını araştırmak için bağırsak geçirgenliği tahlili ve nötrofil transepithelial göç tahlili gibi diğer yöntemler yapılabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Application of a Mouse Ligated PeyerÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

Fare Uygulama M hücreleri tarafından Bakteriyel Alımı değerlendirin Peyer Patch Bağırsak Loop Testi bağlandı

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Bağırsak Epitel Hücreleri Of Enterik Bakteriyel Invasion<em&gt; In Vitro</em&gt; Dramatik bir Dikey Difüzyon Odası Modeli Geliştirilmiş mı

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Tüp bebek Patojen Kaynaklı Nötrofil Trans-epitel Göçünü Değerlendirmek için Coculture Tahlili

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

Bir kültür Mesane EPİTELİ karşısında İnsan Nötrofil Göç Kantitatif Değerlendirilmesi

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Miyeloid hücrelerin Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme<em&gt; Süm<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Bağırsak Tümörleri Disk Eşodaklı Mikroskopi Spinning tarafından

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

Mezenterik Lenf Kanal Kanüllü Rat Modeli: Bağırsak Lenfatik İlaç Ulaştırma Değerlendirilmesine Uygulaması

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Efektör CD4 Evlatlık transferi ile Kemirgen Bağırsak Enflamasyon indüksiyonu<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Yüksek</sup&gt; Bağışık yetmezliği olan farelere içine T Hücreleri

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Memeli Hücrelerinin Bakteri Mücadelesinden Sonra Stres Granül Oluşumunun İmmünofloresan Analizi

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...

Induction of Intestinal Graft-versus-host Disease and Its Mini-endoscopic Assessment in Live Mice

İndüksiyon bağırsak Graft - versus - host hastalığı ve canlı fareler, Mini-endoskopik değerlendirme

Acute graft-versus-host disease (GvHD) represents the most severe complication that patients previously undergoing allogeneic hematopoietic stem cell ...

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Patojenler, Commensals ve ana bilgisayar bağırsak epitel arasındaki etkileşimler çalışmaya insan Colonoid Monolayers

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...