Name: fat-covered islet transplantation using epididymal white adipose tissue
Uploaded: 2021-05-25T14:00:00
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Diese Studie wurde durch einen Zuschuss für wissenschaftliche Forschung (C) (19K09839, NS) des japanischen Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie finanziert.

Das folgende Verfahren wird in drei Schritten durchgeführt. Der erste Schritt umfasst die Induktion von Diabetes bei den Empfängermäusen und die Isolierung von Spenderinseln. Der zweite Schritt beinhaltet die Vorbereitung von Inselchen vor der Transplantation. Im dritten Schritt wird die Inseltransplantation auf Nebenhodenfettgewebe und die Abdeckung der Inseln mit dem Fettgewebe durchgeführt. Danach wurden die therapeutischen Wirkungen bewertet. Der Umgang mit den Mäusen und die in dieser Studie durchgeführten exp...

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	<li>Barton, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+in+outcomes+of+clinical+islet+transplantation:+1999-2010.">Improvement in outcomes of clinical islet transplantation: 1999-2010.</a> Diabetes Care. 35 (7), 1436-1445 (2012).</li><li>Balamurugan, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+product+characteristics+and+factors+related+to+successful+human+islet+transplantation+from+the+Collaborative+Islet+Transplant+Registry+(CITR)+1999-2010.">Islet product characteristics and factors related to successful human islet transplantation from the Collaborative Islet Transplant Registry (CITR) 1999-2010.</a> American Journal of Transplantation. 14 (11), 2595-2606 (2014).</li><li>Collaborative Islet Transplant Registry. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Collaborative Islet Transplant Registry. 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A., Headen, D. M., Taylor, W. R., Thule, P. M., Garcia, A. 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Die fettbedeckte Inseltransplantationsmethode umfasst Techniken aus zwei verschiedenen Transplantationstechniken: intraperitoneale Inseltransplantation und intraadipöse Gewebeinseltransplantation. Da die Oberflächenmembran des epididymalen weißen Fettgewebes als das weiße Fettgewebe angesehen wird, das vom Peritoneum bedeckt ist und an den Nebenhoden befestigt ist, kann die fettbedeckte Inseltransplantationsmethode anatomisch als eine Art intraperitoneale Inseltransplantation kategorisiert werden. Die Technik, mit de...

Die Inseltransplantation ist eine Zellersatztherapie für Patienten mit schwerem Diabetes mellitus. Jüngste Berichte haben gezeigt, dass sich die Insulinunabhängigkeitsraten drei Jahre nach der Transplantation auf bis zu 44 %1 verbessern und dass etwa 80 % der Empfänger, die insgesamt mehr als 600.000 Inseläquivalente erhalten, eine Insulinunabhängigkeit erreichen2. Darüber hinaus wurde im jüngsten Bericht des Collaborative Islet Transplant Registry festgestellt, dass der Nüchternblutzuckerspiegel bei über einen Zeitraum von 5 Jahren bei über 70% der Patienten, die sich einer Inseltransplantation unterzogen hatten, über einen Zeitraum von 5 Jahren bei 60-140 mg / dl gehalten wurde. Die Studie ergab auch, dass etwa 90% der Patienten, die nach einer Nierentransplantation nur eine Inseltransplantation oder eine Inseltransplantation erhielten, über 5 Jahre lang keine schweren hypoglykämischen Ereignisse entwickelten3.
Obwohl sich die klinischen Ergebnisse dieser Behandlung verbessert haben, müssen noch einige Einschränkungen angegangen werden, einschließlich der Notwendigkeit, eine optimale Transplantationsstelle zu etablieren. Die Leber ist eine typische Transplantationsstelle für die klinische Inseltransplantation, da sie das größte Organ ist, das ein hohes Volumen an Inseln aufnehmen kann. Bei einigen Patienten ist jedoch die Leber nicht verfügbar (z. B. aufgrund von portaler Hypertonie, Hepatitis und/oder Zirrhose4) und daher andere Stellen, einschließlich des renalen subkapsulären Raums5,6, des omentalen Beutels 7,8,9,10, des Mesenteriums 11, des Magen-Darm-Trakts 12, der Skelettmuskulatur 13, des Unterhautgewebes 13, des Knochenmarks 14 und der Milz 15 ,16,17, wurden als alternative Transplantationsstellen in Betracht gezogen.
Obwohl die intraperitoneale Inseltransplantation leicht unter örtlicher Betäubung durchgeführt werden kann, was die intraperitoneale Höhle zu einem attraktiven Ort für die klinische Inseltransplantation macht, sind die Inseln nach der Transplantation über die gesamte intraperitoneale Höhle verteilt, was die Inseltransplantationserkennung und die erfolgreiche Bestätigung der Anpflanzung erschwert. Daher ist die intraperitoneale Höhle nicht allgemein als ideale klinische Transplantationsstelle anerkannt. Stattdessen wird es häufig als Kontrollmodell für präklinische Studien verwendet, um die Wirksamkeit von transplantierten eingekapselten18 und biotechnologisch hergestellten Inselnzu untersuchen 19. Ein genauer Vergleich zwischen biotechnologisch hergestellten und Kontrollinseln ist jedoch aufgrund der Herausforderungen bei der Durchführung einer genauen Engraftment-Bewertung schwer zu erreichen.
Im Gegensatz dazu wurde die Verwendung von intraperitonealem weißem Fettgewebe im omentalen Beutel8, Mesenterium und anderen extrahepatischen Stellen gut berichtet 10,20,21,22,23 und viele der Studien, die die Funktion von biotechnologisch hergestellten Inseln untersuchten, die mit weißem Fettgewebe transplantiert wurden, konnten vielversprechende therapeutische Ergebnisse berichten20,24,25, 26. Da die Verwendung von Nebenhodenfettgewebe den Nachweis transplantierter Inseln erleichtert, wurde die "fettbedeckte Inseltransplantationsmethode" entwickelt, bei der epididymales Fettgewebe verwendet wird, um die Einschränkungen der intraperitonealen Inseltransplantation zu überwinden. In dieser Arbeit wird die fettbedeckte Inseltransplantation mit Nebenhodenfettgewebe beschrieben.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 Nylon</td>
			<td>Alfresa</td>
			<td>ER2004NA45-KF2</td>
			<td>Closing abdomen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated donkey anti-guinea pig</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>706-546-148</td>
			<td>Secondary antibody for insulin antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647-conjugated donkey anti-rabbit</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-606-152</td>
			<td>Secondary antibody for von Willebrand factor antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11885084</td>
			<td>Culturing islets, transplanting islets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals</td>
			<td>051-06515</td>
			<td>Using for staining tissue by eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>Collecting islets&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352095</td>
			<td>Collecting islets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>Using for separating islets from other pancreatic tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>Discarding excessive medium/buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti-insulin</td>
			<td>Agilent Technologies Japan, Ltd. (Dako)</td>
			<td>IR002</td>
			<td>Primary antibody for murine insulin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Muto Pure Chemicals Co., Ltd.</td>
			<td>30002</td>
			<td>Using for staining tissue by hematoxylin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isodine solution 10%</td>
			<td>Shionogi&#38;Co., Ltd.</td>
			<td>no catalog number</td>
			<td>Using for disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals</td>
			<td>095-06573</td>
			<td>Using for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcon 1000 &#181;L ZapSilk Low Retention Pipette Tips</td>
			<td>Labcon</td>
			<td>1177-965-008</td>
			<td>Using for separating islets from other pancreatic tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcon 200 &#181;L ZapSilk Low Retention Pipette Tips</td>
			<td>Labcon</td>
			<td>1179-965-008</td>
			<td>Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mintsensor</td>
			<td>Sanwa Kagaku Kenkyusho Co. Ltd.,</td>
			<td>8AEB02E</td>
			<td>Using for monitoring blood glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetteman P-1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td>Using for separating islets from other pancreatic tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetteman P-200</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td>Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-vWF</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6994</td>
			<td>Primary antibody for murine von Willebrand factor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fat-covered islet transplantation using epididymal white adipose tissue

Die Inseltransplantation ist eine Zellersatztherapie bei schwerem Diabetes mellitus. Die intraperitoneale Höhle ist typischerweise die Transplantationsstelle für dieses Verfahren. Die intraperitoneale Inseltransplantation hat jedoch einige Einschränkungen, darunter eine schlechte Transplantationswirksamkeit, eine schwierige Transplantaterkennung und einen Mangel an Graftektomiefähigkeit für die Analyse nach der Transplantation. In diesem Artikel wird die "fettbedeckte Inseltransplantation", eine intraperitoneale Inseltransplantationsmethode, die epididymales weißes Fettgewebe verwendet, verwendet, um die therapeutischen Wirkungen von biotechnologisch hergestellten Inseln zu bewerten. Die Einfachheit der Methode liegt in der Aussaat von Inseln auf epididymales weißes Fettgewebe und die Verwendung des Gewebes zur Abdeckung der Inseln. Während diese Methode als intraperitoneale Inseltransplantationstechnik kategorisiert werden kann, teilt sie Merkmale mit der Transplantation von Injektionsinseln innerhalb des Fettgewebes. Die fettbedeckte Inseltransplantationsmethode zeigt jedoch robustere therapeutische Wirkungen als die Inseltransplantation im intrafetten Gewebe, einschließlich der Verbesserung des Blutzucker- und Plasmainsulinspiegels und des Potenzials zur Entfernung von Transplantaten. Wir empfehlen die Anwendung dieser Methode zur Beurteilung der Mechanismen der Inseltransplantation in weißes Fettgewebe und der therapeutischen Wirkungen von biotechnologisch hergestellten Inseln.

Um die Transplantationswirksamkeit der fettbedeckten Inseltransplantation mit der nach intraperitonealer Inseltransplantation zu vergleichen, wurde die gleiche Anzahl von Inseln auf das Peritoneum im linken parakolischen Raum von Kontrollempfänger-Diabetikern implantiert. Es wurde beobachtet, dass der Blutzuckerspiegel von Mäusen mit fettbedeckter Inseltransplantation im Vergleich zu intraperitonealen Inseltransplantatmäusen allmählich und signifikant abnahm (p = 0,0023; Abbildung 3A). E...

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Fat-Covered Islet Transplantation Using Epididymal White Adipose Tissue

Diese fettbedeckte Inseltransplantationsmethode eignet sich für den Nachweis von eingepfropften Inseln in der intraperitonealen Höhle. Insbesondere erfordert es nicht die Verwendung von Biobindemitteln oder Naht.

Fettbedeckte Inseltransplantation mit Nebenhoden-weißem Fettgewebe

Islet transplantation is a cellular replacement therapy for severe diabetes mellitus. The intraperitoneal cavity is typically the transplant site for this ...

Dieses Protokoll ermöglicht es, den Mechanismus der Inseltransplantation in weißes Fettgewebe zu beurteilen. Der Hauptvorteil dieser fettbedeckten Inseltransplantationsmethode besteht darin, dass sie technisch einfach zu replizieren ist. Die Methode kann auf andere Krankheitsmodelle angewendet werden.Zum Beispiel kann es verwendet werden, um ein Mausmodell von Krebs zu erstellen. Naoaki Sakata, außerordentlicher Professor an der Universität Fukuoka, demonstriert das Verfahren. Verwenden Sie unter einem Seziermikroskop eine P 200-Mikropipette, um zusätzliche Inselbestandteile aus den Verdauungen der Bauchspeicheldrüse, einschließlich Azinus und fibrösem Gewebe, zu entfernen.Verwenden Sie dann ein Zellsieb, um einzelne Azinuszellen herauszufiltern. Die gefilterten Inseln werden in eine neue Kulturschale überführt, die das entsprechende Kulturmedium oder die mit Rinderserum oder Albumin ergänzte Pufferlösung enthält, und schwenken Sie die Schale, um die Inseln in der Mitte zu positionieren. Nehmen Sie die einzelnen Inseln mit einer P 200 Mikropipette in ein geeignetes Auffangrohr.Setzen Sie ein neues 40-Mikrometer-Zellsieb auf ein 50-Milliliter-Kunststoffrohr. Verwenden Sie eine 1000-Mikroliter-Pipette, um die Inseln zum Sieb hinzuzufügen, um die Inseln und die einzelnen Azinuszellen zu trennen. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Sieb auf eine neue 60 oder 100 Milliliter große, unbehandelte Kulturschale umzudrehen, die Kulturmedium oder eine geeignete Pufferlösung enthält, ergänzt mit Rinderserum oder Albumin.Verwenden Sie frisches Medium oder Puffer, um die Inseln in eine neue Kulturschale zu spülen, und fügen Sie dann genügend Medium oder Puffer zur Kulturschale hinzu, um ein Gesamtvolumen von etwa 20 Milliliter zu erreichen. Zählen Sie die Inseln unter dem Mikroskop und teilen Sie die Anzahl der Inseln gleichmäßig auf einzelne 1,5-Milliliter-Kunststoffzentrifugenröhrchen entsprechend der Anzahl der Spendertiere auf. Zentrifugieren Sie die Inseln bei 2, 100 G für eine Minute bei Raumtemperatur und entsorgen Sie den Überstand.Etwa 20 bis 30 Mikroliter Restlösung verbleiben typischerweise im Röhrchen. Nachdem Sie die Haare aus dem Bauch entfernt haben, um eine Infektion zu verhindern, legen Sie die Maus in Rückenlage. Nach der Desinfektion des Bauches und der Leistenregion schneiden Sie die Haut im unteren Mittelbereich ein, wodurch ein Hautschnitt entsteht, der etwa zwei Zentimeter lang ist.Klemmen Sie die linke Bauchdecke mit einer Pinzette oder Retraktoren und ziehen Sie das Gewebe auf die linke Seite der Maus, um das Operationsfeld zu sichern. Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um den Dünn- und Dickdarm auf der rechten Seite der Maus zu mobilisieren. Das linke epidermale weiße Fettgewebe in der Bauchhöhle befindet sich im linken Leistenbereich.Mobilisieren Sie das epidermale weiße Fettgewebe und den linken Hoden nach außen und dehnen Sie das Gewebe aus. Verwenden Sie eine P 200-Mikropipette, um das gesamte Volumen der Inseln aus einem 1,5-Milliliter-Röhrchen zu sammeln, und achten Sie darauf, dass bei der Entnahme keine Inseln in der Röhre verbleiben. Lassen Sie die gesammelten Inseln durch die Schwerkraft in der Spitze der Pipette absetzen.Legen Sie die Mikropipettenspitze leicht auf das aufgeblähte Fettgewebe und achten Sie darauf, eine übermäßige Spülung des Mediums oder einen Puffer in der Spitze zu vermeiden. Samen Sie die Inseln vorsichtig auf das Gewebe. Bestätigen Sie nach der Aussaat die korrekte Platzierung der Inseln unter einem Seziermikroskop.Bedecken Sie die Inseln mit dem epidermalen weißen Fettgewebe, legen Sie dann den linken Hoden unter das episomale weiße Fettgewebe und führen Sie das Gewebe in die intraperitoneale Höhle zurück. Verschließen Sie die Haut in zwei Schichten mit einer 4-o-Naht. Wenn Sie fertig sind, legen Sie die Maus unter eine Wärmelampe und überwachen Sie sie bis zur vollständigen Genesung.Um die Transplantationswirksamkeit der fettbedeckten Inseltransplantation mit der nach intraperitonealer Inseltransplantation zu vergleichen, wurde die gleiche Anzahl von Inseln auf das Peritoneum im linken parakolischen Raum von diabetischen Kontrolltieren implantiert. Es wurde beobachtet, dass der Blutzuckerspiegel von Mäusen mit fettbedeckter Inseltransplantation im Vergleich zu intraperitonealen Inseltransplantatmäusen allmählich und signifikant abnahm. Die intraperitoneale Glukosetoleranz wurde einen Monat nach der Transplantation durchgeführt.Der Blutzucker bei Mäusen mit fettbedeckter Inseltransplantation wurde auf niedrigeren Werten gehalten als bei intraperitonealen Inseltransplantatmäusen. Die histologische Untersuchung wurde verwendet, um die Inseltransplantation in das epidermale weiße Fettgewebe zu beurteilen. Bei fettbedeckten Inseltransplantat-Empfängertieren zeigte die Hämatoxylin-Eozän-Färbung das Vorhandensein von Inseln im epidermalen weißen Fettgewebe.Darüber hinaus erleichterte die fluoreszenzkonjugierte Antikörperfärbung von insulinpositiven Inseln den Nachweis von von-Willebrand-Faktor-positiven Mikrogefäßen im epidermalen weißen Fettgewebe aller Empfängermäuse. Um mit diesem Verfahren erfolgreich zu sein, stellen Sie sicher, dass sich die Inseln vollständig an der Spitze der Pipette absetzen und sie auf das Fettgewebe säen, ohne zu verschütten.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Eine Methode zur Murine Islet Isolation und subkapsulären Nierentransplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Forschung

Medizin

Transplantation of Pulmonary Valve Using a Mouse Model of Heterotopic Heart Transplantation

Transplantation von Pulmonalklappe Mit einem Maus-Modell der heterotopen Herztransplantation

Tissue engineered heart valves, especially decellularized valves, are starting to gain momentum in clinical use of reconstructive surgery with mixed ...

Cerenkov Luminescence Imaging of Interscapular Brown Adipose Tissue

Cerenkov Lumineszenz-Imaging von interskapulären braunes Fettgewebe

Brown adipose tissue (BAT), widely known as a &#8220;good fat&#8221; plays pivotal roles for thermogenesis in mammals. This special tissue is closely ...

Encapsulation Thermogenic Preadipocytes for Transplantation into Adipose Tissue Depots

Encapsulation Thermogenic Präadipozyten für die Transplantation in Fettgewebe Depots

Cell encapsulation was developed to entrap viable cells within semi-permeable membranes. The engrafted encapsulated cells can exchange low molecular ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Schaffung und Transplantation von einem Fettgewebe-derived Stem Cell (ASC) Blatt in einem diabetischen Wundheilung Modell

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Assessment of Human Adipose Tissue Microvascular Function Using Videomicroscopy

Bewertung der menschlichen Fettgewebe mikrovaskuläre Funktion mit Videomicroscopy

While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. ...

Transplantation of Adipose Tissue-Derived Stem Cell Sheet to Reduce Leakage After Partial Colectomy in A Rat Model

Transplantation von Fettgewebe-Derived Stem Cell Blatt, Leckage nach teilweiser Colectomy in einem Rattenmodell zu reduzieren

Anastomotic leakage is a disastrous complication after colorectal surgery. Although current methods for leakage prevention have different levels of ...

Characterization of Immune Cells in Human Adipose Tissue by Using Flow Cytometry

Charakterisierung von Immunzellen im menschlichen Fettgewebe mittels Durchflusszytometrie

Infiltration of immune cells in the subcutaneous and visceral adipose tissue (AT) deposits leads to a low-grade inflammation contributing to the ...

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Ganzen Körper und regionale Quantifizierung der aktiven Menschen braune Fettgewebe mit 18F-FDG PET/CT

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to ...

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue (ISWAT) Transplantation Model of Murine Islets

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue ISWAT Transplantation Model of Murine Islets

Leisten-Subkutanes weißes Adiposeengewebe (ISWAT) Transplantationsmodell von Murine-Inseln

Pancreatic islet transplantation is a well-established therapeutic treatment for type 1 diabetes. The kidney capsule is the most commonly used site for ...