Name: fat-covered islet transplantation using epididymal white adipose tissue
Uploaded: 2021-05-25T14:00:00
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Questo studio è stato finanziato da un Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (19K09839, NS) del Ministero dell'Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia del Giappone.

La procedura seguente viene eseguita in tre passaggi. Il primo passo include l'induzione del diabete nei topi riceventi e l'isolamento delle isole donatrici. Il secondo passo prevede la preparazione delle isole prima del trapianto. Nella terza fase, viene eseguito il trapianto di isole sul tessuto adiposo epididimo e la copertura delle isole utilizzando il tessuto adiposo. Successivamente, sono stati valutati gli effetti terapeutici. La manipolazione dei topi e le procedure sperimentali eseguite in questo studio sono con...

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	<li>Barton, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+in+outcomes+of+clinical+islet+transplantation:+1999-2010.">Improvement in outcomes of clinical islet transplantation: 1999-2010.</a> Diabetes Care. 35 (7), 1436-1445 (2012).</li><li>Balamurugan, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+product+characteristics+and+factors+related+to+successful+human+islet+transplantation+from+the+Collaborative+Islet+Transplant+Registry+(CITR)+1999-2010.">Islet product characteristics and factors related to successful human islet transplantation from the Collaborative Islet Transplant Registry (CITR) 1999-2010.</a> American Journal of Transplantation. 14 (11), 2595-2606 (2014).</li><li>Collaborative Islet Transplant Registry. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Collaborative Islet Transplant Registry. Annual Report. , (2017).</li><li>Rajab, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+Pancreatectomy+and+Islet+Autotransplantation+Following+Treated+Hepatitis+C+Infection.">Total Pancreatectomy and Islet Autotransplantation Following Treated Hepatitis C Infection.</a> Cell Transplantation. 27 (10), 1569-1573 (2018).</li><li>Mellgren, A., Schnell Landstrom, A. H., Petersson, B., Andersson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+renal+subcapsular+site+offers+better+growth+conditions+for+transplanted+mouse+pancreatic+islet+cells+than+the+liver+or+spleen.">The renal subcapsular site offers better growth conditions for transplanted mouse pancreatic islet cells than the liver or spleen.</a> Diabetologia. 29 (9), 670-672 (1986).</li><li>Hiller, W. F., Klempnauer, J., Luck, R., Steiniger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progressive+deterioration+of+endocrine+function+after+intraportal+but+not+kidney+subcapsular+rat+islet+transplantation.">Progressive deterioration of endocrine function after intraportal but not kidney subcapsular rat islet transplantation.</a> Diabetes. 40 (1), 134-140 (1991).</li><li>Yasunami, Y., Lacy, P. E., Finke, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+site+for+islet+transplantation--a+peritoneal-omental+pouch.">A new site for islet transplantation--a peritoneal-omental pouch.</a> Transplantation. 36 (2), 181-182 (1983).</li><li>Kin, T., Korbutt, G. S., Rajotte, R. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+risks+of+total+pancreatectomy+and+splenic+islet+autotransplantation.">The risks of total pancreatectomy and splenic islet autotransplantation.</a> Cell Transplantation. 9 (1), 19-24 (2000).</li><li>Itoh, T., Nishinakamura, H., Kumano, K., Takahashi, H., Kodama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Spleen+Is+an+Ideal+Site+for+Inducing+Transplanted+Islet+Graft+Expansion+in+Mice.">The Spleen Is an Ideal Site for Inducing Transplanted Islet Graft Expansion in Mice.</a> PLoS One. 12 (1), 0170899 (2017).</li><li>Sakata, N., Yoshimatsu, G., Kodama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Spleen+as+an+Optimal+Site+for+Islet+Transplantation+and+a+Source+of+Mesenchymal+Stem+Cells.">The Spleen as an Optimal Site for Islet Transplantation and a Source of Mesenchymal Stem Cells.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), (2018).</li><li>Sakata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+rat-to-mouse+bioartificial+pancreas+xenotransplantation+on+diabetic+renal+damage+and+survival.">Effect of rat-to-mouse bioartificial pancreas xenotransplantation on diabetic renal damage and survival.</a> Pancreas. 32 (3), 249-257 (2006).</li><li>Nagaya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+bioengineered+islet+cell+sheets+for+the+treatment+of+diabetes+mellitus.">Effectiveness of bioengineered islet cell sheets for the treatment of diabetes mellitus.</a> Journal of Surgical Research. 227, 119-129 (2018).</li><li>Weaver, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenic+hydrogel+enhances+islet+survival,+engraftment,+and+function+in+leading+extrahepatic+sites.">Vasculogenic hydrogel enhances islet survival, engraftment, and function in leading extrahepatic sites.</a> Science Advances. 3 (6), 1700184 (2017).</li><li>Dufour, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+ectopic+site+for+islet+transplantation,+using+biodegradable+scaffolds.">Development of an ectopic site for islet transplantation, using biodegradable scaffolds.</a> Tissue Engineering. 11 (9-10), 1323-1331 (2005).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epididymal+fat+pad+as+a+transplant+site+for+minimal+islet+mass.">The epididymal fat pad as a transplant site for minimal islet mass.</a> Transplantation. 84 (1), 122-125 (2007).</li><li>Sakata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+Transplanted+Islet+Engraftment+in+Visceral+White+Adipose+Tissue.">Mechanism of Transplanted Islet Engraftment in Visceral White Adipose Tissue.</a> Transplantation. 104 (12), 2516-2527 (2020).</li><li>Navarro-Requena, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PEG+hydrogel+containing+calcium-releasing+particles+and+mesenchymal+stromal+cells+promote+vessel+maturation.">PEG hydrogel containing calcium-releasing particles and mesenchymal stromal cells promote vessel maturation.</a> Acta Biomaterialia. 67, 53-65 (2018).</li><li>Phelps, E. A., Headen, D. M., Taylor, W. R., Thule, P. M., Garcia, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenic+bio-synthetic+hydrogel+for+enhancement+of+pancreatic+islet+engraftment+and+function+in+type+1+diabetes.">Vasculogenic bio-synthetic hydrogel for enhancement of pancreatic islet engraftment and function in type 1 diabetes.</a> Biomaterials. 34 (19), 4602-4611 (2013).</li><li>Manzoli, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoisolation+of+murine+islet+allografts+in+vascularized+sites+through+conformal+coating+with+polyethylene+glycol.">Immunoisolation of murine islet allografts in vascularized sites through conformal coating with polyethylene glycol.</a> American Journal of Transplantation. 18 (3), 590-603 (2018).</li><li>Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+method+for+isolation+of+mouse+pancreatic+islets.">An improved method for isolation of mouse pancreatic islets.</a> Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).</li><li>Brandhorst, D., Brandhorst, H., Hering, B. J., Bretzel, R. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+overload+and+overflow:+metabolic+trauma+and+the+metabolic+syndrome.">Lipid overload and overflow: metabolic trauma and the metabolic syndrome.</a> Trends in Endocrinology, Metabolism. 14 (9), 398-403 (2003).</li><li>Mao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+macroporous+heparin-releasing+silk+fibroin+scaffold+improves+islet+transplantation+outcome+by+promoting+islet+revascularisation+and+survival.">A macroporous heparin-releasing silk fibroin scaffold improves islet transplantation outcome by promoting islet revascularisation and survival.</a> Acta Biomaterialia. 59, 210-220 (2017).</li><li>Wang, K., Wang, X., Han, C. S., Chen, L. Y., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-supported+Transplantation+of+Islets+in+the+Epididymal+Fat+Pad+of+Diabetic+Mice.">Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (125), e54995 (2017).</li><li>Wang, X., Wang, K., Zhang, W., Qiang, M., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bilaminated+decellularized+scaffold+for+islet+transplantation:+Structure,+properties+and+functions+in+diabetic+mice.">A bilaminated decellularized scaffold for islet transplantation: Structure, properties and functions in diabetic mice.</a> Biomaterials. 138, 80-90 (2017).</li><li>Rios, P. D., Zhang, X., Luo, X., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mold-casted+non-degradable,+islet+macro-encapsulating+hydrogel+devices+for+restoration+of+normoglycemia+in+diabetic+mice.">Mold-casted non-degradable, islet macro-encapsulating hydrogel devices for restoration of normoglycemia in diabetic mice.</a> Biotechnology and Bioengineering. 113 (11), 2485-2495 (2016).</li></ol>

Il metodo di trapianto di isole ricoperte di grasso incorpora tecniche di due diverse tecniche di trapianto: trapianto di isole intraperitoneali e trapianto di isole di tessuto intra-adiposo. Poiché la membrana superficiale del tessuto adiposo bianco dell'epididimo è considerata il tessuto adiposo bianco coperto dal peritoneo e che è attaccato all'epididimo, il metodo di trapianto di isole ricoperte di grasso può essere anatomicamente classificato come un tipo di trapianto di isole intraperitoneali. La tecnica con cu...

Il trapianto di isole è una terapia cellulare sostitutiva per i pazienti con diabete mellito grave. Recenti rapporti hanno dimostrato che i tassi di insulino-indipendenza a tre anni dal trapianto migliorano fino al 44%1 e che circa l'80% dei riceventi che ricevono più di 600.000 equivalenti insulari totali raggiungono l'insulino-indipendenza2. Inoltre, nel più recente rapporto del Collaborative Islet Transplant Registry, è stato rivelato che i livelli di glucosio nel sangue a digiuno sono stati mantenuti a 60-140 mg / dL per un periodo di 5 anni in oltre il 70% dei pazienti sottoposti a trapianto di isole da solo. Lo studio ha anche determinato che circa il 90% dei pazienti che hanno ricevuto il trapianto di isole da solo o il trapianto di isole dopo trapianto di rene non hanno sviluppato eventi ipoglicemici gravi per oltre 5 anni3.
Sebbene i risultati clinici di questo trattamento siano migliorati, alcune limitazioni devono ancora essere affrontate, inclusa la necessità di stabilire un sito di trapianto ottimale. Il fegato è un tipico sito di trapianto per il trapianto di isole cliniche perché è l'organo più grande che può ospitare un elevato volume di isole. Tuttavia, in alcuni pazienti il fegato non è disponibile (ad esempio, a causa di ipertensione portale, epatite e / o cirrosi4) e quindi altri siti, tra cui lo spazio subcapsulare renale5,6, la sacca omentale 7,8,9,10, il mesentere 11, il tratto gastrointestinale 12, il muscolo scheletrico 13, il tessuto sottocutaneo 13, il midollo osseo14 e la milza 15 ,16,17, sono stati considerati come siti di trapianto alternativi.
Sebbene il trapianto intraperitoneale di isole possa essere eseguito facilmente in anestesia locale, rendendo la cavità intraperitoneale un sito attraente per il trapianto clinico di isole, al momento del trapianto, le isole sono disperse in tutta la cavità intraperitoneale, rendendo difficile il rilevamento dell'attecchimento delle isole e la conferma dell'attecchimento di successo. Pertanto, la cavità intraperitoneale non è ampiamente riconosciuta come sito di trapianto clinico ideale. Invece, è spesso utilizzato come modello di controllo per studi preclinici per studiare l'efficacia delle isole trapiantate incapsulate18 e bioingegnerizzate19. Tuttavia, un confronto esatto tra isole bioingegnerizzate e di controllo è difficile da ottenere a causa delle difficoltà nell'eseguire una valutazione accurata dell'attecchimento.
Al contrario, l'uso di tessuto adiposo bianco intraperitoneale nella sacca omentale8, nel mesentere e in altre sedi extraepatiche è stato ben riportato 10,20,21,22,23 e molti degli studi che hanno studiato la funzione delle isole bioingegnerizzate trapiantate utilizzando tessuto adiposo bianco sono stati in grado di riportare risultati terapeutici promettenti20,24,25, 26. Poiché l'uso del tessuto adiposo epididimo facilita la rilevazione delle isole trapiantate, il "metodo di trapianto di isole ricoperte di grasso", utilizzando tessuto adiposo epididimale, è stato sviluppato per superare i limiti del trapianto di isole intraperitoneali. In questo articolo viene descritto il trapianto di isole ricoperte di grasso utilizzando tessuto adiposo epididimale.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>4-0 Nylon</td>
			<td>Alfresa</td>
			<td>ER2004NA45-KF2</td>
			<td>Closing abdomen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated donkey anti-guinea pig</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>706-546-148</td>
			<td>Secondary antibody for insulin antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 647-conjugated donkey anti-rabbit</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-606-152</td>
			<td>Secondary antibody for von Willebrand factor antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11885084</td>
			<td>Culturing islets, transplanting islets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals</td>
			<td>051-06515</td>
			<td>Using for staining tissue by eosin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>Collecting islets&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352095</td>
			<td>Collecting islets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td>Using for separating islets from other pancreatic tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td>Discarding excessive medium/buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti-insulin</td>
			<td>Agilent Technologies Japan, Ltd. (Dako)</td>
			<td>IR002</td>
			<td>Primary antibody for murine insulin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin</td>
			<td>Muto Pure Chemicals Co., Ltd.</td>
			<td>30002</td>
			<td>Using for staining tissue by hematoxylin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isodine solution 10%</td>
			<td>Shionogi&#38;Co., Ltd.</td>
			<td>no catalog number</td>
			<td>Using for disinfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Fujifilm Wako Chemicals</td>
			<td>095-06573</td>
			<td>Using for anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcon 1000 &#181;L ZapSilk Low Retention Pipette Tips</td>
			<td>Labcon</td>
			<td>1177-965-008</td>
			<td>Using for separating islets from other pancreatic tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labcon 200 &#181;L ZapSilk Low Retention Pipette Tips</td>
			<td>Labcon</td>
			<td>1179-965-008</td>
			<td>Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mintsensor</td>
			<td>Sanwa Kagaku Kenkyusho Co. Ltd.,</td>
			<td>8AEB02E</td>
			<td>Using for monitoring blood glucose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetteman P-1000</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123602</td>
			<td>Using for separating islets from other pancreatic tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetteman P-200</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F123601</td>
			<td>Using for seeding islets onto epididymal white adipose tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-vWF</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6994</td>
			<td>Primary antibody for murine von Willebrand factor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fat-covered islet transplantation using epididymal white adipose tissue

Il trapianto di isole è una terapia cellulare sostitutiva per il diabete mellito grave. La cavità intraperitoneale è tipicamente il sito di trapianto per questa procedura. Tuttavia, il trapianto di isole intraperitoneali presenta alcune limitazioni, tra cui la scarsa efficacia del trapianto, la difficile capacità di rilevamento dell'innesto e la mancanza di capacità di graftectomia per l'analisi post-trapianto. In questo articolo, "trapianto di isole ricoperte di grasso", un metodo di trapianto di isole intraperitoneali che utilizza tessuto adiposo bianco epididimale, viene utilizzato per valutare gli effetti terapeutici delle isole bioingegnerizzate. La semplicità del metodo sta nella semina di isole sul tessuto adiposo bianco dell'epididimo e nell'utilizzo del tessuto per coprire le isole. Mentre questo metodo può essere classificato come una tecnica di trapianto di isole intraperitoneali, condivide le caratteristiche con il trapianto di isole di tessuto intra-adiposo. Tuttavia, il metodo di trapianto di isole ricoperte di grasso dimostra effetti terapeutici più robusti rispetto al trapianto di isole di tessuto intra-adiposo, compreso il miglioramento dei livelli di glucosio nel sangue e di insulina plasmatica e il potenziale di rimozione del trapianto. Si consiglia l'adozione di questo metodo per valutare i meccanismi di attecchimento delle isole nel tessuto adiposo bianco e gli effetti terapeutici delle isole bioingegnerizzate.

Per confrontare l'efficacia del trapianto di isole ricoperte di grasso con quella dopo il trapianto di isole intraperitoneali, lo stesso numero di isole è stato impiantato sul peritoneo nello spazio paracolico sinistro degli animali diabetici riceventi di controllo. I livelli di glucosio nel sangue dei topi con trapianto di isole ricoperte di grasso sono stati osservati diminuire gradualmente e significativamente rispetto ai topi trapiantati di isole intraperitoneali (p = 0,0023; Figura 3A)...

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Fat-Covered Islet Transplantation Using Epididymal White Adipose Tissue

Questo metodo di trapianto di isole ricoperte di grasso è adatto per il rilevamento di isole innestate nella cavità intraperitoneale. In particolare, non richiede l'uso di agenti bioleganti o sutura.

Trapianto di isole ricoperte di grasso utilizzando tessuto adiposo bianco epididimo

Islet transplantation is a cellular replacement therapy for severe diabetes mellitus. The intraperitoneal cavity is typically the transplant site for this ...

Questo protocollo consente di valutare il meccanismo di attecchimento delle isole nel tessuto adiposo bianco. Il vantaggio principale di questo metodo di trapianto di isole ricoperte di grasso è che è tecnicamente facile da replicare. Il metodo può essere applicato ad altri modelli di malattia.Ad esempio può essere utilizzato per creare un modello murino di cancro. A dimostrare la procedura sarà Naoaki Sakata, professore associato presso l'Università di Fukuoka. Sotto un microscopio da dissezione, utilizzare una micro pipetta P 200 per rimuovere eventuali componenti extra delle isole dalle digestioni del pancreas, compresi i tessuti acinosi e fibrosi.Quindi utilizzare un filtro cellulare per filtrare le singole cellule acinose. Trasferire le isole filtrate in un nuovo piatto di coltura contenente il terreno di coltura appropriato o una soluzione tampone integrata con siero bovino o albumina e ruotare il piatto per posizionare le isole al centro. Utilizzando una micro pipetta P 200, prelevare le singole isole in un tubo di raccolta appropriato.Posizionare un nuovo filtro cellulare da 40 micrometri sopra un tubo di plastica da 50 millilitri. Utilizzare una pipetta da 1000 microlitri per aggiungere le isole al filtro per separare le isole e le singole celle acinose. Utilizzare una pinza per capovolgere il filtro su un nuovo piatto di coltura non trattato da 60 o 100 millilitri contenente terreno di coltura o una soluzione tampone appropriata, integrata con siero bovino o albumina.Utilizzare terreno fresco o tampone per lavare le isole in un nuovo piatto di coltura, quindi aggiungere abbastanza terreno o tampone al piatto di coltura per raggiungere un volume totale di circa 20 millilitri. Contare le isole al microscopio e dividere equamente il numero di isole tra le singole provette da centrifuga in plastica da 1,5 millilitri in base al numero di animali donatori. Centrifugare le isole a 2.100 G per un minuto a temperatura ambiente e scartare il surnatante.Circa 20-30 microlitri di soluzione residua rimarranno tipicamente nel tubo. Dopo aver rimosso i peli dall'addome per prevenire l'infezione, posizionare il topo in posizione supina. Dopo aver disinfettato l'addome e la regione inguinale incidono la pelle nella zona mediana inferiore, creando un'incisione cutanea lunga circa due centimetri.Bloccare la parete addominale sinistra con pinze o divaricatori e tirare il tessuto sul lato sinistro del mouse per proteggere il campo chirurgico. Utilizzare un batuffolo di cotone per mobilitare l'intestino tenue e crasso sul lato destro del mouse. Il tessuto adiposo bianco epidermico sinistro nella cavità addominale si trova nella zona inguinale sinistra.Mobilitare il tessuto adiposo bianco epidermico e il testicolo sinistro all'esterno dell'addome e allungare il tessuto. Utilizzare una micropipetta P 200 per raccogliere l'intero volume di isole da un tubo da 1,5 millilitri, facendo attenzione che nessuna isoletta rimanga nel tubo al momento della raccolta. Lasciare che le isole raccolte si depositino nella punta della pipetta per gravità.Posizionare leggermente la punta della micro pipetta sul tessuto adiposo disteso, avendo cura di evitare un eccessivo lavaggio del mezzo o tampone nella punta. Seminare con cura le isole sul tessuto. Dopo la semina, confermare il corretto posizionamento delle isole sotto un microscopio da dissezione.Coprire le isole con il tessuto adiposo bianco epidermico, quindi posizionare il testicolo sinistro sotto il tessuto adiposo bianco episomiale e riportare i tessuti nella cavità intraperitoneale. Chiudere la pelle in due strati usando una sutura 4-o. Al termine, posizionare il mouse sotto una lampada di calore e monitorarlo fino al completo recupero.Per confrontare l'efficacia del trapianto di isole coperte di grasso con quella dopo il trapianto intraperitoneale di isole, lo stesso numero di isole è stato impiantato sul peritoneo nello spazio paracolico sinistro degli animali diabetici riceventi di controllo. I livelli di glucosio nel sangue dei topi con trapianto di isole ricoperte di grasso sono stati osservati diminuire gradualmente e significativamente rispetto ai topi trapiantati di isole intraperitoneali. Il test di tolleranza al glucosio intraperitoneale è stato eseguito un mese dopo il trapianto.La glicemia nei topi con trapianto di isole ricoperte di grasso è stata mantenuta a livelli inferiori rispetto a quelli osservati nei topi trapiantati di isole intraperitoneali. L'esame istologico è stato utilizzato per valutare l'attecchimento delle isole nel tessuto adiposo bianco epidermico. Negli animali riceventi di trapianto di isole ricoperte di grasso, la colorazione eocenica dell'ematossilina ha rivelato la presenza di isole all'interno del tessuto adiposo bianco epidermico.Inoltre, la colorazione anticorpale coniugata con fluorescenza delle isole insulinopositive ha facilitato la rilevazione di microvasi positivi al fattore di von Willebrand all'interno del tessuto adiposo bianco epidermico di tutti i topi riceventi. Per avere successo con questa procedura, assicurarsi di lasciare che le isole si depositino completamente sulla punta della pipetta e seminarle sul tessuto adiposo senza versarle.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Un metodo per isolamento Islet murini e trapianto renale subcapsulare

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Ricerca

Medicina

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Brown adipose tissue (BAT), widely known as a &#8220;good fat&#8221; plays pivotal roles for thermogenesis in mammals. This special tissue is closely ...

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While obesity is closely linked to the development of metabolic and cardiovascular disease, little is known about mechanisms that govern these processes. ...

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