Name: fertility preservation in patients with severe ovarian dysfunction
Uploaded: 2021-03-25T13:00:00
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Wir danken Tatsuji Ihana, Sachiyo Kurimoto, Kazuko Takahasih, Yuki Yoshizawa, Maho Arashi, Kentaro Fujita, Erina Kudo, Yuka Kurimoto und Mayuko Wakatsuki für die Unterstützung des drogenfreien IVA-Verfahrens und Prof. Aaron J.W. Hsueh (Stanford University School of Medicine, Stanford, CA) für die kritische Lektüre und Bearbeitung des Manuskripts. Wir danken auch Rebecca Truman und Gregory Truman für die Einfügung der englischen Erzählung. Diese Studie wurde von der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS), Scientific Research B (19H03801) und Challenging Exploratory Research (18K19624) unterstützt.

Von jeder POR-Patientin mit abnehmender ovarieller Reserve, die sich für die medikamentenfreie IVA-Behandlung einschrieb, wurde eine schriftliche Einwilligung nach Aufklärung eingeholt. Diese Studie wurde vom Ethikkomitee der International University of Health and Welfare (Nr. 17-S-21) genehmigt. Die klinische Studie wurde unter der Nummer UMIN000034464 registriert und in Übereinstimmung mit dem Ethikkodex des Weltärztebundes (Deklaration von Helsinki) durchgeführt.
1. Extraktion des Ovaria...

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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+births+after+vitrification+of+oocytes+in+a+stimulated+in+vitro+fertilization-embryo+transfer+program.">Live births after vitrification of oocytes in a stimulated in vitro fertilization-embryo transfer program.</a> Fertility and Sterility. 79 (6), 1323-1326 (2003).</li><li>Donnez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Livebirth+after+orthotopic+transplantation+of+cryopreserved+ovarian+tissue.">Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue.</a> Lancet. 364 (9443), 1405-1410 (2004).</li><li>Meirow, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pregnancy+after+transplantation+of+cryopreserved+ovarian+tissue+in+a+patient+with+ovarian+failure+after+chemotherapy.">Pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a patient with ovarian failure after chemotherapy.</a> New England Journal of Medicine. 353 (3), 318-321 (2005).</li><li>De Vos, M., Devroey, P., Fauser, B. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESHRE+consensus+on+the+definition+of+'poor+response'+to+ovarian+stimulation+for+in+vitro+fertilization:+the+Bologna+criteria.">ESHRE consensus on the definition of 'poor response' to ovarian stimulation for in vitro fertilization: the Bologna criteria.</a> Human Reproduction. 26 (7), 1616-1624 (2011).</li><li>Huhtaniemi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+Molecular+Pathophysiology,+Genetics,+and+Treatment+of+Primary+Ovarian+Insufficiency.">Advances in the Molecular Pathophysiology, Genetics, and Treatment of Primary Ovarian Insufficiency.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 29 (6), 400-419 (2018).</li><li>M&#281;czekalski, B., Maciejewska-Jeske, M., Podfigurna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproduction+in+premature+ovarian+insufficiency+patients+-+from+latest+studies+to+therapeutic+approach.">Reproduction in premature ovarian insufficiency patients - from latest studies to therapeutic approach.</a> Prz Menopauzalny. 17 (3), 117-119 (2018).</li><li>Baker, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+plans+and+family-building+options+for+women+with+primary+ovarian+insufficiency.">Life plans and family-building options for women with primary ovarian insufficiency.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 29 (4), 362-372 (2011).</li><li>Englert, Y., Govaerts, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+donation:+particular+technical+and+ethical+aspects.">Oocyte donation: particular technical and ethical aspects.</a> Human Reproduction. 13, 90-97 (1998).</li><li>Englert, Y., Rodesch, C., Laruelle, C., Govoerts, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+donation:+ethical+aspects+related+to+the+donor.">Oocyte donation: ethical aspects related to the donor.</a> Contraception, Fertilite, Sexualite. 25 (3), 251-257 (1997).</li><li>Storgaard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstetric+and+neonatal+complications+in+pregnancies+conceived+after+oocyte+donation:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Obstetric and neonatal complications in pregnancies conceived after oocyte donation: a systematic review and meta-analysis.</a> BJOG: An International Journal of Obstetrics and Gynaecology. 124 (4), 561-572 (2017).</li><li>Storgaard, M., Malchau, S., Loft, A., Larsen, E., Pinborg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+donation+is+associated+with+an+increased+risk+of+complications+in+the+pregnant+woman+and+the+fetus.">Oocyte donation is associated with an increased risk of complications in the pregnant woman and the fetus.</a> Ugeskrift for Laeger. 179 (11), (2017).</li><li>Kawamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo+signaling+disruption+and+Akt+stimulation+of+ovarian+follicles+for+infertility+treatment.">Hippo signaling disruption and Akt stimulation of ovarian follicles for infertility treatment.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17474-17479 (2013).</li><li>Hsueh, A. 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J., Kawamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+approaches+of+drug-free+in+activation+and+laparoscopic+ovarian+incision+to+treat+patients+with+ovarian+infertility.">Surgical approaches of drug-free in activation and laparoscopic ovarian incision to treat patients with ovarian infertility.</a> Fertility and Sterility. , (2020).</li><li>Kawamura, K., Ishizuka, B., Hsueh, A. J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-free+in-vitro+activation+of+follicles+for+infertility+treatment+in+poor+ovarian+response+patients+with+decreased+ovarian+reserve.">Drug-free in-vitro activation of follicles for infertility treatment in poor ovarian response patients with decreased ovarian reserve.</a> Reproductive Biomedicine Online. 40 (2), 245-253 (2020).</li><li>Haino, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Follicular+Localization+in+Human+Ovarian+Cortex+for+Vitrification.">Determination of Follicular Localization in Human Ovarian Cortex for Vitrification.</a> Journal of Adolescent and Young Adult Oncology. 7 (1), 46-53 (2018).</li><li>Baird, D. T., Webb, R., Campbell, B. K., Harkness, L. M., Gosden, R. 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B., Frati, L., Tomao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+function,+reproduction+and+strategies+for+fertility+preservation+after+breast+cancer.">Ovarian function, reproduction and strategies for fertility preservation after breast cancer.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 76 (1), 1-12 (2010).</li><li>Kim, S., Lee, Y., Lee, S., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+tissue+cryopreservation+and+transplantation+in+patients+with+cancer.">Ovarian tissue cryopreservation and transplantation in patients with cancer.</a> Obstetrics &amp; Gynecology Science. 61 (4), 431-442 (2018).</li><li>Donnez, J., Dolmans, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+tissue+freezing:+current+status.">Ovarian tissue freezing: current status.</a> Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. 27 (3), 222-230 (2015).</li><li>Wu, R. C., Kuo, P. L., Lin, S. J., Liu, C. H., Tzeng, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+chromosome+mosaicism+in+patients+with+recurrent+abortion+or+premature+ovarian+failure.">X chromosome mosaicism in patients with recurrent abortion or premature ovarian failure.</a> Journal of the Formosan Medical Association. 92 (11), 953-956 (1993).</li><li>De Munck, N., Vajta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficiency+of+oocyte+vitrification.">Safety and efficiency of oocyte vitrification.</a> Cryobiology. 78, 119-127 (2017).</li><li>Argyle, C. E., Harper, J. C., Davies, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+cryopreservation:+where+are+we+now.">Oocyte cryopreservation: where are we now.</a> Human Reproduction Update. 22 (4), 440-449 (2016).</li></ol>

In diesem Manuskript haben wir ein detailliertes Laborprotokoll für drogenfreie IVA gezeigt. Die medikamentenfreie IVA ist ein neuer Ansatz der Unfruchtbarkeitsbehandlung für POR-Patientinnen mit abnehmender Ovarialreserve, um das Wachstum der sekundären Follikel zu fördern, was zu reiferen Eizellen nach der Stimulation der Eierstöcke führt und bei erfolgreicher Schwangerschaftzunimmt 20. Bei 15 POR-Patientinnen mit abnehmender Ovarialreserve erreichte dieser Ansatz eine spontane Schwangersc...

Die Eierstockfunktion nimmt während des Alterns und einiger pathophysiologischer Zustände, einschließlich Karyotyp-Anomalien, Autoimmunerkrankungen, Chemo- und Strahlentherapien und Eierstockoperationen, allmählich ab. Die Erhaltung der Fruchtbarkeit ist eine der besten Optionen für unverheiratete Frauen mit schwerer Ovarialfunktionsstörung, um ihr Potenzial für eine zukünftige Schwangerschaft zu erhalten. Zur Erhaltung der Fruchtbarkeit stehen derzeit zwei Methoden zur Verfügung, hauptsächlich im Bereich der Onkofruchtbarkeit. Die Kryokonservierung von Eizellen ist ein etabliertes Verfahren zur Erhaltung der Fruchtbarkeit und viele erfolgreiche Fälle wurden berichtet1,2. Auf der anderen Seite wurde die Kryokonservierung von Eierstockgewebe auch zur Erhaltung der Fruchtbarkeit bei Krebspatienten etabliert, aber es ist immer noch eine experimentelle Strategie3,4. Bei beiden Methoden sind mehrere reife Eizellen erforderlich, damit eine Schwangerschaft stattfinden kann. Im Allgemeinen zeigten Patientinnen mit vorzeitiger Ovarialinsuffizienz (POI), die vor dem 40. Lebensjahr zu Amenorrhoe werden, und Frauen mittleren Alters mit niedriger Ovarialreserve eine schlechte ovarielle Reaktion (POR) auf die Stimulation der Eierstöcke zur Ermöglichen reifer Eizellen5,6,7. Darüber hinaus zeigten junge Patientinnen mit einer geringen Anzahl von Antralfollikeln auch POR zur Stimulation der Eierstöcke7. Diese Patientinnen haben selbst nach richtiger Überstimulation der Eierstöcke eine sehr begrenzte Anzahl von abrufbaren Eizellen, so dass mehrere teure Verfahren erforderlich sind, um eine ausreichende Anzahl von Eizellen für die Schwangerschaft zu gewährleisten.
Die Eizellspende gefolgt von einer In-vitro-Fertilisation (IVF) mit dem Sperma des Ehemannes und dem Embryotransfer (ET) ist die einzige Option für diese POI- und POR-Patienten, die Schwierigkeiten haben, ihre eigenen Eizellen zu erhalten8,9,10. Die Eizellspende wird jedoch durch ethische Fragen sowie Autoimmun- und Schwangerschaftskomplikationen erschwert11,12,13,14. Um diese Probleme zu lösen, ist die Etablierung einer Unfruchtbarkeitsbehandlung mit eigenen Eizellen der Patientin erwünscht. Für POI-Patientinnen haben wir den In-vitro-Aktivierungsansatz (IVA) entwickelt, um ein erfolgreiches Follikelwachstum und die Erzeugung reifer Eizellen zu ermöglichen, was zu einer Reihe von Schwangerschaften und Entbindungenführt 15. In IVA fragmentierten wir Eierstockkortexen nach Entfernung der Eierstöcke unter laparoskopischer Operation und kultivierten sie für zwei Tage, um Follikel durch Akt-stimulierende Medikamente zu aktivieren und dann heterotope Transplantationen zurück in künstliche Beutel durchzuführen, die unter der Serosa der Eileiter unter der zweiten laparoskopischen Operation hergestellt wurden15. Dieses Verfahren förderte das Wachstum von primordialen, primären und sekundären Follikeln nach der Fragmentierung des Eierstockkortex, um die Hippo-Signalstörung zu fördern16,gefolgt von einer zweitägigen Kultur mit Akt-Signalstimulatoren17.
Im Gegensatz zu schweren POI-Fällen haben POR-Patientinnen mit verminderter Ovarialreserve mehrere sekundäre Follikel. Da die Hippo-Signalstörung allein wirksam ist, um das sekundäre Follikelwachstum zu fördern16, haben wir kürzlich erfolgreiche Schwangerschaften und Entbindungen für POR-Patienten gezeigt, die das medikamentenfreie IVA-Verfahren mit kortikaler Fragmentierung und orthotopischer Transplantation ohne Behandlung der Akt-stimulierenden Medikamente verwenden. Die medikamentenfreie IVA stimuliert das Frühstadium der Eierstockfollikel, um sich nach nur einer Operation in das präantrale Follikelstadium zu entwickeln, und erhöht die Anzahl der entnommenen Eizellen für den IVF-Embryotransfer15,18. Der medikamentenfreie IVA-Ansatz hat mehrere Vorteile im Vergleich zu unserer ursprünglichen IVA, indem 1) potenzieller Follikelverlust während der Kultur vermieden wird, 2) die Invasivität und die Kosten der zweiten Operation minimiert werden, 3) nur kurzfristige Bettruhe nach der Operation und 4) das Potenzial einer spontanen Schwangerschaft aufgrund orthotopischer Transplantationen besteht. Wir haben kürzlich einen Videoartikel veröffentlicht, der die chirurgischen Verfahren der medikamentenfreien IVA19 und detaillierte Protokolle der Ovarialstimulation nach der Operationzeigt 20. Hier stellen wir Ihnen Details zu den Labormethoden vor, die für eine medikamentenfreie IVA erforderlich sind.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4.5 onz specimen container</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>354013</td>
			<td>Other products may also be suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm dish</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>351007</td>
			<td>Other products may also be suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 x 50 cm sterile drape</td>
			<td>HOGY Medical</td>
			<td>SR-823</td>
			<td>Any type of sterile produsts may also be suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pippete</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>357575</td>
			<td>Other products may also be suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors, Curved</td>
			<td>WPI</td>
			<td>#14224-G</td>
			<td>Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>TOKAI HIT</td>
			<td>TPiE-SP</td>
			<td>Use at operation room to maintain the temperature of dishes containing ovarian tissue before transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin Solution</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9988</td>
			<td>Medium for handling ovarian tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVA cannule</td>
			<td>KITAZATO</td>
			<td>446030 IVA-6030E</td>
			<td>Specific cannula for tissue autografting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAI medical Disposable scalpel</td>
			<td>WPI</td>
			<td>#5 10-A</td>
			<td>Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissors, Curved</td>
			<td>WPI</td>
			<td>#503364</td>
			<td>Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified HTF Medium-HEPES</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>90126</td>
			<td>Medium for handling ovarian tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gauze</td>
			<td>Osaki Medical</td>
			<td>15004</td>
			<td>Any type of sterile produsts may also be suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Tweezers, Curved Tips</td>
			<td>KAI</td>
			<td>#504505</td>
			<td>Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fertility preservation in patients with severe ovarian dysfunction

Die Ovarialfunktion nimmt während des Alterns und bei einigen pathophysiologischen Zuständen, einschließlich Karyotypanomalien, Autoimmunerkrankungen, Chemo- und Strahlentherapien sowie Eierstockoperationen, allmählich ab. Bei unverheirateten Frauen mit schwerer Ovarialfunktionsstörung ist die Erhaltung der Fruchtbarkeit wichtig für zukünftige Schwangerschaften. Obwohl die Kryokonservierung von Eizellen eine etablierte Methode zur Erhaltung der Fruchtbarkeit ist, konnten diese Patientinnen auch nach einer Überstimulation der Eierstöcke nur eine begrenzte Anzahl von Eizellen konservieren, was zu wiederholten Stimulationen führte, um genügend Eizellen zu gewährleisten, um eine zukünftige Schwangerschaft zu gewährleisten. Um dieses Problem zu lösen, haben wir kürzlich ein medikamentenfreies In-vitro-Aktivierungsverfahren (IVA) entwickelt, mit dem wir frühe Stadien der Eierstockfollikel stimulieren können, um sich bis zum präantralen Follikelstadium zu entwickeln. Diese präantralen Follikel können auf das einzigartige Protokoll der Gonadotropinstimulation reagieren, was zu einer erhöhten Anzahl von entnommenen Eizellen pro ovarieller Stimulation für die Kryokonservierung führt. Die medikamentenfreie IVA bestand aus dem chirurgischen Ansatz und der Stimulation der Eierstöcke. Wir entfernten einen Teil des Kortex aus einem oder beiden Eierstöcken von Patientinnen unter laparoskopischer Operation. Das kortikale Gewebe der Eierstöcke wurde in kleine Würfel geschnitten, um den Hippo-Signalweg zu stören und die Entwicklung von Follikeln im Frühstadium zu stimulieren. Diese Würfel wurden orthotrop in die verbleibenden Eierstöcke sowie unter die Serosa beider Eileiter gepfropft. Wir haben bereits den chirurgischen Eingriff der medikamentenfreien IVA und das Protokoll der anschließenden Ovarialstimulation veröffentlicht, aber hier stellen wir die Details der Labormethoden vor, die für eine medikamentenfreie IVA erforderlich sind.

In der ersten Veröffentlichung des IVA-Ansatzes15haben wir die kortikalen Eierstockwürfel nacheinander in die Transplantatstellen der laparoskopischen Chirurgie transplantiert (Abbildung 1A). Da 100-150 Eierstockwürfel verwendet wurden, dauerte es 3-4 Stunden für die Gewebetransplantation unter laparoskopischer Operation. Auch einige Eierstockwürfel gingen vor dem Pfropfen verloren. Da die IVA-Kanüle 20-30 Würfel gleichzeitig an eine Transplantatstelle übertra...

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Fertility Preservation in Patients with Severe Ovarian Dysfunction

Wir präsentieren Details zu Laborverfahren zur medikamentenfreien In-vitro-Aktivierung (IVA) von Eierstockfollikeln für Patientinnen mit schwerer Ovarialfunktionsstörung. Diese Methode könnte die Anzahl der abrufbaren Eizellen pro ovarieller Hyperstimulation erhöhen und die Erhaltung der Fruchtbarkeit für diese Patientinnen verbessern.

Fruchtbarkeitserhaltung bei Patientinnen mit schwerer Ovarialfunktionsstörung

Ovarian function progressively declines during aging and in some pathophysiological conditions including karyotype abnormality, autoimmune diseases, ...

Das Ziel dieses Films ist es, das Verfahren unseres neuen Ansatzes für Patientinnen mit Ovarialfunktionsstörungen zu demonstrieren. Die Eierstockfunktion nimmt während des Alterns und einiger pathophysiologischer Zustände, einschließlich Karyotyp-Anomalien, Autoimmunerkrankungen, Chemo- und Strahlentherapien sowie Eierstockoperationen, progressiv ab. Die meisten Frauen mittleren Alters mit einer niedrigen ovariellen Reserve zeigten eine schlechte ovarielle Reaktion auf die Stimulation der Eierstöcke, um reife Eizellen hervorzurufen.Darüber hinaus zeigten junge Patientinnen mit einer geringen Anzahl von Antralfollikeln auch eine schlechte ovarielle Reaktion auf die Stimulation der Eierstöcke. Die Erhaltung der Fruchtbarkeit ist wichtig, um das potenzielle OCS für zukünftige Schwangerschaften zu speichern. Zur Erhaltung der Fruchtbarkeit wurde die Kryokonservierung von Eizellen eingerichtet.Diese Patientinnen mit schlechter Ovarialreaktion konnten jedoch auch nach richtiger Stimulation der Eierstöcke eine sehr begrenzte Anzahl von Eizellen abrufen, was zu wiederholten teuren Verfahren führte, um eine ausreichende Anzahl von Eizellen zu gewährleisten, um ein Baby zu garantieren. Um diese Probleme zu lösen, haben wir kürzlich das In-vitro-Aktivierungsverfahren IVA entwickelt, mit dem wir das frühstadium der Eierstockfollikel stimulieren können, um sich zum präantralen Follikelstadium zu entwickeln. Das ursprüngliche IVA-Verfahren kann das primordiale, primäre und sekundäre Follikelwachstum durch Fragmentierung des Eierstockkortex fördern, was zu einer Störung der Nilpferdsignalübertragung führt.Es folgen zwei Tage Kultivierung mit Akt Signalstimulator. Dieses Verfahren ist für POI-Patienten mit wenigen Restfollikeln geeignet. Dieses Verfahren ist jedoch eine übermäßige Behandlung für patienten mit mehreren sekundären follikeln.Für die Patienten, die einige verbleibende sekundäre Follikel haben, haben wir die Methode namens medikamentenfreie IVA etabliert und bereits die Möglichkeit getestet, das sekundäre Follikelwachstum zu fördern, indem nur der Hippo-Signalweg gestört wird. Wir hatten auch einige erfolgreiche Fälle von Verabreichung durch medikamentenfreie IVA. Wir haben bereits den chirurgischen Eingriff der medikamentenfreien IVA und das Protokoll der folgenden ovariellen Stimulation veröffentlicht.In diesem Video stellen wir die Details der Labormethoden vor, die für eine medikamentenfreie IVA erforderlich sind. Wir rekrutierten die Patienten für eine medikamentenfreie IVA auf der Grundlage der Bologna-Kriterien. Die Patienten könnten mehrere sekundäre Follikel haben.Zunächst wurde ein Teil des Kortex durch Laparoskopie aus einem oder beiden Eierstöcken entfernt. POR-Patienten sind diejenigen, die mittelgroße Eierstöcke hatten. Bei den meisten Patientinnen extrahierten wir nur einen Teil des kortikalen Gewebes ein- oder beidseitig aus den Eierstöcken.Extrahiertes kritisches Gewebe wurde sofort in eine Kulturschale mit Kulturmedium mit HEPES-Puffer übertragen und dieses kleine Gewebe in kleine Würfel zerlegt, um die Signalstörung von Flusspferden zu stören. Details zum Verfahren werden in diesem Video gezeigt. Der Hippo-Signalweg ist unerlässlich, um eine optimale Organgröße aufrechtzuerhalten.Dieser Weg besteht aus mehreren negativen Wachstumsregulatoren. Sobald die Hippo-Signalisierung gestört ist, wird der Phosphorylierungsspiegel von YAP, einem der negativen Wachstumsregulatoren, die in einer Kinasekaskade wirken, verringert und der nukleare YAP-Spiegel erhöht. YAP wirkt in Zusammenarbeit mit TEAD-Transkriptionsfaktoren, um den nachgelagerten CCN-Wachstumsfaktor zu erhöhen.Auf der anderen Seite ist die Aktinpolymerisation von kugelförmig wirkendem G-Aktin zur filamentösen Form, F-Aktin, wichtig für die Aufrechterhaltung der Zellform und die Fortbewegung. Zuvor berichtete Induktion der F-Aktin-Bildung stört die Hippo-Signalübertragung und induziert Überwucherung in menschlichen HeLa-Zellen. Wir berichteten bereits, dass die Ovarialfragmentierung die F-Aktinbildung erhöht und zur Abnahme des Phosphorylierungsniveaus von YAP führt.Es führt zu einer erhöhten Expression des CCN-Wachstumsfaktors. Nach dem Schneiden werden diese Würfel in den verbleibenden Eierstock gepfropft. Dieses Verfahren kann das verbleibende sekundäre Follikelwachstum fördern und zu einer erhöhten Anzahl von reifen Eizellen führen.Die drogenfreie IVA besteht aus vier Schritten. Wir haben bereits das chirurgische Verfahren für medikamentenfreie IVA veröffentlicht. Bitte beachten Sie diese Literatur für die Extraktion des Ovarialkortex und die automatische Transplantation.Hier zeigen wir die detaillierten Verfahren der Labormethoden, die für eine medikamentenfreie IVA erforderlich sind. Im ersten Schritt zeigen wir, wie die Fragmentierung des Eierstockkortex durchgeführt wird. In Schritt zwei zeigen wir, wie man die kortikalen Eierstockwürfel zur Transplantation in das Gerät lädt, Hier werde ich die Fragmentierung des Ovarialkortex zeigen.Diese Studie wurde von der Ethikkommission unseres Instituts genehmigt und alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem Ethikkodex des Weltärztebundes durchgeführt. Fragmentierung des Ovarialkortex. Die folgenden Werkzeuge sind für diesen Schritt erforderlich: eine Schale, sterile Gaze, eine feine Schere, eine feine Zette und ein Skalpell.Normalerweise verwenden wir diese Art von Schüssel und sterile Gaze, aber auch andere Produkte wie Petrischale aus Kunststoff, Glasschale usw. können für dieses Verfahren geeignet sein, und jede Art von steriler Gaze ist ebenfalls geeignet. Wir empfehlen jedoch dringend die Verwendung dieser Form von Zette und Skalpell. Verwenden Sie außerdem die Kochplatte, um die Temperatur des Geschirrs mit Taschentüchern aufrechtzuerhalten Legen Sie es unter den sterilen Vorhang.Kortikales Gewebe wird sofort in die Schale übertragen, die mHTF enthält. Machen Sie ein Bild mit dem Namen des Patienten, um es mit den Daten des Patienten zu korrelieren. Notieren Sie die Größe, Dicke und den Zustand des Gewebes.Entfernen Sie restliches Medulla-Gewebe. Vor der Gewebefragmentierung das Medulla-Gewebe entfernen. Legen Sie den Kortex auf die sterile Gaze.Wie im Video gezeigt, ist die Gaze mit Medium befeuchtet. Tragen Sie während dieses Verfahrens das Medium mit einer Einwegpipette auf, bevor die Oberfläche des Kortex ausgetrocknet ist. Restgewebe mit einer Mikroschere entfernen, bis die Dicke ein bis zwei Millimeter erreicht.Bei POR-Patienten befinden sich sekundäre Follikel tiefer als einen Millimeter von der Kortexoberfläche entfernt, so dass die Gewebe nicht weniger als einen Millimeter dick sind. Schneiden Sie eine Seite des Kortex jedes Gewebes in einen Streifen, der einen mal fünf Millimeter misst, um histologische Analysen durchzuführen, um das Vorhandensein von Restfollikeln zu bestimmen. Diesen Streifen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit Kulturmedium geben und bis zur Fixierung bei vier Grad Celsius aufbewahren.Vorbereitung von kortikalen Eierstockwürfeln. Nach der Entfernung von Medulla-Gewebe wird der kortikale Eierstock für eine Störung der Nilpferdsignalisierung fragmentiert. Schneiden Sie den Kortex zunächst mit einem Skalpell in einen nach dem anderen mal 10 Millimeter großen Streifen.Dann schneiden Sie diese Streifen in einen Millimeter gewürfelte kleine Würfel. Im Medium ist das Gewebe rutschig und schwer zu schneiden. Für ein einfaches Schneiden schneiden Sie die Streifen, indem Sie auf das Skalpell drücken, anstatt daran zu ziehen.Zählen Sie nach dem Schneiden die Anzahl der Würfel und bereiten Sie die automatische Veredelung vor. Um die Veränderungen des osmotischen Drucks im Medium zu vermeiden, fügen Sie das Medium in Maßen hinzu, bevor Sie das Gewebe automatisch transplantieren. Für die automatische Transplantation von Eierstöcken ermöglicht die Verwendung eines kanülenförmigen Geräts eine einfachere Beladung.Dieser Schritt besteht aus zwei Schritten. Zuvor wurden Eierstockfragmente nacheinander mit einer Zette unter Laparoskopie transplantiert. Es dauerte jedoch etwa drei bis vier Stunden, bis die Operation abgeschlossen war.Bei diesem Verfahren verwenden wir ein kanpuläres Gerät aus einer Innenspritze und einem Außenzylinder. Dies ist eine einfache Form und leicht. Darüber hinaus hat die Spitze dieses Geräts eine runde Form.Es gibt keine scharfen Punkte, die Schäden an der Transplantationsstelle vermeiden. Die Verwendung dieser Art von Gerät ermöglicht es, bis zu 20 bis 30 Würfel gleichzeitig zur Implantationsstelle zu bringen. Dies führt zu einer effizienten Transplantation und Verkürzung der Operationszeit.Laden von kortikalen Fragmenten der Eierstöcke. Vorbereitung von IVA-Kanüle. Bereiten Sie die IVA-Kanüle vor und waschen Sie dieses Gerät in mHTF.Wiederholen Sie das Absaug- und Austragsmedium mehrmals. Füllen Sie die Spitze eines Kanpuliers, indem Sie etwa 100 Mikroliter des Mediums absaugen. Dadurch soll vermieden werden, dass sich die Würfel während der Beladung von Gewebefragmenten herausziehen.Laden kortikaler Würfel. Wählen Sie einen Würfel mit einer feinen Zette und legen Sie ihn in die Spitze des Kanstells. Die Anzahl der automatisch transplantierten Würfel hängt von der Größe der Transplantationsstelle ab.Wiederholen Sie das Laden der Cubes nacheinander, bis Sie die Zielzahl erreicht haben. Nachdem Sie die Würfel geladen haben, geben Sie die Kanüle vorsichtig an den Chirurgen weiter. Wenn die Transplantatstelle nicht fertig ist, ist der Teil des Kanpuliers, der Eierstockwürfel enthält, mit den Fingern zu berühren, um eine Abnahme der Temperatur der Würfel zu vermeiden.Wir haben bereits über die klinischen Ergebnisse der medikamentenfreien IVA berichtet. Bitte beachten Sie das veröffentlichte Papier über klinische Ergebnisse. Dieses Laborprotokoll benötigte für einen Patienten 30 bis 50 Minuten.Die durchschnittliche Zeit beträgt 10 bis 20 Minuten für die Fragmentierung des Eierstockkortex und 20 bis 30 Minuten für das Laden dieser Fragmente in die IVA-Kanüle. Dies hängt von der Gewebegröße ab, aber fast alle Patienten können in dieser durchschnittlichen Zeit fertig sein. Schlüsse. Die medikamentenfreie IVA ist ein neuer Ansatz der Unfruchtbarkeitsbehandlung für POR-Patientinnen mit abnehmender ovarieller Reserve.Dieses Laborprotokoll führt sowohl zur Reduzierung der für die Operation erforderlichen Zeit als auch des Verlusts von Fragmenten während der Transplantation. Die Labortechnik der medikamentenfreien IVA könnte die Grundlage für die zukünftige Anwendung der Eierstockgewebekultur werden, um reife Eizellen ohne Transplantation zu erhalten.

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