Name: fertility preservation in patients with severe ovarian dysfunction
Uploaded: 2021-03-25T13:00:00
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Agradecemos a Tatsuji Ihana, Sachiyo Kurimoto, Kazuko Takahasih, Yuki Yoshizawa, Maho Arashi, Kentaro Fujita, Erina Kudo, Yuka Kurimoto y Mayuko Wakatsuki por apoyar el procedimiento de IVA libre de drogas y al Prof. Aaron J.W. Hsueh (Stanford University School of Medicine, Stanford, CA) por la lectura crítica y edición del manuscrito. También agradecemos a Rebecca Truman y Gregory Truman por insertar la narración en inglés. Este estudio fue apoyado por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS), la Investigación Científica B (19H03801) y la Investigación Exploratoria Desafiante (18K19624).

El consentimiento informado escrito fue obtenido de cada paciente del POR con la reserva ovárica decreciente que alistó en el tratamiento droga-libre del IVA. Este estudio fue aprobado por el comité ético de la Universidad Internacional de Salud y Bienestar (No. 17-S-21). El ensayo clínico se registró con el número UMIN000034464 y se llevó a cabo de acuerdo con el Código de Ética de la Asociación Médica Mundial (Declaración de Helsinki).
1. Extracción de la corteza ovárica
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	<li>Liang, T., Motan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+Oocyte+Cryopreservation+for+Fertility+Preservation.">Mature Oocyte Cryopreservation for Fertility Preservation.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 951, 155-161 (2016).</li><li>Yoon, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+births+after+vitrification+of+oocytes+in+a+stimulated+in+vitro+fertilization-embryo+transfer+program.">Live births after vitrification of oocytes in a stimulated in vitro fertilization-embryo transfer program.</a> Fertility and Sterility. 79 (6), 1323-1326 (2003).</li><li>Donnez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Livebirth+after+orthotopic+transplantation+of+cryopreserved+ovarian+tissue.">Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue.</a> Lancet. 364 (9443), 1405-1410 (2004).</li><li>Meirow, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pregnancy+after+transplantation+of+cryopreserved+ovarian+tissue+in+a+patient+with+ovarian+failure+after+chemotherapy.">Pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a patient with ovarian failure after chemotherapy.</a> New England Journal of Medicine. 353 (3), 318-321 (2005).</li><li>De Vos, M., Devroey, P., Fauser, B. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESHRE+consensus+on+the+definition+of+'poor+response'+to+ovarian+stimulation+for+in+vitro+fertilization:+the+Bologna+criteria.">ESHRE consensus on the definition of 'poor response' to ovarian stimulation for in vitro fertilization: the Bologna criteria.</a> Human Reproduction. 26 (7), 1616-1624 (2011).</li><li>Huhtaniemi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+Molecular+Pathophysiology,+Genetics,+and+Treatment+of+Primary+Ovarian+Insufficiency.">Advances in the Molecular Pathophysiology, Genetics, and Treatment of Primary Ovarian Insufficiency.</a> Trends in Endocrinology and Metabolism. 29 (6), 400-419 (2018).</li><li>M&#281;czekalski, B., Maciejewska-Jeske, M., Podfigurna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproduction+in+premature+ovarian+insufficiency+patients+-+from+latest+studies+to+therapeutic+approach.">Reproduction in premature ovarian insufficiency patients - from latest studies to therapeutic approach.</a> Prz Menopauzalny. 17 (3), 117-119 (2018).</li><li>Baker, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+plans+and+family-building+options+for+women+with+primary+ovarian+insufficiency.">Life plans and family-building options for women with primary ovarian insufficiency.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 29 (4), 362-372 (2011).</li><li>Englert, Y., Govaerts, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+donation:+particular+technical+and+ethical+aspects.">Oocyte donation: particular technical and ethical aspects.</a> Human Reproduction. 13, 90-97 (1998).</li><li>Englert, Y., Rodesch, C., Laruelle, C., Govoerts, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+donation:+ethical+aspects+related+to+the+donor.">Oocyte donation: ethical aspects related to the donor.</a> Contraception, Fertilite, Sexualite. 25 (3), 251-257 (1997).</li><li>Storgaard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Obstetric+and+neonatal+complications+in+pregnancies+conceived+after+oocyte+donation:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Obstetric and neonatal complications in pregnancies conceived after oocyte donation: a systematic review and meta-analysis.</a> BJOG: An International Journal of Obstetrics and Gynaecology. 124 (4), 561-572 (2017).</li><li>Storgaard, M., Malchau, S., Loft, A., Larsen, E., Pinborg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+donation+is+associated+with+an+increased+risk+of+complications+in+the+pregnant+woman+and+the+fetus.">Oocyte donation is associated with an increased risk of complications in the pregnant woman and the fetus.</a> Ugeskrift for Laeger. 179 (11), (2017).</li><li>Kawamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo+signaling+disruption+and+Akt+stimulation+of+ovarian+follicles+for+infertility+treatment.">Hippo signaling disruption and Akt stimulation of ovarian follicles for infertility treatment.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17474-17479 (2013).</li><li>Hsueh, A. 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J., Kawamura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+approaches+of+drug-free+in+activation+and+laparoscopic+ovarian+incision+to+treat+patients+with+ovarian+infertility.">Surgical approaches of drug-free in activation and laparoscopic ovarian incision to treat patients with ovarian infertility.</a> Fertility and Sterility. , (2020).</li><li>Kawamura, K., Ishizuka, B., Hsueh, A. J. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Ovarian+Insufficiency.">Primary Ovarian Insufficiency.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 34 (4), 230-234 (2016).</li><li>Grynberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertility+preservation+in+Turner+syndrome.">Fertility preservation in Turner syndrome.</a> Fertility and Sterility. 105 (1), 13-19 (2016).</li><li>Tomao, F., Spinelli, G. P., Panici, P. B., Frati, L., Tomao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+function,+reproduction+and+strategies+for+fertility+preservation+after+breast+cancer.">Ovarian function, reproduction and strategies for fertility preservation after breast cancer.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 76 (1), 1-12 (2010).</li><li>Kim, S., Lee, Y., Lee, S., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+tissue+cryopreservation+and+transplantation+in+patients+with+cancer.">Ovarian tissue cryopreservation and transplantation in patients with cancer.</a> Obstetrics &amp; Gynecology Science. 61 (4), 431-442 (2018).</li><li>Donnez, J., Dolmans, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+tissue+freezing:+current+status.">Ovarian tissue freezing: current status.</a> Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. 27 (3), 222-230 (2015).</li><li>Wu, R. C., Kuo, P. L., Lin, S. J., Liu, C. H., Tzeng, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+chromosome+mosaicism+in+patients+with+recurrent+abortion+or+premature+ovarian+failure.">X chromosome mosaicism in patients with recurrent abortion or premature ovarian failure.</a> Journal of the Formosan Medical Association. 92 (11), 953-956 (1993).</li><li>De Munck, N., Vajta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+efficiency+of+oocyte+vitrification.">Safety and efficiency of oocyte vitrification.</a> Cryobiology. 78, 119-127 (2017).</li><li>Argyle, C. E., Harper, J. C., Davies, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+cryopreservation:+where+are+we+now.">Oocyte cryopreservation: where are we now.</a> Human Reproduction Update. 22 (4), 440-449 (2016).</li></ol>

En este manuscrito, mostramos un protocolo detallado del laboratorio para el IVA droga-libre. El IVA libre de fármacos es un nuevo enfoque de tratamiento de la infertilidad para pacientes con POR con reserva ovárica decreciente para promover el crecimiento de los folículos secundarios, lo que resulta en el rendimiento de ovocitos más maduros después de la estimulación ovárica y el aumento en el embarazo exitoso20. En 15 pacientes del POR con la reserva ovárica decreciente, este acercamient...

La función ovárica disminuye progresivamente durante el envejecimiento y algunas condiciones patofisiológicas incluyendo anormalidad del karyotype, enfermedades autoinmunes, chemo- y radioterapias, y cirugías ováricas. La preservación de la fertilidad es una de las mejores opciones para que las mujeres solteras con disfunción ovárica grave preserven su potencial para el embarazo futuro. Para la preservación de la fertilidad, actualmente hay dos métodos disponibles principalmente en el campo de la oncofertilidad. La criopreservación de ovocitos es un procedimiento bien establecido para la preservación de la fertilidad y se han reportado muchos casos exitosos1,2. Por otro lado, la criopreservación del tejido ovárico también se estableció para la preservación de la fertilidad en pacientes con cáncer, pero sigue siendo una estrategia experimental3,4. En ambos métodos, se necesitan múltiples números de ovocitos maduros para que ocurra el embarazo. En general, las pacientes con insuficiencia ovárica prematura (POI), que se convierten en amenorrea antes de los 40 años de edad, y las mujeres de mediana edad con baja reserva ovárica mostraron una respuesta ovárica deficiente (POR) a la estimulación ovárica para la producción de ovocitos maduros5,6,7. Además, las pacientes jóvenes con un bajo número de folículos antrales también mostraron POR a la estimulación ovárica7. Estas pacientes tienen un número muy limitado de ovocitos recuperables incluso después de la hiperestimulación ovárica adecuada, lo que requiere múltiples procedimientos costosos para garantizar un número suficiente de ovocitos para el embarazo.
La donación de ovocitos seguida de la fecundación in vitro (FIV) con espermatozoides del marido y la transferencia de embriones (TE) es la única opción para estas pacientes de POI y POR que tienen dificultades para obtener sus propiosovocitos 8,9,10. Sin embargo, la donación de ovocitos se complica por cuestiones éticas, así como por complicaciones autoinmunes y del embarazo11,12,13,14. Para resolver estos problemas, se desea el establecimiento de un tratamiento de infertilidad utilizando los propios ovocitos de los pacientes. Para las pacientes con POI, hemos desarrollado el enfoque de activación in vitro (IVA) para permitir el crecimiento exitoso del folículo y la generación de ovocitos maduros, liderando una serie de embarazos y partos15. En IVA, fragmentamos las cortezas ováricas después de la extracción de ovarios bajo cirugía laparoscópica y los cultivamos durante dos días para activar folículos mediante fármacos estimulantes de Akt y luego realizar injertos heterotópicos de nuevo en bolsas artificiales hechas debajo de la serosa de las trompas de Falopio bajo segunda cirugía laparoscópica15. Este procedimiento promovió el crecimiento de folículos primordiales, primarios y secundarios después de la fragmentación de la corteza ovárica para promover la interrupción de la señalización de hipopótamo16,seguido de dos días de cultivo con estimuladores de señalización Akt17.
En contraste con casos severos del POI, los pacientes del POR con la reserva ovárica disminuida tienen folículos secundarios múltiples. Debido a que la interrupción de la señalización de hipopótamos por sí sola es eficaz en la promoción del crecimiento del folículo secundario16,recientemente demostramos embarazos y partos exitosos para pacientes con POR utilizando el procedimiento IVA libre de drogas que implica fragmentación cortical e injerto ortotópico sin tratamiento de los fármacos estimulantes Akt. El IVA libre de drogas estimula la etapa temprana de los folículos ováricos para que se desarrollen a la etapa del folículo preantral después de una sola cirugía y aumenta el número de ovocitos recuperados para la transferencia de embriones deFIV 15,18. El acercamiento droga-libre del IVA tiene varias ventajas con respecto a nuestro IVA original por 1) evitando pérdida potencial del folículo durante cultura, 2) minimizando invasividad y costes de la segunda cirugía, 3) implicando solamente resto de cama a corto plazo de la poste-cirugía y 4) potencial del embarazo espontáneo debido al injerto orthotopic. Recientemente publicamos un video artículo que muestra los procedimientos quirúrgicos del IVA libre de drogas19 y los protocolos detallados de estimulación ovárica después de la cirugía20. Aquí, presentamos los detalles de los métodos de laboratorio requeridos para el IVA libre de drogas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4.5 onz specimen container</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>354013</td>
			<td>Other products may also be suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60mm dish</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>351007</td>
			<td>Other products may also be suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 x 50 cm sterile drape</td>
			<td>HOGY Medical</td>
			<td>SR-823</td>
			<td>Any type of sterile produsts may also be suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable pippete</td>
			<td>FALCON</td>
			<td>357575</td>
			<td>Other products may also be suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors, Curved</td>
			<td>WPI</td>
			<td>#14224-G</td>
			<td>Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hot plate</td>
			<td>TOKAI HIT</td>
			<td>TPiE-SP</td>
			<td>Use at operation room to maintain the temperature of dishes containing ovarian tissue before transplantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Serum Albumin Solution</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>9988</td>
			<td>Medium for handling ovarian tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVA cannule</td>
			<td>KITAZATO</td>
			<td>446030 IVA-6030E</td>
			<td>Specific cannula for tissue autografting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAI medical Disposable scalpel</td>
			<td>WPI</td>
			<td>#5 10-A</td>
			<td>Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro scissors, Curved</td>
			<td>WPI</td>
			<td>#503364</td>
			<td>Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified HTF Medium-HEPES</td>
			<td>Irvine Scientific</td>
			<td>90126</td>
			<td>Medium for handling ovarian tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gauze</td>
			<td>Osaki Medical</td>
			<td>15004</td>
			<td>Any type of sterile produsts may also be suitable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Tweezers, Curved Tips</td>
			<td>KAI</td>
			<td>#504505</td>
			<td>Although other products may also be suitable, we strongly recommend use this products</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fertility preservation in patients with severe ovarian dysfunction

La función ovárica disminuye progresivamente durante el envejecimiento y en algunas condiciones fisiopatológicas, incluyendo anomalías del cariotipo, enfermedades autoinmunes, quimio y radioterapias, así como cirugías ováricas. En mujeres solteras con la disfunción ovárica severa, la preservación de la fertilidad es importante para los embarazos futuros. Aunque el cryopreservation del oocyte sea un método establecido para la preservación de la fertilidad, estos pacientes podrían preservar solamente un número limitado de oocytes incluso después de la hiperestimulación ovárica, llevando a los estímulos repetidos para asegurar suficientes ovocitos para garantizar embarazo futuro. Para solucionar este problema, hemos desarrollado recientemente un procedimiento de activación in vitro libre de drogas (IVA), que nos permite estimular las primeras etapas de los folículos ováricos para que se desarrollen a la etapa del folículo preantral. Estos folículos preantrales pueden responder al protocolo único del estímulo de la gonadotropina, dando por resultado el número creciente de ovocitos recuperados por el estímulo ovárico para el cryopreservation. El IVA libre de fármacos se compuso desde el abordaje quirúrgico y la estimulación ovárica. Se extrae una parte de la corteza de uno o ambos ovarios de pacientes sometidos a cirugía laparoscópica. Los tejidos corticales ováricos fueron cortados en pequeños cubos para interrumpir el camino de la señalización del hipopótamo y para estimular el desarrollo de los folículos de la etapa temprana. Estos cubos fueron injertado orthotropically en ovarios restantes así como debajo del serosa de ambos tubos de Falopio. Ya hemos publicado el procedimiento quirúrgico del IVA libre de drogas y el protocolo de estimulación ovárica posterior, pero aquí presentamos los detalles de los métodos de laboratorio requeridos para el IVA libre de drogas.

En la primera publicación del enfoque IVA15,trasplantamos los cubos corticales ováricos uno por uno en los sitios de injerto bajo cirugía laparoscópica(Figura 1A). Porque 100-150 cubos ováricos fueron utilizados, tomó 3-4 horas para el injerto del tejido bajo cirugía laparoscopic. También, algunos cubos ováricos fueron perdidos antes de injertar. Debido a que la cánula IVA podría transferir 20-30 cubos a un sitio de injerto a la vez (Fi...

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Fertility Preservation in Patients with Severe Ovarian Dysfunction

Presentamos los detalles de los procedimientos del laboratorio para la activación in vitro droga-libre (IVA) de los folículos ováricos para los pacientes con la disfunción ovárica severa. Este método podría aumentar el número de ovocitos recuperables por hiperestimulación ovárica y beneficiar la preservación de la fertilidad para esas pacientes.

Preservación de la fertilidad en pacientes con disfunción ovárica grave

Ovarian function progressively declines during aging and in some pathophysiological conditions including karyotype abnormality, autoimmune diseases, ...

El objetivo de esta película es demostrar el procedimiento de nuestro nuevo enfoque a las pacientes con disfunción ovárica. La función ovárica disminuye progresivamente durante el envejecimiento y algunas condiciones fisiopatológicas incluyendo anormalidad del karyotype, enfermedades inmunes auto, quimioterapia y radioterapias, y cirugías ováricas. La mayor parte de mujeres de mediana edad con una reserva ovárica baja mostró respuesta ovárica pobre al estímulo ovárico para rendir los ovocitos maduros.Además, los pacientes jovenes con un número bajo de folículos antrales también demostraron respuesta ovárica pobre al estímulo ovárico. La preservación de la fertilidad es importante ahorrar el OCS potencial para el embarazo futuro. Para la preservación de la fertilidad, el cryopreservation del oocyte fue establecido.Sin embargo, estas pacientes pobres de la respuesta ovárica podrían recuperar un número muy limitado de ovocitos incluso después del estímulo ovárico apropiado, llevando al requisito de procedimientos costosos repetidos para asegurar un número suficiente de ovocitos para garantizar a un bebé. Para resolver estos problemas, recientemente hemos desarrollado la activación in vitro, procedimiento IVA, que nos permite estimular la etapa temprana de los folículos ováricos para que se desarrollen a la etapa del folículo preanual. El procedimiento original del IVA puede promover crecimiento primordial, primario, y secundario del folículo por la fragmentación ovárica de la corteza, llevando a la interrupción de la señalización del hipopótamo.Esto es seguido por dos días de cultivo con estimulador de señalización Akt. Este procedimiento es conveniente para los pacientes del POI con pocos folículos residuales. Sin embargo, este procedimiento es un tratamiento excesivo para los pacientes que tienen folículos secundarios múltiples.Para los pacientes que tienen algunos folículos secundarios residuales, establecimos el método llamado IVA libre de drogas y ya hemos probado la posibilidad de promover el crecimiento del folículo secundario interrumpiendo solamente el camino de la señalización del hipopótamo. También hemos tenido algunos casos exitosos de entrega por IVA libre de drogas. Ya hemos publicado el procedimiento quirúrgico del IVA libre de drogas y el protocolo de seguimiento de la estimulación ovárica.En este video, presentamos los detalles de los métodos de laboratorio requeridos para el IVA libre de drogas. Se reclutaron los pacientes para un IVA libre de fármacos en función de los criterios de Bolonia. Los pacientes podían tener folículos secundarios múltiples.Al principio, parte de la corteza fue quitada de uno o a ambos ovarios por laparoscopia. Los pacientes con POR son aquellos que tenían ovarios de tamaño mediano. En la mayor parte de los pacientes, extrajimos solamente la parte de los tejidos corticales de los ovarios en uno o ambos lados.Los tejidos críticos extraídos fueron transferidos inmediatamente a un plato de cultivo que contenía el medio de cultivo con el almacenador intermediario de HEPES, y diseccionaron este pequeño tejido en los pequeños cubos para la interrupción de la señalización del hipopótamo. Los detalles del procedimiento se mostrarán en este video. La vía de señalización del hipopótamo es esencial para mantener un tamaño óptimo de los órganos.Esta vía consiste en varios reguladores de crecimiento negativos. Una vez que se interrumpe la señalización del hipopótamo, los niveles de fosforilación de YAP, uno de los reguladores negativos del crecimiento que actúan en una cascada de quinasas, se disminuyen y los niveles nucleares de YAP se incrementan. YAP actúa en concierto con los factores transcripcionales TEAD para aumentar el factor de crecimiento ccn aguas abajo.Por otro lado, la polimerización de actina de acción globular, G-actina, a la forma filamentosa, F-actina, es importante para el mantenimiento de la forma celular y la locomoción. La inducción previamente divulgada de la formación de la F-actina interrumpe la señalización del hipopótamo e induce crecimiento excesivo en células humanas de HeLa. Divulgamos previamente la formación ovárica de la F-actina del aumento de la fragmentación, y lleva a la disminución del nivel de fosforilación de YAP.Conduce a una mayor expresión del factor de crecimiento ccn. Después del corte, estos cubos se injertan en el ovario restante. Este procedimiento puede promover el crecimiento del folículo secundario residual y conducir a un mayor número de ovocitos madurados.El IVA libre de drogas consta de cuatro pasos. Ya hemos publicado el procedimiento quirúrgico para el IVA libre de drogas. Refiera por favor a esa literatura para la extracción y el auto-injerto de la corteza ovárica.Aquí mostramos los procedimientos detallados de los métodos de laboratorio requeridos para el IVA libre de drogas. En el primer paso, mostramos cómo se realiza la fragmentación de la corteza ovárica. En el paso dos, mostramos cómo cargar los cubos corticales ováricos en el dispositivo para el trasplante, Aquí, mostraré la fragmentación de la corteza ovárica.Este estudio fue aprobado por el comité ético de nuestro instituto, y todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con el Código de Ética de la Asociación Médica Mundial. Fragmentación de la corteza ovárica. Las siguientes herramientas requeridas para este paso: un plato, gasa estéril, tijeras finas, pinzas finas y bisturí.Por lo general, utilizamos este tipo de plato y gasa estéril, pero otros productos como la placa de Petri de plástico, plato de vidrio, etcétera, también pueden ser adecuados para este procedimiento, y cualquier tipo de gasa estéril también es adecuado. Sin embargo, recomendamos encarecidamente el uso de esta forma de tórceps y bisturí. Además, utilice la placa caliente para mantener la temperatura de los platos que contienen tejidos Coloque debajo de la cortina estéril.Los tejidos corticales se transfieren inmediatamente al plato que contiene mHTF. Tome una foto con el nombre del paciente para correlacionar con los datos del paciente. Registre el tamaño, el grosor y la condición del tejido.Retire el tejido residual de la médula. Antes de la fragmentación del tejido, retire el tejido de la médula. Ponga la corteza en la gasa estéril.Como se muestra en el video, la gasa está humedada con medio. Durante este procedimiento, aplique el medio con una pipeta desechable antes de que la superficie de la corteza se seque. Retire los tejidos residuales con micro tijeras hasta que el espesor alcance de uno a dos milímetros.En pacientes con POR, los folículos secundarios se encuentran a un milímetro de la superficie de la corteza, por lo que no hacen que los tejidos sean inferiores a un milímetro de espesor. Corte un lado de la corteza de cada tejido en una tira que mida uno por uno por cinco milímetros para el análisis histológico para determinar la presencia de folículos residuales. Poner esta tira en tubo de 1,5 mililitros con medio de cultivo y conservar a cuatro grados centígrados hasta su fijación.Preparación de cubos corticales ováricos. Después de la extracción del tejido de la médula, cortical ovárico se fragmenta para la interrupción de la señalización de hipopótamo. Al principio, corte la corteza en tiras de una por una por 10 milímetros usando bisturí.A continuación, cortar estas tiras en un milímetro cubos pequeños en cubos. En el medio, el tejido es resbaladizo y difícil de cortar. Para un corte fácil, corte las tiras presionando hacia abajo sobre el bisturí en lugar de tirando de él.Después del corte, cuente el número de cubos y prepare el autoinjerto. Para evitar los cambios de presión osmótica en el medio, agregue el medio con moderación antes del autoinjerto tisular. Para el autoinjerto ovárico, el uso de un dispositivo en forma de cánula permite una carga más fácil.Este paso contiene dos pasos. Previamente, los fragmentos ováricos fueron trasplantados uno por uno usando el tórceps bajo laparoscopia. Sin embargo, la cirugía tardó entre tres y cuatro horas en completarse.En este procedimiento, utilizamos un dispositivo de forma cannular hecho de una jeringa interna y un cilindro externo. Esta es una forma simple y ligera. Además, la punta de este dispositivo es de forma redonda.No hay puntos agudos que eviten dañar el sitio del trasplante. El uso de este tipo de dispositivo permite llevar hasta 20 a 30 cubos al sitio de implantación a la vez. Esto conduce a un trasplante eficiente y a la reducción del tiempo de cirugía.Carga de fragmentos corticales ováricos. Preparación de cánula IVA. Prepare la cánula IVA y lave este dispositivo en mHTF.Repita el medio aspirado y de descarga varias veces. Llene la punta de un cannular aspirando unos 100 microlitros del medio. Esto es para evitar que los cubos se dibuyeran durante la carga de fragmentos de tejido.Carga de cubos corticales. Coge un cubo con pórceps finos y ponlo en la punta de la cannular. El número de cubos autoinjertado depende del tamaño del sitio del trasplante.Repita la carga de los cubos uno por uno hasta que alcance el número de destino. Después de cargar los cubos, pase la cánula al cirujano con cuidado. Si el sitio de injerto no está listo, la parte de la cannular que contiene cubos ováricos debe ser sostenida por los dedos para evitar una disminución en la temperatura de los cubos.Ya hemos informado de los resultados clínicos del IVA libre de fármacos. Consulte el artículo publicado sobre los resultados clínicos. Este protocolo del laboratorio requirió 30 a 50 minutos para un paciente.El tiempo promedio es de 10 a 20 minutos para la fragmentación de la corteza ovárica, y de 20 a 30 minutos para cargar estos fragmentos en la cánula IVA. Esto depende del tamaño del tejido, pero casi todos los pacientes pueden ser terminados en este tiempo promedio. Conclusiones. El IVA libre de drogas es un nuevo enfoque de tratamiento de la infertilidad para las pacientes con pornografía con disminución de la reserva ovárica.Estos protocolos de laboratorio conducen a la reducción tanto del tiempo necesario para la cirugía como de la pérdida de fragmentos durante el trasplante. La técnica de laboratorio del IVA libre de fármacos podría convertirse en la base de la futura aplicación del cultivo de tejido ovárico para obtener ovocitos maduros sin injerto.

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