Name: a proinflammatory, degenerative organ culture model to simulate early-stage intervertebral disc disease.
Uploaded: 2021-02-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Proinflammatory, Degenerative Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease. at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af AO Foundation og AOSpine International. Babak Saravi modtog stipendium støtte fra den tyske Spine Foundation og den tyske Slidgigt Foundation. Gernot Lang blev støttet af Berta-Ottenstein-programmet for forskere fra avancerede klinikere, Det Sundhedsvidenskabelige Fakultet, Universitetet i Freiburg, Tyskland.

Der blev udført forsøg med kvæghaler fra lokale slagterier. De biologiske materialer, der anvendes i den aktuelle undersøgelse, er taget fra fødekæden og kræver ingen etisk godkendelse i schweizisk og europæisk lovgivning.
1. Dissektion af bovinets intervertebrale skive
<ol><li>Skyl hele halen grundigt med vand fra hanen for at fjerne snavs og hår på overfladen. BEMÆRK: Med intakte, distale ender kan der maksimalt anvendes 9 IVD'er (hale 1-9) pr. hale til forsøgene afhængigt ...

<ol>
	<li>Vos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+incidence,+prevalence,+and+years+lived+with+disability+for+328+diseases+and+injuries+for+195+countries,+1990-2016:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016.">Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).</li><li>Hoy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+global+burden+of+low+back+pain.">Measuring the global burden of low back pain.</a> Best Practice &amp; Research Clinical Rheumatology. 24 (2), 155-165 (2010).</li><li>Thiese, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+low+back+pain+by+anatomic+location+and+intensity+in+an+occupational+population.">Prevalence of low back pain by anatomic location and intensity in an occupational population.</a> BMC Musculoskeletal Disorders. 15 (1), 283 (2014).</li><li>Katz, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumbar+Disc+Disorders+and+Low-Back+Pain:+Socioeconomic+Factors+and+Consequences.">Lumbar Disc Disorders and Low-Back Pain: Socioeconomic Factors and Consequences.</a> The Journal of Bone and Joint Surgery (American). 88, 21 (2006).</li><li>Vlaeyen, J. W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+back+pain.">Low back pain.</a> Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 52 (2018).</li><li>Khan, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+biomarkers+of+low+back+pain+and+disc+degeneration:+a+review:+Biomarkers+of+disc+degeneration+and+back+pain.">Inflammatory biomarkers of low back pain and disc degeneration: a review: Biomarkers of disc degeneration and back pain.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1410 (1), 68-84 (2017).</li><li>Kim, H. S., Wu, P. H., Jang, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumbar+Degenerative+Disease+Part+1:+Anatomy+and+Pathophysiology+of+Intervertebral+Discogenic+Pain+and+Radiofrequency+Ablation+of+Basivertebral+and+Sinuvertebral+Nerve+Treatment+for+Chronic+Discogenic+Back+Pain:+A+Prospective+Case+Series+and+Review+of+Literature.">Lumbar Degenerative Disease Part 1: Anatomy and Pathophysiology of Intervertebral Discogenic Pain and Radiofrequency Ablation of Basivertebral and Sinuvertebral Nerve Treatment for Chronic Discogenic Back Pain: A Prospective Case Series and Review of Literature.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1483 (2020).</li><li>Adams, M. A., Roughley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+Intervertebral+Disc+Degeneration,+and+What+Causes+It.">What is Intervertebral Disc Degeneration, and What Causes It.</a> Spine. 31 (18), 2151-2161 (2006).</li><li>Wu, P. H., Kim, H. S., Jang, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intervertebral+Disc+Diseases+Part+2:+A+Review+of+the+Current+Diagnostic+and+Treatment+Strategies+for+Intervertebral+Disc+Disease.">Intervertebral Disc Diseases Part 2: A Review of the Current Diagnostic and Treatment Strategies for Intervertebral Disc Disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2135 (2020).</li><li>Lurie, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+Versus+Nonoperative+Treatment+for+Lumbar+Disc+Herniation:+Eight-Year+Results+for+the+Spine+Patient+Outcomes+Research+Trial.">Surgical Versus Nonoperative Treatment for Lumbar Disc Herniation: Eight-Year Results for the Spine Patient Outcomes Research Trial.</a> Spine. 39 (1), 3-16 (2014).</li><li>Risbud, M. V., Shapiro, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cytokines+in+intervertebral+disc+degeneration:+pain+and+disc+content.">Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content.</a> Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).</li><li>Ponnappan, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organ+culture+system+to+model+early+degenerative+changes+of+the+intervertebral+disc.">An organ culture system to model early degenerative changes of the intervertebral disc.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 13 (5), 171 (2011).</li><li>O'Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Animals+Used+in+Disc+Research+to+Human+Lumbar+Disc+Geometry.">Comparison of Animals Used in Disc Research to Human Lumbar Disc Geometry.</a> Spine. 32 (3), 328-333 (2007).</li><li>Stannard, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+whole+organ+culture+model+for+intervertebral+disc+disease.">Development of a whole organ culture model for intervertebral disc disease.</a> Journal of Orthopaedic Translation. 5, 1-8 (2016).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+ex-vivo+Testing+of+Anti-inflammatory+Drugs+in+a+Bovine+Intervertebral+Degenerative+Disc+Model.">Preclinical ex-vivo Testing of Anti-inflammatory Drugs in a Bovine Intervertebral Degenerative Disc Model.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 583 (2020).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+ex+vivo+cavity+model+to+study+repair+strategies+in+loaded+intervertebral+discs.">Development of an ex vivo cavity model to study repair strategies in loaded intervertebral discs.</a> European Spine Journal. 25 (9), 2898-2908 (2016).</li><li>Kazezian, Z., Li, Z., Alini, M., Grad, S., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+hyaluronic+acid+down-regulates+interferon+signaling+molecules,+IGFBP3+and+IFIT3+in+the+bovine+intervertebral+disc.">Injectable hyaluronic acid down-regulates interferon signaling molecules, IGFBP3 and IFIT3 in the bovine intervertebral disc.</a> Acta Biomaterialia. 52, 118-129 (2017).</li><li>Caprez, S., Menzel, U., Li, Z., Grad, S., Alini, M., Peroglio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+high-quality+RNA+from+intervertebral+disc+tissue+via+pronase+predigestion+and+tissue+pulverization.">Isolation of high-quality RNA from intervertebral disc tissue via pronase predigestion and tissue pulverization.</a> JOR Spine. 1 (2), 1017 (2018).</li><li>Lopa, S., Ceriani, C., Cecchinato, R., Zagra, L., Moretti, M., Colombini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+housekeeping+genes+in+human+intervertebral+disc,+endplate+and+articular+cartilage+cells+in+multiple+conditions+for+reliable+transcriptional+analysis.">Stability of housekeeping genes in human intervertebral disc, endplate and articular cartilage cells in multiple conditions for reliable transcriptional analysis.</a> European Cells &amp; Materials. 31, 395-406 (2016).</li><li>Lang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intervertebral+disc+whole+organ+culture+system+to+investigate+proinflammatory+and+degenerative+disc+disease+condition.">An intervertebral disc whole organ culture system to investigate proinflammatory and degenerative disc disease condition.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2051-2061 (2018).</li><li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+intervertebral+disc+cell+and+organ+culture+models+induced+by+tumor+necrosis+factor+alpha.">Proinflammatory intervertebral disc cell and organ culture models induced by tumor necrosis factor alpha.</a> JOR Spine. 3, 1104 (2020).</li><li>Purmessur, D., Walter, B. A., Roughley, P. J., Laudier, D. M., Hecht, A. C., Iatridis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+TNF&#945;+in+intervertebral+disc+degeneration:+A+non-recoverable+catabolic+shift.">A role for TNF&#945; in intervertebral disc degeneration: A non-recoverable catabolic shift.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 433 (1), 151-156 (2013).</li><li>Walter, B. A., Likhitpanichkul, M., Illien-Junger, S., Roughley, P. J., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF&#945;+Transport+Induced+by+Dynamic+Loading+Alters+Biomechanics+of+Intact+Intervertebral+Discs.">TNF&#945; Transport Induced by Dynamic Loading Alters Biomechanics of Intact Intervertebral Discs.</a> PLOS One. 10 (3), 0118358 (2015).</li><li>Gullbrand, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+animal+model+that+recapitulates+the+spectrum+of+human+intervertebral+disc+degeneration.">A large animal model that recapitulates the spectrum of human intervertebral disc degeneration.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 25 (1), 146-156 (2017).</li><li>Willems, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+intradiscal+injection+and+biocompatibility+of+polyester+amide+microspheres+in+a+canine+model+predisposed+to+intervertebral+disc+degeneration:+intradiscal+application+of+pea+microspheres.">Safety of intradiscal injection and biocompatibility of polyester amide microspheres in a canine model predisposed to intervertebral disc degeneration: intradiscal application of pea microspheres.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 105 (4), 707-714 (2017).</li><li>Michalek, A. J., Buckley, M. R., Bonassar, L. J., Cohen, I., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+needle+puncture+injury+on+microscale+shear+strain+in+the+intervertebral+disc+annulus+fibrosus.">The effects of needle puncture injury on microscale shear strain in the intervertebral disc annulus fibrosus.</a> The Spine Journal. 10 (12), 1098-1105 (2010).</li><li>Illien-J&#252;nger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combined+effects+of+limited+nutrition+and+high-frequency+loading+on+intervertebral+discs+with+endplates.">The combined effects of limited nutrition and high-frequency loading on intervertebral discs with endplates.</a> Spine. 35 (19), 1744-1752 (2010).</li><li>Gantenbein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+culture+bioreactors--platforms+to+study+human+intervertebral+disc+degeneration+and+regenerative+therapy.">Organ culture bioreactors--platforms to study human intervertebral disc degeneration and regenerative therapy.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therapy. 10 (4), 339-352 (2015).</li><li>Boubriak, O. A., Watson, N., Sivan, S. S., Stubbens, N., Urban, J. P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+regulating+viable+cell+density+in+the+intervertebral+disc:+blood+supply+in+relation+to+disc+height.">Factors regulating viable cell density in the intervertebral disc: blood supply in relation to disc height.</a> Journal of Anatomy. 222 (3), 341-348 (2013).</li><li>Maroudas, A., Stockwell, R. A., Nachemson, A., Urban, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+involved+in+the+nutrition+of+the+human+lumbar+intervertebral+disc:+cellularity+and+diffusion+of+glucose+in+vitro.">Factors involved in the nutrition of the human lumbar intervertebral disc: cellularity and diffusion of glucose in vitro.</a> Journal of Anatomy. 120, 113-130 (1975).</li><li>Beckstein, J. C., Sen, S., Schaer, T. P., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Animal+Discs+Used+in+Disc+Research+to+Human+Lumbar+Disc:+Axial+Compression+Mechanics+and+Glycosaminoglycan+Content.">Comparison of Animal Discs Used in Disc Research to Human Lumbar Disc: Axial Compression Mechanics and Glycosaminoglycan Content.</a> Spine. 33 (6), 166-173 (2008).</li><li>Walter, B. A., Illien-J&#252;nger, S., Nasser, P. R., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+bioreactor+system+for+dynamic+loading+and+mechanical+characterization+of+whole+human+intervertebral+discs+in+organ+culture.">Development and validation of a bioreactor system for dynamic loading and mechanical characterization of whole human intervertebral discs in organ culture.</a> Journal of Biomechanics. 47 (9), 2095-2101 (2014).</li><li>Rajan, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-Like+Receptor+4+(TLR4)+Expression+and+Stimulation+in+a+Model+of+Intervertebral+Disc+Inflammation+and+Degeneration.">Toll-Like Receptor 4 (TLR4) Expression and Stimulation in a Model of Intervertebral Disc Inflammation and Degeneration.</a> Spine. 38 (16), 1343-1351 (2013).</li><li>vanden Akker, G. G., Rorije, A. J., Davidson, E. N. B., vander Kraan, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+marker+genes+distinguish+inner+and+outer+annulus+fibrosus+from+nucleus+pulposus+tissue+in+the+bovine+intervertebral+disc.">Phenotypic marker genes distinguish inner and outer annulus fibrosus from nucleus pulposus tissue in the bovine intervertebral disc.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 25, 402 (2017).</li><li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cell+phenotype+induction+with+TGF-&#946;1+and+collagen-polyurethane+scaffold+for+annulus+fibrosus+rupture+repair.">Functional cell phenotype induction with TGF-&#946;1 and collagen-polyurethane scaffold for annulus fibrosus rupture repair.</a> European Cells &amp; Materials. 39, 1-17 (2020).</li><li>Risbud, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+phenotype+of+young+healthy+nucleus+pulposus+cells:+recommendations+of+the+Spine+Research+Interest+Group+at+the+2014+annual+ORS+meeting.">Defining the phenotype of young healthy nucleus pulposus cells: recommendations of the Spine Research Interest Group at the 2014 annual ORS meeting.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 33 (3), 283-293 (2015).</li></ol>

Vi leverede her en detaljeret protokol til at simulere degenerativ og inflammatorisk IVDD. Denne protokol kan anvendes til detaljerede undersøgelser af inflammatoriske veje, der fører til de destruktive virkninger på disken. Desuden kan protokollen bidrage til at bestemme lovende terapeutiske mål, der er involveret i sygdommens progression.
Vi har for nylig vist, at human rekombinant TNF-α kunne fremkalde betændelse i både kvæg og humane NP celler21, som er i ov...

Lbp (Low Back Pain) kan påvirke personer i alle aldre og er en af de vigtigste årsager til handicap på verdensplan1,2,3. De samlede omkostninger forbundet med LBP overstiger 100 mia. Symptomatisk intervertebrale disk (IVD) degeneration (IDD), en tilstand karakteriseret ved betændelse og vævsforringelse, er en væsentlig årsag til LBP6,7. Specifikt er IDD karakteriseret ved en gradvist udviklende nedbrydning af IVD's ekstracellulære matrix (ECM), induceret og udløst af flere faktorer, der fører til en accelereret patologi, neurologiske lidelser og i sidste ende handicap. Desuden er IDD forbundet med frigivelsen af proinflammatoriske cytokiner, ændrede rygsøjlebiomekanik, angiogenese og nerveindvækst, hvilket øger smertefornemmelse, der helt forårsager kronisk LBP (aktiv discopati)6,8. Til dato omfatter behandlingsmuligheder discektomi og efterfølgende fusion af de tilstødende hvirvler, implantation af en IVD-protese eller ikke-kirurgiske tilgange, såsom ikke-steroide antiinflammatoriske lægemidler, opioider og muskelafslappende midler til patienter med IDD9. Begge nuværende standard terapeutiske muligheder, kirurgiske og ikke-kirurgiske, er kun delvist effektive og undlader at løse det underliggende biologiske problem9,10. Tidlig degenerativ disk disease er karakteriseret ved en indledende inflammatorisk vævsrespons, især en stigning i tumornekrosefaktor-alpha (TNF-alpha) udtryk11. Disse tidlige diskændringer sker primært på celleniveau uden at forstyrre diskarkitekturen og kan tidligere efterlignes af ernæringsmæssig mangel under proinflammatoriske tilstande12. Derfor er præcis simulering af in vivo-situationen for at undersøge disse degenerationsmekanismer og finde passende terapeutiske mål afgørende. Derudover spiller diskens mekaniske belastningsmiljø en central rolle i patologiske og fysiologiske ændringer af IVD. Derfor ville en kombination af disse tilgange bringe os et skridt fremad for at efterligne det komplekse mikromiljø af ivds in vivo. Der er i øjeblikket ingen undersøgelser i betragtning af aspektet af dynamisk belastning sammen med de proinflammatoriske og ernæringsmæssige omgivelser efter vores bedste viden.
Selv om store dyremodeller gør det muligt at undersøge potentielle relevante in vivo-interaktioner, er de dyre og arbejdsintensive. Da brugen af dyremodeller i forskning længe har været genstand for kontroverser, er reduktionen af antallet af dyr, der er nødvendige for at besvare vigtige forskningsspørgsmål, af stor interesse. Endelig er der i øjeblikket ingen ideel dyremodel til at efterligne IDD i IVD forskning13,14. Derfor er det nødvendigt at etablere en omkostningseffektiv og pålidelig udskiftning, såsom en organkulturmodel for at simulere IDD og tilknyttede inflammatoriske og degenerative processer. For nylig gav anvendelsen af denne protokol om oprettelse af en proinflammatorisk og degenerativ organkulturmodel til simulerer tidlig intervertebrale disk disease os mulighed for at undersøge effekten af antiinflammatoriske lægemidler i IDD-organkulturen15.
Her beskriver vi, hvordan man opnår kvæg intervertebral diske og fremkalde tilstanden af tidlige fase IDD via en katabolsk og proinflammatorisk mikromiljø forårsaget af direkte intradiscal injektion af tumor nekrose faktor-alpha (TNF-α) og degenerativ belastning i en bioreaktor under lav næringsrige medium betingelser. Figur 1 illustrerer forsøgsmodellen og viser den bioreaktor, der anvendes til at simulere degenerative og fysiologiske belastningsforhold.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62100/62100fig01.jpg"> Figur 1: Illustration af den eksperimentelle opsætning. A: kvæghale; B: dissekeret mellemdiske diske af kvæg; C: overførsel af skiven til en brøndplade med dyrkningsmedium; D: indlæsning af simuleringen i en bioreaktor E: intradiscal injektionsteknik; F: IVD efter injektion af PBS/trypan blå farvestof for at afsløre distributionen. IDD: intervertebral disk degeneration. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62100/62100fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Bromo-3-chloropropane(BCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>B9673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate-2-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band saw</td>
			<td>Exakt Apparatebau, Norderstedt, Germany</td>
			<td>model 30/833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Munndipharma, Frankfurt, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine IL-8 Do.it-Yourself ELISA</td>
			<td>Kingfisher Biotech, St. Paul, USA</td>
			<td>DIY1028B-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning ITS Premix</td>
			<td>Corning Inc., New York, USA</td>
			<td>354350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Gibco by life technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>10741574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>Gibco by life technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>11564446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol for molecular biology</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>09-0851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco by life technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>A4766801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acid solution</td>
			<td>Gibco by life technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin(P/S)</td>
			<td>gibco by life technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>11548876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution, tablet</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>10165921001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen, Sandiego, USA</td>
			<td>ant-pm-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulsavac Jet Lavage System</td>
			<td>Zimmer, IN,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>Quiagen, Venlo, Netherlands</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidinn-HRP</td>
			<td>Kingfisher Biotech, St. Paul, USA</td>
			<td>AR0068-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript VILO</td>
			<td>Invitrogen by life Technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>10704274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td>10400745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-alpha, recombinant human protein</td>
			<td>R&#38;D systems, Minnesota, USA</td>
			<td>210-TA-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI Reagent</td>
			<td>Molecular Research Center, Cincinnati, USA</td>
			<td>TR 118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA buffer solution</td>
			<td>sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>93283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene bIL-6</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td>Custom made probes</td>
			<td>Primer fw (5&#8242;&#8211;3&#8242;) TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A 
			Primer rev (5&#8242;&#8211;3&#8242;) TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTT 
			Probe (5&#8242;FAM/3&#8242;TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene bIL8</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td>Bt03211906_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene bTNF-alpha</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td>Custom made probes</td>
			<td>Primer fw (5&#8242;&#8211;3&#8242;) CCT CTT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A 
			Primer rev (5&#8242;&#8211;3&#8242;) GAG CTG CCC CGG AGA GTT 
			Probe (5&#8242;FAM/3&#8242;TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT ACC G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENE bIL1beta</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td>Custom made probes</td>
			<td>Primer fw (5&#8242;&#8211;3&#8242;) TTA CTA CAG TGA CGA GAA TGA GCT GTT 
			Primer rev (5&#8242;&#8211;3&#8242;) GGT CCA GGT GTT GGA TGC A 
			Probe (5&#8242;FAM/3&#8242;TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA GGG TCA TCA GCC TCA A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPLP0</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td>Bt03218086_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a proinflammatory, degenerative organ culture model to simulate early-stage intervertebral disc disease.

Symptomatisk intervertebrale disk (IVD) degeneration (IDD) er en stor socioøkonomisk byrde og er kendetegnet ved betændelse og vævsforringelse. På grund af manglen på årsagssammenhænge er der et presserende behov for innovative eksperimentelle organkulturmodeller for at studere de mekanismer, der er involveret i sygdommens progression, finde terapeutiske mål og reducere behovet for dyremodeller. Vi præsenterer her en ny, tredimensionel organkulturmodelprotokol, der efterligner det proinflammatoriske og kataboliske mikromiljø, som er til stede under IDD. 
I første omgang blev kvæg kaudale IVD'er dissekeret, renset og dyrket i vævskulturmediet. Dynamisk fysiologisk eller patologisk belastning blev anvendt i en specialfremstillet bioreaktor i 2 timer om dagen. IVD'er blev tildelt en kontrolgruppe (høj glukosemedium, fysiologisk belastning, fosfatbufferet saltvandsindsprøjtning) og en patologisk gruppe (lavt glukosemedium, patologisk belastning, tumornekrosefaktor-alfainjektion) i fire dage. Der blev udført analyse af genekspression fra indsamlede kernen pulposusceller i IVD'erne og enzymrelateret immunosorbentanalyse af de betingede organkulturmedier. 
Vores data afslørede et højere udtryk for inflammatoriske markører og reducerede skivehøjder efter indlæsning i den patologiske gruppe sammenlignet med kontrolgruppen. Denne protokol er pålidelig til at simulere IVD inflammation og degeneration og kan udvides yderligere for at udvide dens anvendelsesområde.

Degenerativ belastning i lavt glukosemedium kombineret med TNF-α injektion forårsagede en betydelig stigning i genekspressionen af proinflammatoriske markører interleukin 6 (IL-6) og interleukin 8 (IL-8) sammenlignet med den fysiologiske kontrolgruppe i NP-celler efter 4 dages kultur (Figur 2). I modsætning hertil observerede vi ikke væsentlige ændringer for proinflammatoriske gener interleukin 1β (IL-1β) og TNF-α i NP-celler (data vist ikke). Desuden ændrede degenerative kulturfor...

Watch this Scientific Journal Video about A Proinflammatory, Degenerative Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease. at JoVE.com

A Proinflammatory, Degenerative Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease.

Denne protokol præsenterer en ny eksperimentel model af proinflammatorisk, degenerativ kvægorgankultur for at simulere tidlig intervertebral diskdegeneration.

En proinflammatorisk, degenerativ organkulturmodel til at simulere tidlig intervertebrale diskose.

Symptomatic intervertebral disc (IVD) degeneration (IDD) is a major socioeconomic burden and is characterized by inflammation and tissue degradation. Due ...

Protokollen har til formål at simulere in vivo betingelser for intervertebral disk degeneration at undersøge sin patofysiologi uden behov for dyremodeller. Sammenlignet med in vitro-cellekulturen opretholder bioreaktororgankulturteknikken cellerne i deres oprindelige biologiske og biomekaniske mikromiljø ud over forsyningen af en kontrollerbar og reproducerbar kulturtilstand. Start med at skylle hele kvæghalen grundigt med ledningsvand for at fjerne snavs og hår på overfladen, og fordyb derefter halen i 1%betadineopløsning i 10 minutter for at desinficere overfladen.Brug et skalpelnummer 20 til at fjerne det bløde væv fra kaudale rygsøjlen for at lette identifikationen af de intervertebrale skiver eller IVD'er. Fjern de spinøse og tværgående processer i hvirvlerne med en knoglefjernelsestænk. Skær tværgående med bentænger gennem midten af hvert hvirveldyr for at opnå individuelle bevægelsessegmenter, og læg derefter de indsamlede bevægelsessegmenter i en petriskål med en gaze fugtet i Ringers opløsning.Find IVD i ryghvirvler ved at flytte bevægelsessegmenterne forsigtigt, og identificer derefter placeringen af vækstpladen ved at røre ved og finde konveks side af den benede endeplade. Afkøl båndsavens klinge med Ringers opløsning, og brug den til at lave to parallelle snit i vækstpladen på IVD'erne, en på hver side. Overfør IVD'erne til en ren petriskål med ren gaze betændt med Ringers opløsning.Skrab rygsøjlen og vækstpladen af ved hjælp af skalpelbladet, så endepladen forbliver intakt. Placer de to overflader fladt og parallelt til lasteproceduren og overfør skrabede IVD'er til en frisk petriskål med gaze betændt med Ringers opløsning. Mål skivens højde og diameter med en caliper, og rengør derefter blodpropperne i ryghvirvlerne med Ringers opløsning ved hjælp af et jettoiletsystem.Desinficere IVD'er i PBS og 10%penicillin streptomycin med rysten i 15 minutter. Skyl de høje koncentration antibiotika med PBS og 1%penicillin streptomycin. Overfør skiver til IVD-kamre, der indeholder fem milliliter IVD-dyrkningsmedium, og læg dem i bioreaktorsystemet med en inkubator ved 37 grader Celsius med 85% fugtighed og 5%kuldioxid.Kultur diskene i fire dage inden for et bioreaktorsystem ved at opretholde forskellige belastningsforhold i henhold til forsøgsgrupperne. I den fysiologiske kontrolgruppe dyrkes IVD'erne med højt glukosemedium ved hjælp af en lasteprotokol på 0,02 til 0,2 megapascals og 0,2 hertz i to timer om dagen. I den patologiske gruppe dyrkes IVD'erne med lavt glukosemedium ved hjælp af en lasteprotokol på 0,32 til 0,5 megapascals og fem hertz i to timer om dagen.Mellem lasteprocedurerne skal du placere IVD'erne i seksbrøndsplader med syv milliliter IVD-dyrkningsmedium for fri hævelsesgenvinding. Diskhøjden måles dagligt med en caliper efter den frie hævelsesperiode og efter dynamisk belastning i forsøgsperioden. Efter den første dynamiske belastningscyklus på dag ét skal du placere IVD'erne direkte i en petriskål i lodret position og stabilisere dem med en pincet.Der injiceres langsomt rekombinant TNF-alpha med en 30-gauge insulinnål med en hastighed på ca. 70 mikroliter i minuttet i de patologiske gruppes IVD'er. Efter injektion skal du trække sprøjten halvvejs tilbage og trække stemplet for at skabe et vakuum, der forhindrer den injicerede opløsning i at lække, og fjern derefter sprøjten helt fra IVD. Degenerativ belastning kombineret med begrænset ernæringsforsyning og en TNF-alpha-injektion forårsagede en betydelig stigning i genekspressionen af proinflammatoriske markører interleukin seks og interleukin otte i NP-væv efter fire dages kultur.Interleukin otte protein frigivelse i konditioneret medium viste en markant stigning i den patologiske gruppe på dag to og dag fire. Diskhøjdereduktion efter belastning var højere i den patologiske gruppe sammenlignet med den fysiologiske gruppe, og forskellene var mere udtalte efter dag to og tre sammenlignet med dag ét, hvilket indikerer en progressiv effekt af de degenerative og inflammatoriske tilstande. En standardiseret dissektionsteknik er vigtig for reproducerbare IVD helorgankulturmodeller.En bioreaktor er forpligtet til at anvende fysiologiske og degenerative belastninger på IVD'er for at simulere forskellige in vivo biomekaniske forhold. Denne teknik kan anvendes på humane IVD-explants, som er af høj klinisk relevans. Det er en ny præklinisk model for udvikling af effektive behandlinger på tidlig fase disk degeneration.

Research

JoVE Journal

Medicine

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Murin hornhindetransplantation: en model til at studere den mest almindelige form for organtransplantation

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Metode til isoleret<em&gt; Ex vivo</em&gt; Lung Perfusion i en rotte Model: Erfaringer fra at udvikle en rotte EVLP Program

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

A Model to Simulate Clinically Relevant Hypoxia in Humans

En model til simulere klinisk relevant Hypoxi i mennesker

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to ...

Ovine Lumbar Intervertebral Disc Degeneration Model Utilizing a Lateral Retroperitoneal Drill Bit Injury

Ovine Lumbar Intervertebral Disc Degeneration Model Brug en lateral retroperitoneal Drill Bit Skade

Intervertebral disc degeneration is a significant contributor to the development of back pain and the leading cause of disability worldwide. Numerous ...

A Cell Culture Model of Resistance Arteries

En celle kultur Model af modstand arterier

The myoendothelial junction (MEJ), a unique signaling microdomain in small diameter resistance arteries, exhibits localization of specific proteins and ...

A Protocol to Acquire the Degenerative Tenocyte from Humans

En protokol til at erhverve den Degenerative Tenocyte fra mennesker

Tendinopathy, a painful condition that develops in response to tendon degeneration, is on the rise in the developed world due to increasing physical ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrisk kontraktilitet måling af musen mesenterica arterie ved hjælp af Wire blodkar

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex Vivo sårheling hornhinde orgel kultur Model for undersøgelser

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons

En Ornesen Endothelial organ kultur model ved hjælp af Split cornea-knapper

Experimental research on corneal endothelial cells is associated with several difficulties. Human donor corneas are scarce and rarely available for ...

A Rat Lung Transplantation Model of Warm Ischemia/Reperfusion Injury: Optimizations to Improve Outcomes

En rottelungetransplantationsmodel af varm iskæmi / reperfusionsskade: optimeringer for at forbedre resultaterne

From our experience with rat lung transplantation, we have found several areas for improvement. Information in the existing literature regarding methods ...