Name: a proinflammatory, degenerative organ culture model to simulate early-stage intervertebral disc disease.
Uploaded: 2021-02-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Proinflammatory, Degenerative Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease. at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der AO Foundation und AOSpine International unterstützt. Babak Saravi erhielt Fellowship-Unterstützung von der Deutschen Wirbelsäulenstiftung und der Deutschen Arthrose-Stiftung. Gernot Lang wurde unterstützt durch das Berta-Ottenstein-Programm für Advanced Clinician Scientists, Medizinische Fakultät, Universität Freiburg, Deutschland.

Die Experimente wurden mit Rinderschwänzen aus lokalen Schlachthöfen durchgeführt. Die in der aktuellen Studie verwendeten biologischen Materialien stammen aus der Nahrungskette und bedürfen keiner ethischen Zulassung im schweizerischen und europäischen Recht.
1. Dissektion der Bandscheibe des Rinds
<ol><li>Spülen Sie den ganzen Schwanz gründlich mit Leitungswasser ab, um Schmutz und Haare auf der Oberfläche zu entfernen. HINWEIS: Bei intakten, distalen Enden können je nach gewü...

<ol>
	<li>Vos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+incidence,+prevalence,+and+years+lived+with+disability+for+328+diseases+and+injuries+for+195+countries,+1990-2016:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016.">Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).</li><li>Hoy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+global+burden+of+low+back+pain.">Measuring the global burden of low back pain.</a> Best Practice &amp; Research Clinical Rheumatology. 24 (2), 155-165 (2010).</li><li>Thiese, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+low+back+pain+by+anatomic+location+and+intensity+in+an+occupational+population.">Prevalence of low back pain by anatomic location and intensity in an occupational population.</a> BMC Musculoskeletal Disorders. 15 (1), 283 (2014).</li><li>Katz, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumbar+Disc+Disorders+and+Low-Back+Pain:+Socioeconomic+Factors+and+Consequences.">Lumbar Disc Disorders and Low-Back Pain: Socioeconomic Factors and Consequences.</a> The Journal of Bone and Joint Surgery (American). 88, 21 (2006).</li><li>Vlaeyen, J. W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+back+pain.">Low back pain.</a> Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 52 (2018).</li><li>Khan, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+biomarkers+of+low+back+pain+and+disc+degeneration:+a+review:+Biomarkers+of+disc+degeneration+and+back+pain.">Inflammatory biomarkers of low back pain and disc degeneration: a review: Biomarkers of disc degeneration and back pain.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1410 (1), 68-84 (2017).</li><li>Kim, H. S., Wu, P. H., Jang, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumbar+Degenerative+Disease+Part+1:+Anatomy+and+Pathophysiology+of+Intervertebral+Discogenic+Pain+and+Radiofrequency+Ablation+of+Basivertebral+and+Sinuvertebral+Nerve+Treatment+for+Chronic+Discogenic+Back+Pain:+A+Prospective+Case+Series+and+Review+of+Literature.">Lumbar Degenerative Disease Part 1: Anatomy and Pathophysiology of Intervertebral Discogenic Pain and Radiofrequency Ablation of Basivertebral and Sinuvertebral Nerve Treatment for Chronic Discogenic Back Pain: A Prospective Case Series and Review of Literature.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1483 (2020).</li><li>Adams, M. A., Roughley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+Intervertebral+Disc+Degeneration,+and+What+Causes+It.">What is Intervertebral Disc Degeneration, and What Causes It.</a> Spine. 31 (18), 2151-2161 (2006).</li><li>Wu, P. H., Kim, H. S., Jang, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intervertebral+Disc+Diseases+Part+2:+A+Review+of+the+Current+Diagnostic+and+Treatment+Strategies+for+Intervertebral+Disc+Disease.">Intervertebral Disc Diseases Part 2: A Review of the Current Diagnostic and Treatment Strategies for Intervertebral Disc Disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2135 (2020).</li><li>Lurie, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+Versus+Nonoperative+Treatment+for+Lumbar+Disc+Herniation:+Eight-Year+Results+for+the+Spine+Patient+Outcomes+Research+Trial.">Surgical Versus Nonoperative Treatment for Lumbar Disc Herniation: Eight-Year Results for the Spine Patient Outcomes Research Trial.</a> Spine. 39 (1), 3-16 (2014).</li><li>Risbud, M. V., Shapiro, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cytokines+in+intervertebral+disc+degeneration:+pain+and+disc+content.">Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content.</a> Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).</li><li>Ponnappan, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organ+culture+system+to+model+early+degenerative+changes+of+the+intervertebral+disc.">An organ culture system to model early degenerative changes of the intervertebral disc.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 13 (5), 171 (2011).</li><li>O'Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Animals+Used+in+Disc+Research+to+Human+Lumbar+Disc+Geometry.">Comparison of Animals Used in Disc Research to Human Lumbar Disc Geometry.</a> Spine. 32 (3), 328-333 (2007).</li><li>Stannard, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+whole+organ+culture+model+for+intervertebral+disc+disease.">Development of a whole organ culture model for intervertebral disc disease.</a> Journal of Orthopaedic Translation. 5, 1-8 (2016).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+ex-vivo+Testing+of+Anti-inflammatory+Drugs+in+a+Bovine+Intervertebral+Degenerative+Disc+Model.">Preclinical ex-vivo Testing of Anti-inflammatory Drugs in a Bovine Intervertebral Degenerative Disc Model.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 583 (2020).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+ex+vivo+cavity+model+to+study+repair+strategies+in+loaded+intervertebral+discs.">Development of an ex vivo cavity model to study repair strategies in loaded intervertebral discs.</a> European Spine Journal. 25 (9), 2898-2908 (2016).</li><li>Kazezian, Z., Li, Z., Alini, M., Grad, S., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+hyaluronic+acid+down-regulates+interferon+signaling+molecules,+IGFBP3+and+IFIT3+in+the+bovine+intervertebral+disc.">Injectable hyaluronic acid down-regulates interferon signaling molecules, IGFBP3 and IFIT3 in the bovine intervertebral disc.</a> Acta Biomaterialia. 52, 118-129 (2017).</li><li>Caprez, S., Menzel, U., Li, Z., Grad, S., Alini, M., Peroglio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+high-quality+RNA+from+intervertebral+disc+tissue+via+pronase+predigestion+and+tissue+pulverization.">Isolation of high-quality RNA from intervertebral disc tissue via pronase predigestion and tissue pulverization.</a> JOR Spine. 1 (2), 1017 (2018).</li><li>Lopa, S., Ceriani, C., Cecchinato, R., Zagra, L., Moretti, M., Colombini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+housekeeping+genes+in+human+intervertebral+disc,+endplate+and+articular+cartilage+cells+in+multiple+conditions+for+reliable+transcriptional+analysis.">Stability of housekeeping genes in human intervertebral disc, endplate and articular cartilage cells in multiple conditions for reliable transcriptional analysis.</a> European Cells &amp; Materials. 31, 395-406 (2016).</li><li>Lang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intervertebral+disc+whole+organ+culture+system+to+investigate+proinflammatory+and+degenerative+disc+disease+condition.">An intervertebral disc whole organ culture system to investigate proinflammatory and degenerative disc disease condition.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2051-2061 (2018).</li><li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+intervertebral+disc+cell+and+organ+culture+models+induced+by+tumor+necrosis+factor+alpha.">Proinflammatory intervertebral disc cell and organ culture models induced by tumor necrosis factor alpha.</a> JOR Spine. 3, 1104 (2020).</li><li>Purmessur, D., Walter, B. A., Roughley, P. J., Laudier, D. M., Hecht, A. C., Iatridis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+TNF&#945;+in+intervertebral+disc+degeneration:+A+non-recoverable+catabolic+shift.">A role for TNF&#945; in intervertebral disc degeneration: A non-recoverable catabolic shift.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 433 (1), 151-156 (2013).</li><li>Walter, B. A., Likhitpanichkul, M., Illien-Junger, S., Roughley, P. J., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF&#945;+Transport+Induced+by+Dynamic+Loading+Alters+Biomechanics+of+Intact+Intervertebral+Discs.">TNF&#945; Transport Induced by Dynamic Loading Alters Biomechanics of Intact Intervertebral Discs.</a> PLOS One. 10 (3), 0118358 (2015).</li><li>Gullbrand, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+animal+model+that+recapitulates+the+spectrum+of+human+intervertebral+disc+degeneration.">A large animal model that recapitulates the spectrum of human intervertebral disc degeneration.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 25 (1), 146-156 (2017).</li><li>Willems, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+intradiscal+injection+and+biocompatibility+of+polyester+amide+microspheres+in+a+canine+model+predisposed+to+intervertebral+disc+degeneration:+intradiscal+application+of+pea+microspheres.">Safety of intradiscal injection and biocompatibility of polyester amide microspheres in a canine model predisposed to intervertebral disc degeneration: intradiscal application of pea microspheres.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 105 (4), 707-714 (2017).</li><li>Michalek, A. J., Buckley, M. R., Bonassar, L. J., Cohen, I., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+needle+puncture+injury+on+microscale+shear+strain+in+the+intervertebral+disc+annulus+fibrosus.">The effects of needle puncture injury on microscale shear strain in the intervertebral disc annulus fibrosus.</a> The Spine Journal. 10 (12), 1098-1105 (2010).</li><li>Illien-J&#252;nger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combined+effects+of+limited+nutrition+and+high-frequency+loading+on+intervertebral+discs+with+endplates.">The combined effects of limited nutrition and high-frequency loading on intervertebral discs with endplates.</a> Spine. 35 (19), 1744-1752 (2010).</li><li>Gantenbein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+culture+bioreactors--platforms+to+study+human+intervertebral+disc+degeneration+and+regenerative+therapy.">Organ culture bioreactors--platforms to study human intervertebral disc degeneration and regenerative therapy.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therapy. 10 (4), 339-352 (2015).</li><li>Boubriak, O. A., Watson, N., Sivan, S. S., Stubbens, N., Urban, J. P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+regulating+viable+cell+density+in+the+intervertebral+disc:+blood+supply+in+relation+to+disc+height.">Factors regulating viable cell density in the intervertebral disc: blood supply in relation to disc height.</a> Journal of Anatomy. 222 (3), 341-348 (2013).</li><li>Maroudas, A., Stockwell, R. A., Nachemson, A., Urban, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+involved+in+the+nutrition+of+the+human+lumbar+intervertebral+disc:+cellularity+and+diffusion+of+glucose+in+vitro.">Factors involved in the nutrition of the human lumbar intervertebral disc: cellularity and diffusion of glucose in vitro.</a> Journal of Anatomy. 120, 113-130 (1975).</li><li>Beckstein, J. C., Sen, S., Schaer, T. P., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Animal+Discs+Used+in+Disc+Research+to+Human+Lumbar+Disc:+Axial+Compression+Mechanics+and+Glycosaminoglycan+Content.">Comparison of Animal Discs Used in Disc Research to Human Lumbar Disc: Axial Compression Mechanics and Glycosaminoglycan Content.</a> Spine. 33 (6), 166-173 (2008).</li><li>Walter, B. A., Illien-J&#252;nger, S., Nasser, P. R., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+bioreactor+system+for+dynamic+loading+and+mechanical+characterization+of+whole+human+intervertebral+discs+in+organ+culture.">Development and validation of a bioreactor system for dynamic loading and mechanical characterization of whole human intervertebral discs in organ culture.</a> Journal of Biomechanics. 47 (9), 2095-2101 (2014).</li><li>Rajan, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-Like+Receptor+4+(TLR4)+Expression+and+Stimulation+in+a+Model+of+Intervertebral+Disc+Inflammation+and+Degeneration.">Toll-Like Receptor 4 (TLR4) Expression and Stimulation in a Model of Intervertebral Disc Inflammation and Degeneration.</a> Spine. 38 (16), 1343-1351 (2013).</li><li>vanden Akker, G. G., Rorije, A. J., Davidson, E. N. B., vander Kraan, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+marker+genes+distinguish+inner+and+outer+annulus+fibrosus+from+nucleus+pulposus+tissue+in+the+bovine+intervertebral+disc.">Phenotypic marker genes distinguish inner and outer annulus fibrosus from nucleus pulposus tissue in the bovine intervertebral disc.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 25, 402 (2017).</li><li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cell+phenotype+induction+with+TGF-&#946;1+and+collagen-polyurethane+scaffold+for+annulus+fibrosus+rupture+repair.">Functional cell phenotype induction with TGF-&#946;1 and collagen-polyurethane scaffold for annulus fibrosus rupture repair.</a> European Cells &amp; Materials. 39, 1-17 (2020).</li><li>Risbud, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+phenotype+of+young+healthy+nucleus+pulposus+cells:+recommendations+of+the+Spine+Research+Interest+Group+at+the+2014+annual+ORS+meeting.">Defining the phenotype of young healthy nucleus pulposus cells: recommendations of the Spine Research Interest Group at the 2014 annual ORS meeting.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 33 (3), 283-293 (2015).</li></ol>

Wir haben hier ein detailliertes Protokoll zur Simulation degenerativer und entzündlicher IVDD zur Verfügung gestellt. Dieses Protokoll kann für detaillierte Untersuchungen von Entzündungswegen angewendet werden, die zu den zerstörerischen Auswirkungen auf die Bandscheibe führen. Darüber hinaus kann das Protokoll helfen, vielversprechende therapeutische Ziele zu bestimmen, die am Fortschreiten der Krankheit beteiligt sind.
Wir haben kürzlich gezeigt, dass humane rekombinante TNF-α Ent...

Rückenschmerzen (LBP) können Menschen jeden Alters betreffen und sind weltweit eine der Hauptursachen fürBehinderungen 1,2,3. Die gesamtkosten im Zusammenhang mit LBP übersteigen 100 Milliarden US$Dollar pro Jahr4,5. Symptomatische Bandscheibendegeneration (IVD) (IDD), eine Erkrankung, die durch Entzündungen und Gewebeabbau gekennzeichnet ist, ist eine Hauptursache für LBP6,7. Insbesondere ist IDD durch einen sich allmählich entwickelnden Zusammenbruch der extrazellulären Matrix (ECM) der IVD gekennzeichnet, der durch mehrere Faktoren induziert und ausgelöst wird, die zu einer beschleunigten Pathologie, neurologischen Störungen und schließlich zu einer Behinderung führen. Darüber hinaus ist IDD mit der Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen, veränderter Wirbelsäulenbiomechanik, Angiogenese und Nerveningrowth verbunden, was das Schmerzempfinden erhöht und insgesamt chronische LBP (aktive Diskopathie) verursacht6,8. Bisher umfassen die Behandlungsmöglichkeiten die Diskektomie und die anschließende Fusion der benachbarten Wirbel, die Implantation einer IVD-Prothese oder nicht-chirurgische Ansätze wie nichtsteroidale entzündungshemmende Medikamente, Opioide und Muskelrelaxantien für Patienten mit IDD9. Beide derzeitigen Standardtherapieoptionen, chirurgische und nicht-chirurgische, sind nur teilweise wirksam und gehen nicht auf das zugrunde liegende biologische Problem ein9,10. Eine degenerative Bandscheibenerkrankung im Frühstadium ist durch eine anfängliche entzündliche Gewebereaktion gekennzeichnet, insbesondere durch eine Zunahme der Tumornekrosefaktor-alpha -Expression (TNF-alpha)11. Diese frühen Bandscheibenveränderungen treten hauptsächlich auf zellulärer Ebene auf, ohne die Bandscheibenarchitektur zu stören und konnten zuvor durch Nährstoffmangel unter entzündungsfördernden Zuständen nachgeahmt werden12. Daher ist eine präzise Simulation der In-vivo-Situation entscheidend, um diese Degenerationsmechanismen zu untersuchen und geeignete therapeutische Ziele zu finden. Zusätzlich zu diesen Simulationen molekularer Eigenschaften spielt die mechanische Belastungsumgebung der Scheiben eine Schlüsselrolle bei pathologischen und physiologischen Veränderungen der IVD. Folglich würde uns die Kombination dieser Ansätze einen Schritt nach vorne bringen, um die komplexe Mikroumgebung von IVDs in vivo nachzuahmen. Es gibt derzeit keine Studien, die den Aspekt der dynamischen Belastung zusammen mit dem entzündungsfördernden und ernährungsphysiologischen Setting nach bestem Wissen und Gewissen berücksichtigen.
Große Tiermodelle erlauben zwar die Untersuchung potentiell relevanter in vivo Wechselwirkungen, sind aber kostspielig und arbeitsintensiv. Da der Einsatz von Tiermodellen in der Forschung seit langem umstritten ist, ist die Reduzierung der Anzahl der Tiere, die zur Beantwortung wichtiger Forschungsfragen benötigt werden, von großem Interesse. Schließlich gibt es derzeit kein ideales Tiermodell, um IDD in der IVD-Forschung nachzuahmen13,14. Daher ist es notwendig, einen kostengünstigen und zuverlässigen Ersatz zu etablieren, z. B. ein Organkulturmodell, um IDD und damit verbundene entzündliche und degenerative Prozesse zu simulieren. Vor kurzem ermöglichte uns die Anwendung des vorliegenden Protokolls zur Etablierung eines proinflammatorischen und degenerativen Organkulturmodells zur Simulation von Bandscheibenerkrankungen im Frühstadium, die Wirkung entzündungshemmender Medikamente in der IDD-Organkultur zu untersuchen15.
Hier beschreiben wir, wie man Bovin-Bandscheiben erhält und den Zustand der IDD im Frühstadium über eine katabole und proinflammatorische Mikroumgebung induziert, die durch direkte intradiskale Injektion von Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-α) und degenerative Belastung in einem Bioreaktor unter niedrigen Nährmediumbedingungen verursacht wird. Abbildung 1 veranschaulicht das experimentelle Modell und zeigt den Bioreaktor, mit dem degenerative und physiologische Belastungsbedingungen simuliert werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62100/62100fig01.jpg"> Abbildung 1: Abbildung des Versuchsaufbaus. A: Rinderschwanz; B: sezierte Bandscheiben von Rindern; C: Übertragung der Scheibe auf eine Well-Platte mit Kulturmedium; D: Laden der Simulation in einen Bioreaktor; E: intradiskale Injektionstechnik; F: IVD nach Injektion von PBS/Trypanblaufarbstoff, um die Verteilung aufzudecken. IDD: Bandscheibendegeneration. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62100/62100fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Bromo-3-chloropropane(BCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>B9673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate-2-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band saw</td>
			<td>Exakt Apparatebau, Norderstedt, Germany</td>
			<td>model 30/833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Munndipharma, Frankfurt, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine IL-8 Do.it-Yourself ELISA</td>
			<td>Kingfisher Biotech, St. Paul, USA</td>
			<td>DIY1028B-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning ITS Premix</td>
			<td>Corning Inc., New York, USA</td>
			<td>354350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Gibco by life technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>10741574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>Gibco by life technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>11564446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol for molecular biology</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>09-0851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco by life technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>A4766801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acid solution</td>
			<td>Gibco by life technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin(P/S)</td>
			<td>gibco by life technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>11548876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution, tablet</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>10165921001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen, Sandiego, USA</td>
			<td>ant-pm-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulsavac Jet Lavage System</td>
			<td>Zimmer, IN,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>Quiagen, Venlo, Netherlands</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidinn-HRP</td>
			<td>Kingfisher Biotech, St. Paul, USA</td>
			<td>AR0068-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript VILO</td>
			<td>Invitrogen by life Technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>10704274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td>10400745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-alpha, recombinant human protein</td>
			<td>R&#38;D systems, Minnesota, USA</td>
			<td>210-TA-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI Reagent</td>
			<td>Molecular Research Center, Cincinnati, USA</td>
			<td>TR 118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA buffer solution</td>
			<td>sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>93283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene bIL-6</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td>Custom made probes</td>
			<td>Primer fw (5&#8242;&#8211;3&#8242;) TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A 
			Primer rev (5&#8242;&#8211;3&#8242;) TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTT 
			Probe (5&#8242;FAM/3&#8242;TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene bIL8</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td>Bt03211906_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene bTNF-alpha</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td>Custom made probes</td>
			<td>Primer fw (5&#8242;&#8211;3&#8242;) CCT CTT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A 
			Primer rev (5&#8242;&#8211;3&#8242;) GAG CTG CCC CGG AGA GTT 
			Probe (5&#8242;FAM/3&#8242;TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT ACC G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENE bIL1beta</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td>Custom made probes</td>
			<td>Primer fw (5&#8242;&#8211;3&#8242;) TTA CTA CAG TGA CGA GAA TGA GCT GTT 
			Primer rev (5&#8242;&#8211;3&#8242;) GGT CCA GGT GTT GGA TGC A 
			Probe (5&#8242;FAM/3&#8242;TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA GGG TCA TCA GCC TCA A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPLP0</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td>Bt03218086_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a proinflammatory, degenerative organ culture model to simulate early-stage intervertebral disc disease.

Die symptomatische Bandscheibendegeneration (IDD) ist eine große sozioökonomische Belastung und durch Entzündungen und Gewebeabbau gekennzeichnet. Aufgrund des Mangels an ursächlichen Therapien besteht ein dringender Bedarf an innovativen experimentellen Organkulturmodellen, um die Mechanismen des Fortschreitens der Krankheit zu untersuchen, therapeutische Ziele zu finden und den Bedarf an Tiermodellen zu reduzieren. Wir präsentieren hier ein neuartiges, dreidimensionales Organkulturmodellprotokoll, das die proinflammatorische und katabole Mikroumgebung nachahmt, die während der IDD vorhanden ist. 
Zunächst wurden bovine Kaud-IVDs im Gewebekulturmedium seziert, gereinigt und kultiviert. Dynamische physiologische oder pathologische Belastung wurde in einem maßgeschneiderten Bioreaktor für 2 Stunden pro Tag angewendet. IVDs wurden vier Tage lang einer Kontrollgruppe (hohes Glukosemedium, physiologische Belastung, phosphatgepufferte Kochsalzinjektion) und einer pathologischen Gruppe (niedriges Glukosemedium, pathologische Belastung, Tumornekrosefaktor-Alpha-Injektion) zugeordnet. Es wurde eine Genexpressionsanalyse aus gesammelten Nucleus pulposus-Zellen der IVDs und ein enzymgebundener Immunsorbent-Assay der konditionierten Organkulturmedien durchgeführt. 
Unsere Daten zeigten eine höhere Expression von Entzündungsmarkern und reduzierte Bandscheibenhöhen nach belastung in der pathologischen Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe. Dieses Protokoll ist zuverlässig, um IVD-Entzündungen und -Degenerationen zu simulieren und kann weiter erweitert werden, um seinen Anwendungsbereich zu erweitern.

Die degenerative Belastung in niedrigem Glukosemedium in Kombination mit TNF-α-Injektion verursachte nach 4 Tagen Kultur eine signifikante Erhöhung der Genexpression der proinflammatorischen Marker Interleukin 6 (IL-6) und Interleukin 8 (IL-8) im Vergleich zur physiologischen Kontrollgruppe in NP-Zellen (Abbildung 2). Im Gegensatz dazu beobachteten wir keine signifikanten Veränderungen für die proinflammatorischen Gene Interleukin 1β (IL-1β) und TNF-α in NP-Zellen (Daten nicht gezeigt...

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A Proinflammatory, Degenerative Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease.

Dieses Protokoll stellt ein neuartiges experimentelles Modell der proinflammatorischen, degenerativen Rinderorgankultur vor, um die Bandscheibendegeneration im Frühstadium zu simulieren.

Ein proinflammatorisches, degeneratives Organkulturmodell zur Simulation einer Bandscheibenerkrankung im Frühstadium.

Symptomatic intervertebral disc (IVD) degeneration (IDD) is a major socioeconomic burden and is characterized by inflammation and tissue degradation. Due ...

Das Protokoll zielt darauf ab, in vivo Bedingungen der Bandscheibendegeneration zu simulieren, um ihre Pathophysiologie ohne Tiermodelle zu untersuchen. Im Vergleich zur In-vitro-Zellkultur erhält die Bioreaktor-Organkulturtechnik die Zellen in ihrer nativen biologischen und biomechanischen mikroen Umgebung zusätzlich zur Versorgung mit einem kontrollierbaren und reproduzierbaren Kulturzustand. Beginnen Sie mit dem gründlichen Spülen des gesamten Rinderschwanzes mit Leitungswasser, um Schmutz und Haare auf der Oberfläche zu entfernen, und tauchen Sie den Schwanz dann 10 Minuten lang in 1% Betadinlösung, um die Oberfläche zu desinfizieren.Verwenden Sie ein Skalpell Nummer 20, um das Weichgewebe aus der Schwanzwirbelsäule zu entfernen, um die Identifizierung der Bandscheiben oder IVDs zu erleichtern. Entfernen Sie die Dorn- und Querprozesse der Wirbel mit einer Knochenentfernungszange. Schneiden Sie quer mit einer Knochenzange durch die Mitte jedes Wirbelkörpers, um einzelne Bewegungssegmente zu erhalten, und legen Sie dann die gesammelten Bewegungssegmente in eine Petrischale mit einer Gaze, die in Ringers Lösung benetzt ist.Lokalisieren Sie die IVD in Wirbeln, indem Sie die Bewegungssegmente sanft bewegen, und identifizieren Sie dann die Position der Wachstumsplatte, indem Sie die konvexe Seite der knöchernen Endplatte berühren und finden. Kühlen Sie die Klinge der Bandsäge mit Ringers Lösung ab und verwenden Sie sie, um zwei parallele Schnitte in der Wachstumsplatte der IVDs zu machen, einen auf jeder Seite. Die IVDs werden in eine saubere Petrischale mit sauberer Gaze überführen, die mit Ringers Lösung benetzt ist.Kratzen Sie den Wirbelkörper und die Wachstumsplatte mit der Skalpellklinge ab und lassen Sie die Endplatte intakt. Positionieren Sie die beiden Oberflächen flach und parallel für den Ladevorgang und übertragen Sie abgekratzte IVDs in eine frische Petrischale mit Gaze, die mit Ringers Lösung benetzt ist. Messen Sie die Bandscheibenhöhe und den Durchmesser mit einem Bremssattel und reinigen Sie dann die Blutgerinnsel im Wirbelknochen mit Ringers Lösung unter Verwendung eines Jet-Lavage-Systems.Desinfizieren Sie IVDs in PBS und 10% Penicillin Streptomycin mit Schütteln für 15 Minuten. Spülen Sie die hochkonzentrierten Antibiotika mit PBS und 1% Penicillin Streptomycin ab. Übertragen Sie die Scheiben in IVD-Kammern mit fünf Millilitern IVD-Kulturmedium und legen Sie sie mit einem Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 85% Luftfeuchtigkeit und 5% Kohlendioxid in das Bioreaktorsystem.Kulturieren Sie die Scheiben vier Tage lang innerhalb eines Bioreaktorsystems, indem Sie je nach den Versuchsgruppen unterschiedliche Belastungsbedingungen aufrechterhalten. In der physiologischen Kontrollgruppe werden die IVDs mit hohem Glukosemedium unter Verwendung eines Belastungsprotokolls von 0,02 bis 0,2 Megapascal und 0,2 Hertz für zwei Stunden pro Tag kultiviert. In der pathologischen Gruppe werden die IVDs mit niedrigem Glukosemedium unter Verwendung eines Belastungsprotokolls von 0,32 bis 0,5 Megapascal und fünf Hertz für zwei Stunden pro Tag kultiviert.Legen Sie die IVDs zwischen den Ladevorgängen in Sechs-Well-Platten mit sieben Millilitern IVD-Kulturmedium, um die freie Quellung wiederhergestellt zu werden. Messen Sie die Scheibenhöhe täglich mit einem Bremssattel nach der freien Quellperiode und nach dynamischer Belastung für die Versuchsdauer. Nach dem ersten dynamischen Ladezyklus am ersten Tag die IVDs direkt in eine Petrischale in vertikaler Position legen und mit einer Pinzette stabilisieren.Injizieren Sie rekombinantes TNF-alpha mit einer 30-Gauge-Insulinnadel langsam mit einer Geschwindigkeit von etwa 70 Mikrolitern pro Minute in die IVDs der pathologischen Gruppe. Ziehen Sie nach der Injektion die Spritze auf halbem Weg zurück und ziehen Sie den Kolben, um ein Vakuum zu erzeugen, das verhindert, dass die injizierte Lösung ausläuft, und entfernen Sie dann die Spritze vollständig aus der IVD. Degenerative Belastung in Kombination mit begrenzter Nährstoffversorgung und einer TNF-alpha-Injektion führte nach vier Tagen Kultur zu einem signifikanten Anstieg der Genexpression der entzündungsfördernden Marker Interleukin six und Interleukin acht im NP-Gewebe.Die Freisetzung von Interleukin-Acht-Proteinen in das konditionierte Medium zeigte am zweiten und vierten Tag einen deutlichen Anstieg der pathologischen Gruppe. Die Verringerung der Bandscheibenhöhe nach belastung war in der pathologischen Gruppe im Vergleich zur physiologischen Gruppe höher, und die Unterschiede waren nach den Tagen zwei und drei im Vergleich zum ersten Tag ausgeprägter, was auf eine fortschreitende Wirkung der degenerativen und entzündlichen Zustände hinweist. Eine standardisierte Dissektionstechnik ist wichtig für reproduzierbare IVD-Ganzorgankulturmodelle.Ein Bioreaktor ist erforderlich, um physiologische und degenerative Belastungen auf IVDs anzuwenden, um verschiedene biomechanische In-vivo-Bedingungen zu simulieren. Diese Technik kann auf menschliche IVD-Explantierungen angewendet werden, was von hoher klinischer Relevanz ist. Es ist ein neuartiges präklinisches Modell zur Entwicklung wirksamer Behandlungen bei Bandscheibendegeneration im Frühstadium.

Research

JoVE Journal

Medicine

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Murine Hornhauttransplantation: Ein Modell, das die häufigste Form der Organtransplantation Studieren

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Forschung

Medizin

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Methode Isolated<em&gt; Ex vivo</em&gt; Lung Perfusion in einem Rattenmodell: Lehren aus Entwicklung einer Ratte EVLP Programm gelernt

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

A Model to Simulate Clinically Relevant Hypoxia in Humans

Ein Modell Simulieren von klinisch relevanter Hypoxie beim Menschen

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to ...

Ovine Lumbar Intervertebral Disc Degeneration Model Utilizing a Lateral Retroperitoneal Drill Bit Injury

Schaf-Lendenwirbelsäulen-Degenerationsmodell mit einer lateralen Retroperitoneal-Bohrer-Verletzung

Intervertebral disc degeneration is a significant contributor to the development of back pain and the leading cause of disability worldwide. Numerous ...

A Cell Culture Model of Resistance Arteries

Eine Kultur Zellmodell der Widerstand Arterien

The myoendothelial junction (MEJ), a unique signaling microdomain in small diameter resistance arteries, exhibits localization of specific proteins and ...

A Protocol to Acquire the Degenerative Tenocyte from Humans

Ein Protokoll der degenerativen Tenocyte von Menschen zu erwerben

Tendinopathy, a painful condition that develops in response to tendon degeneration, is on the rise in the developed world due to increasing physical ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Messung der isometrischen Kontraktilität der Maus mesenterialen Arterie mit Draht Myographie

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex Vivo Wundheilung Hornhaut Orgel Kulturmodells für Studien

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons

Ein Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Modell mit Split Corneal Buttons

Experimental research on corneal endothelial cells is associated with several difficulties. Human donor corneas are scarce and rarely available for ...

A Rat Lung Transplantation Model of Warm Ischemia/Reperfusion Injury: Optimizations to Improve Outcomes

Ein Ratten-Lungentransplantationsmodell für warme Ischämie/Reperfusionsschäden: Optimierungen zur Verbesserung der Ergebnisse

From our experience with rat lung transplantation, we have found several areas for improvement. Information in the existing literature regarding methods ...