Name: a proinflammatory, degenerative organ culture model to simulate early-stage intervertebral disc disease.
Uploaded: 2021-02-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Proinflammatory, Degenerative Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease. at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da AO Foundation e AOSpine International. Babak Saravi ha ricevuto il sostegno della Fondazione tedesca Spine e della Fondazione tedesca per l'osteoartrite. Gernot Lang è stato sostenuto dal Programma Berta-Ottenstein per scienziati clinici avanzati, Facoltà di Medicina, Università di Friburgo, Germania.

Gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando code bovine ottenute da mattatoi locali. I materiali biologici utilizzati nell'attuale studio sono prelevati dalla catena alimentare e non richiedono alcuna approvazione etica nel diritto svizzero ed europeo.
1. Dissezione del disco intervertebrale bovino
<ol><li>Risciacquare accuratamente l'intera coda con acqua del rubinetto per rimuovere sporco e capelli sulla superficie. NOTA: Con estremità distali intatte, è possibile utilizzare un ma...

<ol>
	<li>Vos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+incidence,+prevalence,+and+years+lived+with+disability+for+328+diseases+and+injuries+for+195+countries,+1990-2016:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016.">Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).</li><li>Hoy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+global+burden+of+low+back+pain.">Measuring the global burden of low back pain.</a> Best Practice &amp; Research Clinical Rheumatology. 24 (2), 155-165 (2010).</li><li>Thiese, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+low+back+pain+by+anatomic+location+and+intensity+in+an+occupational+population.">Prevalence of low back pain by anatomic location and intensity in an occupational population.</a> BMC Musculoskeletal Disorders. 15 (1), 283 (2014).</li><li>Katz, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumbar+Disc+Disorders+and+Low-Back+Pain:+Socioeconomic+Factors+and+Consequences.">Lumbar Disc Disorders and Low-Back Pain: Socioeconomic Factors and Consequences.</a> The Journal of Bone and Joint Surgery (American). 88, 21 (2006).</li><li>Vlaeyen, J. W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+back+pain.">Low back pain.</a> Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 52 (2018).</li><li>Khan, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+biomarkers+of+low+back+pain+and+disc+degeneration:+a+review:+Biomarkers+of+disc+degeneration+and+back+pain.">Inflammatory biomarkers of low back pain and disc degeneration: a review: Biomarkers of disc degeneration and back pain.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1410 (1), 68-84 (2017).</li><li>Kim, H. S., Wu, P. H., Jang, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumbar+Degenerative+Disease+Part+1:+Anatomy+and+Pathophysiology+of+Intervertebral+Discogenic+Pain+and+Radiofrequency+Ablation+of+Basivertebral+and+Sinuvertebral+Nerve+Treatment+for+Chronic+Discogenic+Back+Pain:+A+Prospective+Case+Series+and+Review+of+Literature.">Lumbar Degenerative Disease Part 1: Anatomy and Pathophysiology of Intervertebral Discogenic Pain and Radiofrequency Ablation of Basivertebral and Sinuvertebral Nerve Treatment for Chronic Discogenic Back Pain: A Prospective Case Series and Review of Literature.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1483 (2020).</li><li>Adams, M. A., Roughley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+Intervertebral+Disc+Degeneration,+and+What+Causes+It.">What is Intervertebral Disc Degeneration, and What Causes It.</a> Spine. 31 (18), 2151-2161 (2006).</li><li>Wu, P. H., Kim, H. S., Jang, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intervertebral+Disc+Diseases+Part+2:+A+Review+of+the+Current+Diagnostic+and+Treatment+Strategies+for+Intervertebral+Disc+Disease.">Intervertebral Disc Diseases Part 2: A Review of the Current Diagnostic and Treatment Strategies for Intervertebral Disc Disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2135 (2020).</li><li>Lurie, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+Versus+Nonoperative+Treatment+for+Lumbar+Disc+Herniation:+Eight-Year+Results+for+the+Spine+Patient+Outcomes+Research+Trial.">Surgical Versus Nonoperative Treatment for Lumbar Disc Herniation: Eight-Year Results for the Spine Patient Outcomes Research Trial.</a> Spine. 39 (1), 3-16 (2014).</li><li>Risbud, M. V., Shapiro, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cytokines+in+intervertebral+disc+degeneration:+pain+and+disc+content.">Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content.</a> Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).</li><li>Ponnappan, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organ+culture+system+to+model+early+degenerative+changes+of+the+intervertebral+disc.">An organ culture system to model early degenerative changes of the intervertebral disc.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 13 (5), 171 (2011).</li><li>O'Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Animals+Used+in+Disc+Research+to+Human+Lumbar+Disc+Geometry.">Comparison of Animals Used in Disc Research to Human Lumbar Disc Geometry.</a> Spine. 32 (3), 328-333 (2007).</li><li>Stannard, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+whole+organ+culture+model+for+intervertebral+disc+disease.">Development of a whole organ culture model for intervertebral disc disease.</a> Journal of Orthopaedic Translation. 5, 1-8 (2016).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+ex-vivo+Testing+of+Anti-inflammatory+Drugs+in+a+Bovine+Intervertebral+Degenerative+Disc+Model.">Preclinical ex-vivo Testing of Anti-inflammatory Drugs in a Bovine Intervertebral Degenerative Disc Model.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 583 (2020).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+ex+vivo+cavity+model+to+study+repair+strategies+in+loaded+intervertebral+discs.">Development of an ex vivo cavity model to study repair strategies in loaded intervertebral discs.</a> European Spine Journal. 25 (9), 2898-2908 (2016).</li><li>Kazezian, Z., Li, Z., Alini, M., Grad, S., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+hyaluronic+acid+down-regulates+interferon+signaling+molecules,+IGFBP3+and+IFIT3+in+the+bovine+intervertebral+disc.">Injectable hyaluronic acid down-regulates interferon signaling molecules, IGFBP3 and IFIT3 in the bovine intervertebral disc.</a> Acta Biomaterialia. 52, 118-129 (2017).</li><li>Caprez, S., Menzel, U., Li, Z., Grad, S., Alini, M., Peroglio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+high-quality+RNA+from+intervertebral+disc+tissue+via+pronase+predigestion+and+tissue+pulverization.">Isolation of high-quality RNA from intervertebral disc tissue via pronase predigestion and tissue pulverization.</a> JOR Spine. 1 (2), 1017 (2018).</li><li>Lopa, S., Ceriani, C., Cecchinato, R., Zagra, L., Moretti, M., Colombini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+housekeeping+genes+in+human+intervertebral+disc,+endplate+and+articular+cartilage+cells+in+multiple+conditions+for+reliable+transcriptional+analysis.">Stability of housekeeping genes in human intervertebral disc, endplate and articular cartilage cells in multiple conditions for reliable transcriptional analysis.</a> European Cells &amp; Materials. 31, 395-406 (2016).</li><li>Lang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intervertebral+disc+whole+organ+culture+system+to+investigate+proinflammatory+and+degenerative+disc+disease+condition.">An intervertebral disc whole organ culture system to investigate proinflammatory and degenerative disc disease condition.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2051-2061 (2018).</li><li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+intervertebral+disc+cell+and+organ+culture+models+induced+by+tumor+necrosis+factor+alpha.">Proinflammatory intervertebral disc cell and organ culture models induced by tumor necrosis factor alpha.</a> JOR Spine. 3, 1104 (2020).</li><li>Purmessur, D., Walter, B. A., Roughley, P. J., Laudier, D. M., Hecht, A. C., Iatridis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+TNF&#945;+in+intervertebral+disc+degeneration:+A+non-recoverable+catabolic+shift.">A role for TNF&#945; in intervertebral disc degeneration: A non-recoverable catabolic shift.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 433 (1), 151-156 (2013).</li><li>Walter, B. A., Likhitpanichkul, M., Illien-Junger, S., Roughley, P. J., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF&#945;+Transport+Induced+by+Dynamic+Loading+Alters+Biomechanics+of+Intact+Intervertebral+Discs.">TNF&#945; Transport Induced by Dynamic Loading Alters Biomechanics of Intact Intervertebral Discs.</a> PLOS One. 10 (3), 0118358 (2015).</li><li>Gullbrand, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+animal+model+that+recapitulates+the+spectrum+of+human+intervertebral+disc+degeneration.">A large animal model that recapitulates the spectrum of human intervertebral disc degeneration.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 25 (1), 146-156 (2017).</li><li>Willems, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+intradiscal+injection+and+biocompatibility+of+polyester+amide+microspheres+in+a+canine+model+predisposed+to+intervertebral+disc+degeneration:+intradiscal+application+of+pea+microspheres.">Safety of intradiscal injection and biocompatibility of polyester amide microspheres in a canine model predisposed to intervertebral disc degeneration: intradiscal application of pea microspheres.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 105 (4), 707-714 (2017).</li><li>Michalek, A. J., Buckley, M. R., Bonassar, L. J., Cohen, I., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+needle+puncture+injury+on+microscale+shear+strain+in+the+intervertebral+disc+annulus+fibrosus.">The effects of needle puncture injury on microscale shear strain in the intervertebral disc annulus fibrosus.</a> The Spine Journal. 10 (12), 1098-1105 (2010).</li><li>Illien-J&#252;nger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combined+effects+of+limited+nutrition+and+high-frequency+loading+on+intervertebral+discs+with+endplates.">The combined effects of limited nutrition and high-frequency loading on intervertebral discs with endplates.</a> Spine. 35 (19), 1744-1752 (2010).</li><li>Gantenbein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+culture+bioreactors--platforms+to+study+human+intervertebral+disc+degeneration+and+regenerative+therapy.">Organ culture bioreactors--platforms to study human intervertebral disc degeneration and regenerative therapy.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therapy. 10 (4), 339-352 (2015).</li><li>Boubriak, O. A., Watson, N., Sivan, S. S., Stubbens, N., Urban, J. P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+regulating+viable+cell+density+in+the+intervertebral+disc:+blood+supply+in+relation+to+disc+height.">Factors regulating viable cell density in the intervertebral disc: blood supply in relation to disc height.</a> Journal of Anatomy. 222 (3), 341-348 (2013).</li><li>Maroudas, A., Stockwell, R. A., Nachemson, A., Urban, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+involved+in+the+nutrition+of+the+human+lumbar+intervertebral+disc:+cellularity+and+diffusion+of+glucose+in+vitro.">Factors involved in the nutrition of the human lumbar intervertebral disc: cellularity and diffusion of glucose in vitro.</a> Journal of Anatomy. 120, 113-130 (1975).</li><li>Beckstein, J. C., Sen, S., Schaer, T. P., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Animal+Discs+Used+in+Disc+Research+to+Human+Lumbar+Disc:+Axial+Compression+Mechanics+and+Glycosaminoglycan+Content.">Comparison of Animal Discs Used in Disc Research to Human Lumbar Disc: Axial Compression Mechanics and Glycosaminoglycan Content.</a> Spine. 33 (6), 166-173 (2008).</li><li>Walter, B. A., Illien-J&#252;nger, S., Nasser, P. R., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+bioreactor+system+for+dynamic+loading+and+mechanical+characterization+of+whole+human+intervertebral+discs+in+organ+culture.">Development and validation of a bioreactor system for dynamic loading and mechanical characterization of whole human intervertebral discs in organ culture.</a> Journal of Biomechanics. 47 (9), 2095-2101 (2014).</li><li>Rajan, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-Like+Receptor+4+(TLR4)+Expression+and+Stimulation+in+a+Model+of+Intervertebral+Disc+Inflammation+and+Degeneration.">Toll-Like Receptor 4 (TLR4) Expression and Stimulation in a Model of Intervertebral Disc Inflammation and Degeneration.</a> Spine. 38 (16), 1343-1351 (2013).</li><li>vanden Akker, G. G., Rorije, A. J., Davidson, E. N. B., vander Kraan, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+marker+genes+distinguish+inner+and+outer+annulus+fibrosus+from+nucleus+pulposus+tissue+in+the+bovine+intervertebral+disc.">Phenotypic marker genes distinguish inner and outer annulus fibrosus from nucleus pulposus tissue in the bovine intervertebral disc.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 25, 402 (2017).</li><li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cell+phenotype+induction+with+TGF-&#946;1+and+collagen-polyurethane+scaffold+for+annulus+fibrosus+rupture+repair.">Functional cell phenotype induction with TGF-&#946;1 and collagen-polyurethane scaffold for annulus fibrosus rupture repair.</a> European Cells &amp; Materials. 39, 1-17 (2020).</li><li>Risbud, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+phenotype+of+young+healthy+nucleus+pulposus+cells:+recommendations+of+the+Spine+Research+Interest+Group+at+the+2014+annual+ORS+meeting.">Defining the phenotype of young healthy nucleus pulposus cells: recommendations of the Spine Research Interest Group at the 2014 annual ORS meeting.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 33 (3), 283-293 (2015).</li></ol>

Qui abbiamo fornito un protocollo dettagliato per simulare l'IVDD degenerativo e infiammatorio. Questo protocollo può essere applicato per esami dettagliati delle vie infiammatorie che portano agli effetti distruttivi sul disco. Inoltre, il protocollo può aiutare a determinare obiettivi terapeutici promettenti coinvolti nella progressione della malattia.
Recentemente abbiamo dimostrato che il TNF-α ricombinante umano potrebbe indurre infiammazione nelle cellule NP sia bovine che umane<sup c...

Lo loto antisoccito (LBP) può colpire individui di tutte le età ed è una delle principali cause di disabilità intutto il mondo 1,2,3. Il costo totale associato a LBP supera $ 100 miliardi all'anno4,5. La degenerazione del disco intervertebrale sintomatico (IVD), una condizione caratterizzata da infiammazione e degradazione dei tessuti, è una delle principali cause di LBP6,7. In particolare, l'IDD è caratterizzato da una rottura in graduale evoluzione della matrice extracellulare (ECM) dell'IVD, indotta e innescata da molteplici fattori che portano a una patologia accelerata, disturbi neurologici ed eventualmente disabilità. Inoltre, l'IDD è associato al rilascio di citochine proinfiammatorie, biomeccanica della colonna vertebrale alterata, angiogenesi e crescita nervosa, che aumenta la sensazione di dolore, causando del tutto LBP cronico (discopatia attiva)6,8. Ad oggi, le opzioni di trattamento includono discectomia e successiva fusione delle vertebre adiacenti, impianto di una protesi IVD o approcci non chirurgici, come farmaci antinfiammatori non steroidei, oppioidi e rilassanti muscolari per pazienti con IDD9. Entrambe le attuali opzioni terapeutiche standard, chirurgiche e non chirurgiche, sono solo parzialmente efficaci e non riescono ad affrontare il problema biologicosottostante 9,10. La malattia degenerativa del disco in fase iniziale è caratterizzata da una risposta iniziale del tessuto infiammatorio, in particolare un aumento dell'espressione fattore-alfa della necrosi tumorale (TNF-alfa)11. Questi primi cambiamenti del disco si verificano principalmente a livello cellulare senza interrompere l'architettura del disco e potrebbero in precedenza essere mimicked da carenza nutrizionale in condizioni pro-infiammatorie12. Pertanto, è fondamentale una simulazione precisa della situazione in vivo per indagare questi meccanismi di degenerazione e trovare obiettivi terapeutici adeguati. Inoltre, a queste simulazioni di proprietà molecolari, l'ambiente di carico meccanico dei dischi gioca un ruolo chiave nei cambiamenti patologici e fisiologici dell'IVD. Di conseguenza, combinare questi approcci ci farebbe fare un passo avanti per imitare il complesso microambiente dei D IVD in vivo. Attualmente non ci sono studi che considerino al meglio l'aspetto del carico dinamico insieme all'ambiente pro-infiammatorio e nutrizionale.
Sebbene i modelli animali di grandi dimensioni consentano di investigre potenziali interazioni in vivo pertinenti, sono costosi e richiede molto lavoro. Inoltre, poiché l'uso di modelli animali nella ricerca è stato a lungo oggetto di controversie, la riduzione del numero di animali necessari per rispondere a importanti domande di ricerca è di grande interesse. Infine, attualmente non esiste un modello animale ideale per imitare l'IDD nella ricerca IVD13,14. Pertanto, è necessario stabilire una sostituzione economica e affidabile, come un modello di coltura di organi per simulare l'IDD e i processi infiammatori e degenerativi associati. Recentemente, l'applicazione del presente protocollo sull'istituzione di un modello di coltura proinfiammatoria e degenerativa degli organi per simulare la malattia del disco intervertebrale in fase iniziale ci ha permesso di indagare l'effetto dei farmaci antinfiammatori nella coltura di organi IDD15.
Qui descriviamo come ottenere dischi intervertebrali bovini e induciamo lo stato di IDD in fase iniziale attraverso un microambiente catabolico e proinfiammatorio causato dall'iniezione intradiscale diretta di fattore alfa della necrosi tumorale (TNF-α) e dal carico degenerativo in un bioreattore in condizioni medie nutritive basse. La figura 1 illustra il modello sperimentale e mostra il bioreattore utilizzato per simulare le condizioni di carico degenerative e fisiologiche.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62100/62100fig01.jpg"> Figura 1: Illustrazione dell'impostazione sperimentale. A: coda bovina; B: dischi intervertebrali bovini sezionati; C: trasferimento del disco su una piastra di pozzo con mezzo di coltura; D: caricamento della simulazione in un bioreattore; E: tecnica di iniezione intradiscale; F: IVD dopo iniezione di pbs/tripano colorante blu per rivelare la distribuzione. IDD: degenerazione del disco intervertebrale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62100/62100fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Bromo-3-chloropropane(BCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>B9673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate-2-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band saw</td>
			<td>Exakt Apparatebau, Norderstedt, Germany</td>
			<td>model 30/833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Munndipharma, Frankfurt, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine IL-8 Do.it-Yourself ELISA</td>
			<td>Kingfisher Biotech, St. Paul, USA</td>
			<td>DIY1028B-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning ITS Premix</td>
			<td>Corning Inc., New York, USA</td>
			<td>354350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Gibco by life technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>10741574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>Gibco by life technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>11564446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol for molecular biology</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>09-0851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco by life technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>A4766801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acid solution</td>
			<td>Gibco by life technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin(P/S)</td>
			<td>gibco by life technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>11548876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution, tablet</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>10165921001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen, Sandiego, USA</td>
			<td>ant-pm-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulsavac Jet Lavage System</td>
			<td>Zimmer, IN,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>Quiagen, Venlo, Netherlands</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidinn-HRP</td>
			<td>Kingfisher Biotech, St. Paul, USA</td>
			<td>AR0068-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript VILO</td>
			<td>Invitrogen by life Technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>10704274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td>10400745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-alpha, recombinant human protein</td>
			<td>R&#38;D systems, Minnesota, USA</td>
			<td>210-TA-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI Reagent</td>
			<td>Molecular Research Center, Cincinnati, USA</td>
			<td>TR 118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA buffer solution</td>
			<td>sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>93283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene bIL-6</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td>Custom made probes</td>
			<td>Primer fw (5&#8242;&#8211;3&#8242;) TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A 
			Primer rev (5&#8242;&#8211;3&#8242;) TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTT 
			Probe (5&#8242;FAM/3&#8242;TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene bIL8</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td>Bt03211906_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene bTNF-alpha</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td>Custom made probes</td>
			<td>Primer fw (5&#8242;&#8211;3&#8242;) CCT CTT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A 
			Primer rev (5&#8242;&#8211;3&#8242;) GAG CTG CCC CGG AGA GTT 
			Probe (5&#8242;FAM/3&#8242;TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT ACC G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENE bIL1beta</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td>Custom made probes</td>
			<td>Primer fw (5&#8242;&#8211;3&#8242;) TTA CTA CAG TGA CGA GAA TGA GCT GTT 
			Primer rev (5&#8242;&#8211;3&#8242;) GGT CCA GGT GTT GGA TGC A 
			Probe (5&#8242;FAM/3&#8242;TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA GGG TCA TCA GCC TCA A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPLP0</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td>Bt03218086_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a proinflammatory, degenerative organ culture model to simulate early-stage intervertebral disc disease.

La degenerazione del disco intervertebrale sintomatico (IVD) (IDD) è un importante fardello socioeconomico ed è caratterizzata da infiammazione e degradazione dei tessuti. A causa della mancanza di terapie causali, c'è un'urgente necessità di modelli sperimentali innovativi di coltura degli organi per studiare i meccanismi coinvolti nella progressione della malattia, trovare obiettivi terapeutici e ridurre la necessità di modelli animali. Qui presentiamo un nuovo protocollo di modello tridimensionale di coltura di organi che imita il microambiente proinfiammatorio e catabolico, presente durante l'IDD. 
Inizialmente, gli IVD caudali bovini venivano sezionati, puliti e coltivati nel mezzo di coltura tissutale. Il carico fisiologico dinamico o patologico è stato applicato in un bioreattore su misura per 2 ore al giorno. Gli IVD sono stati assegnati a un gruppo di controllo (mezzo di glucosio elevato, carico fisiologico, iniezione salina tamponata da fosfati) e a un gruppo patologico (mezzo a basso glucosio, carico patologico, iniezione di fattore di necrosi tumorale-alfa) per quattro giorni. È stata eseguita l'analisi dell'espressione genica da cellule pulpose del nucleo raccolte degli IVD e il saggio immunoassorbente legato all'enzima del supporto di coltura degli organi condizionati. 
I nostri dati hanno rivelato una maggiore espressione di marcatori infiammatori e una riduzione dell'altezza del disco dopo il caricamento nel gruppo patologico rispetto al gruppo di controllo. Questo protocollo è affidabile per simulare l'infiammazione e la degenerazione dell'IVD e può essere ulteriormente ampliato per ampliare il suo ambito di applicazione.

Il carico degenerativo in mezzo a basso glucosio combinato con l'iniezione di TNF-α ha causato un aumento significativo dell'espressione genica dei marcatori proinfiammatori interleuchina 6 (IL-6) e interleuchina 8 (IL-8) rispetto al gruppo di controllo fisiologico nelle cellule NP dopo 4 giorni dicoltura (Figura 2). Al contrario, non abbiamo osservato cambiamenti significativi per i geni proinflammatori interleuchina 1β (IL-1β) e TNF-α nelle cellule NP (dati non mostrati). Inoltre, le c...

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A Proinflammatory, Degenerative Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease.

Questo protocollo presenta un nuovo modello sperimentale di coltura proinfiammatoria e degenerativa di organi bovini per simulare la degenerazione del disco intervertebrale in fase iniziale.

Un modello proinflammatorio di coltura degenerativa degli organi per simulare la malattia del disco intervertebrale in fase iniziale.

Symptomatic intervertebral disc (IVD) degeneration (IDD) is a major socioeconomic burden and is characterized by inflammation and tissue degradation. Due ...

Il protocollo mira a simulare condizioni in vivo di degenerazione del disco intervertebrale per studiarne la fisiopatologia senza la necessità di modelli animali. Rispetto alla coltura cellulare in vitro, la tecnica di coltura dell'organo bioreattore mantiene le cellule nel loro microambiente biologico e biomeccanico nativo oltre alla fornitura di una condizione di coltura controllabile e riproducibile. Iniziare con il risciacquo completo dell'intera coda bovina con acqua del rubinetto per rimuovere sporco e capelli sulla superficie, quindi immergere la coda in soluzione di betadina all'1% per 10 minuti per disinfettare la superficie.Utilizzare un bisturi numero 20 per rimuovere il tessuto molle dalla colonna vertebrale caudale per facilitare l'identificazione dei dischi intervertebrali o degli IVD. Rimuovere i processi spinosi e trasversali delle vertebre con una pinze per la rimozione ossea. Tagliare trasversalmente con pinze ossee attraverso il centro di ogni corpo vertebrale per ottenere singoli segmenti di movimento, quindi mettere i segmenti di movimento raccolti in una piastra di Petri con una garza bagnata nella soluzione di Ringer.Individuare l'IVD nelle vertebre spostando delicatamente i segmenti di movimento, quindi identificare la posizione della piastra di crescita toccando e trovando il lato convesso della piastra finale ossea. Raffreddare la lama della sega a nastro con la soluzione di Ringer e utilizzarla per effettuare due tagli paralleli nella piastra di crescita degli IVD, uno su ciascun lato. Trasferire gli IVD in una piastra di Petri pulita con garza pulita bagnata con la soluzione di Ringer.Raschiare il corpo vertebrale e la piastra di crescita usando la lama bisturi, lasciando intatta la piastra finale. Posizionare le due superfici piatte e parallele per la procedura di carico e trasferire gli IVD raschiati su una piastra di Petri fresca con garza bagnata con la soluzione di Ringer. Misurare l'altezza e il diametro del disco con una pinza, quindi pulire i coaguli di sangue nell'osso delle vertebre con la soluzione di Ringer utilizzando un sistema di lavanda a getto.Disinfettare gli IPID in PBS e al 10% di streptomicina penicillina con tremanti per 15 minuti. Risciacquare gli antibiotici ad alta concentrazione con PBS e 1%penicillina streptomicina. Trasferire dischi in camere IVD contenenti cinque millilitri di mezzo di coltura IVD e posizionarli nel sistema bioreattore con un incubatore a 37 gradi Celsius con umidità dell'85% e 5% di anidride carbonica.Coltura dei dischi per quattro giorni all'interno di un sistema bioreattore mantenendo condizioni di carico diverse a seconda dei gruppi sperimentali. Nel gruppo di controllo fisiologico, coltura gli IVD con mezzo di glucosio elevato utilizzando un protocollo di carico da 0,02 a 0,2 megapascal e 0,2 hertz per due ore al giorno. Nel gruppo patologico, coltura gli IVD con mezzo a basso contenuto di glucosio utilizzando un protocollo di carico da 0,32 a 0,5 megapascal e cinque hertz per due ore al giorno.Tra le procedure di carico, posizionare gli IVD in piastre a sei pozzi con sette millilitri di mezzo di coltura IVD per il recupero gratuito del gonfiore. Misurare l'altezza del disco ogni giorno con una pinza dopo il periodo di gonfiore libero e dopo il caricamento dinamico per la durata sperimentale. Dopo il primo ciclo di carico dinamico il primo giorno, posizionare direttamente gli IVD in una piastra di Petri in posizione verticale e stabilizzarli con una pinzetta.Iniettare il TNF-alfa ricombinante con un ago di insulina calibro 30 lentamente ad una velocità di circa 70 microlitri al minuto negli IVD del gruppo patologico. Dopo l'iniezione, tirare la siringa a metà strada e tirare lo stantuffo per creare un vuoto che impedisce la fuoriuscita della soluzione iniettata, quindi rimuovere completamente la siringa dall'IVD. Il carico degenerativo combinato con un limitato apporto nutrizionale e un'iniezione TNF-alfa ha causato un aumento significativo dell'espressione genica dei marcatori pro-infiammatori interleuchina sei e interleuchina otto nel tessuto NP dopo quattro giorni di coltura.L'interleuchina otto rilasci di proteine nel mezzo condizionato ha mostrato un marcato aumento del gruppo patologico nel secondo e quarto giorno. La riduzione dell'altezza del disco dopo il carico è stata più elevata nel gruppo patologico rispetto al gruppo fisiologico, e le differenze sono state più pronunciate dopo giorni due e tre rispetto al primo giorno, indicando un effetto progressivo delle condizioni degenerative e infiammatorie. Una tecnica standardizzata di dissezione è importante per i modelli di coltura di organi interi IVD riproducibili.Un bioreattore è necessario per applicare carichi fisiologici e degenerativi su IVD per simulare varie condizioni biomeccaniche in vivo. Questa tecnica può essere applicata su espianto IVD umano che è di alta rilevanza clinica. È un nuovo modello preclinico per lo sviluppo di trattamenti efficaci sulla degenerazione del disco in fase iniziale.

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