Name: a proinflammatory, degenerative organ culture model to simulate early-stage intervertebral disc disease.
Uploaded: 2021-02-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Proinflammatory, Degenerative Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease. at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av AO Foundation og AOSpine International. Babak Saravi fikk stipendstøtte fra den tyske ryggstiftelsen og den tyske osteoartrittstiftelsen. Gernot Lang ble støttet av Berta-Ottenstein-programmet for avanserte klinikerforskere, Det medisinske fakultet, Universitetet i Freiburg, Tyskland.

Eksperimenter ble utført ved hjelp av bovine haler hentet fra lokale abattoirer. De biologiske materialene som brukes i den aktuelle studien er hentet fra næringskjeden og krever ingen etisk godkjenning i sveitsisk og europeisk lov.
1. Disseksjon av den bovine intervertebrale platen
<ol><li>Skyll hele halen grundig med vann fra springen for å fjerne smuss og hår på overflaten. MERK: Med intakte, distale ender kan maksimalt 9 IVDer (coccygeal 1-9) per hale brukes til forsøkene avheng...

<ol>
	<li>Vos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+incidence,+prevalence,+and+years+lived+with+disability+for+328+diseases+and+injuries+for+195+countries,+1990-2016:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016.">Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).</li><li>Hoy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+global+burden+of+low+back+pain.">Measuring the global burden of low back pain.</a> Best Practice &amp; Research Clinical Rheumatology. 24 (2), 155-165 (2010).</li><li>Thiese, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+low+back+pain+by+anatomic+location+and+intensity+in+an+occupational+population.">Prevalence of low back pain by anatomic location and intensity in an occupational population.</a> BMC Musculoskeletal Disorders. 15 (1), 283 (2014).</li><li>Katz, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumbar+Disc+Disorders+and+Low-Back+Pain:+Socioeconomic+Factors+and+Consequences.">Lumbar Disc Disorders and Low-Back Pain: Socioeconomic Factors and Consequences.</a> The Journal of Bone and Joint Surgery (American). 88, 21 (2006).</li><li>Vlaeyen, J. W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+back+pain.">Low back pain.</a> Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 52 (2018).</li><li>Khan, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+biomarkers+of+low+back+pain+and+disc+degeneration:+a+review:+Biomarkers+of+disc+degeneration+and+back+pain.">Inflammatory biomarkers of low back pain and disc degeneration: a review: Biomarkers of disc degeneration and back pain.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1410 (1), 68-84 (2017).</li><li>Kim, H. S., Wu, P. H., Jang, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumbar+Degenerative+Disease+Part+1:+Anatomy+and+Pathophysiology+of+Intervertebral+Discogenic+Pain+and+Radiofrequency+Ablation+of+Basivertebral+and+Sinuvertebral+Nerve+Treatment+for+Chronic+Discogenic+Back+Pain:+A+Prospective+Case+Series+and+Review+of+Literature.">Lumbar Degenerative Disease Part 1: Anatomy and Pathophysiology of Intervertebral Discogenic Pain and Radiofrequency Ablation of Basivertebral and Sinuvertebral Nerve Treatment for Chronic Discogenic Back Pain: A Prospective Case Series and Review of Literature.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1483 (2020).</li><li>Adams, M. A., Roughley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+Intervertebral+Disc+Degeneration,+and+What+Causes+It.">What is Intervertebral Disc Degeneration, and What Causes It.</a> Spine. 31 (18), 2151-2161 (2006).</li><li>Wu, P. H., Kim, H. S., Jang, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intervertebral+Disc+Diseases+Part+2:+A+Review+of+the+Current+Diagnostic+and+Treatment+Strategies+for+Intervertebral+Disc+Disease.">Intervertebral Disc Diseases Part 2: A Review of the Current Diagnostic and Treatment Strategies for Intervertebral Disc Disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2135 (2020).</li><li>Lurie, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+Versus+Nonoperative+Treatment+for+Lumbar+Disc+Herniation:+Eight-Year+Results+for+the+Spine+Patient+Outcomes+Research+Trial.">Surgical Versus Nonoperative Treatment for Lumbar Disc Herniation: Eight-Year Results for the Spine Patient Outcomes Research Trial.</a> Spine. 39 (1), 3-16 (2014).</li><li>Risbud, M. V., Shapiro, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cytokines+in+intervertebral+disc+degeneration:+pain+and+disc+content.">Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content.</a> Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).</li><li>Ponnappan, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organ+culture+system+to+model+early+degenerative+changes+of+the+intervertebral+disc.">An organ culture system to model early degenerative changes of the intervertebral disc.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 13 (5), 171 (2011).</li><li>O'Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Animals+Used+in+Disc+Research+to+Human+Lumbar+Disc+Geometry.">Comparison of Animals Used in Disc Research to Human Lumbar Disc Geometry.</a> Spine. 32 (3), 328-333 (2007).</li><li>Stannard, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+whole+organ+culture+model+for+intervertebral+disc+disease.">Development of a whole organ culture model for intervertebral disc disease.</a> Journal of Orthopaedic Translation. 5, 1-8 (2016).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+ex-vivo+Testing+of+Anti-inflammatory+Drugs+in+a+Bovine+Intervertebral+Degenerative+Disc+Model.">Preclinical ex-vivo Testing of Anti-inflammatory Drugs in a Bovine Intervertebral Degenerative Disc Model.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 583 (2020).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+ex+vivo+cavity+model+to+study+repair+strategies+in+loaded+intervertebral+discs.">Development of an ex vivo cavity model to study repair strategies in loaded intervertebral discs.</a> European Spine Journal. 25 (9), 2898-2908 (2016).</li><li>Kazezian, Z., Li, Z., Alini, M., Grad, S., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+hyaluronic+acid+down-regulates+interferon+signaling+molecules,+IGFBP3+and+IFIT3+in+the+bovine+intervertebral+disc.">Injectable hyaluronic acid down-regulates interferon signaling molecules, IGFBP3 and IFIT3 in the bovine intervertebral disc.</a> Acta Biomaterialia. 52, 118-129 (2017).</li><li>Caprez, S., Menzel, U., Li, Z., Grad, S., Alini, M., Peroglio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+high-quality+RNA+from+intervertebral+disc+tissue+via+pronase+predigestion+and+tissue+pulverization.">Isolation of high-quality RNA from intervertebral disc tissue via pronase predigestion and tissue pulverization.</a> JOR Spine. 1 (2), 1017 (2018).</li><li>Lopa, S., Ceriani, C., Cecchinato, R., Zagra, L., Moretti, M., Colombini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+housekeeping+genes+in+human+intervertebral+disc,+endplate+and+articular+cartilage+cells+in+multiple+conditions+for+reliable+transcriptional+analysis.">Stability of housekeeping genes in human intervertebral disc, endplate and articular cartilage cells in multiple conditions for reliable transcriptional analysis.</a> European Cells &amp; Materials. 31, 395-406 (2016).</li><li>Lang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intervertebral+disc+whole+organ+culture+system+to+investigate+proinflammatory+and+degenerative+disc+disease+condition.">An intervertebral disc whole organ culture system to investigate proinflammatory and degenerative disc disease condition.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2051-2061 (2018).</li><li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+intervertebral+disc+cell+and+organ+culture+models+induced+by+tumor+necrosis+factor+alpha.">Proinflammatory intervertebral disc cell and organ culture models induced by tumor necrosis factor alpha.</a> JOR Spine. 3, 1104 (2020).</li><li>Purmessur, D., Walter, B. A., Roughley, P. J., Laudier, D. M., Hecht, A. C., Iatridis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+TNF&#945;+in+intervertebral+disc+degeneration:+A+non-recoverable+catabolic+shift.">A role for TNF&#945; in intervertebral disc degeneration: A non-recoverable catabolic shift.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 433 (1), 151-156 (2013).</li><li>Walter, B. A., Likhitpanichkul, M., Illien-Junger, S., Roughley, P. J., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF&#945;+Transport+Induced+by+Dynamic+Loading+Alters+Biomechanics+of+Intact+Intervertebral+Discs.">TNF&#945; Transport Induced by Dynamic Loading Alters Biomechanics of Intact Intervertebral Discs.</a> PLOS One. 10 (3), 0118358 (2015).</li><li>Gullbrand, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+animal+model+that+recapitulates+the+spectrum+of+human+intervertebral+disc+degeneration.">A large animal model that recapitulates the spectrum of human intervertebral disc degeneration.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 25 (1), 146-156 (2017).</li><li>Willems, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+intradiscal+injection+and+biocompatibility+of+polyester+amide+microspheres+in+a+canine+model+predisposed+to+intervertebral+disc+degeneration:+intradiscal+application+of+pea+microspheres.">Safety of intradiscal injection and biocompatibility of polyester amide microspheres in a canine model predisposed to intervertebral disc degeneration: intradiscal application of pea microspheres.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 105 (4), 707-714 (2017).</li><li>Michalek, A. J., Buckley, M. R., Bonassar, L. J., Cohen, I., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+needle+puncture+injury+on+microscale+shear+strain+in+the+intervertebral+disc+annulus+fibrosus.">The effects of needle puncture injury on microscale shear strain in the intervertebral disc annulus fibrosus.</a> The Spine Journal. 10 (12), 1098-1105 (2010).</li><li>Illien-J&#252;nger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combined+effects+of+limited+nutrition+and+high-frequency+loading+on+intervertebral+discs+with+endplates.">The combined effects of limited nutrition and high-frequency loading on intervertebral discs with endplates.</a> Spine. 35 (19), 1744-1752 (2010).</li><li>Gantenbein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+culture+bioreactors--platforms+to+study+human+intervertebral+disc+degeneration+and+regenerative+therapy.">Organ culture bioreactors--platforms to study human intervertebral disc degeneration and regenerative therapy.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therapy. 10 (4), 339-352 (2015).</li><li>Boubriak, O. A., Watson, N., Sivan, S. S., Stubbens, N., Urban, J. P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+regulating+viable+cell+density+in+the+intervertebral+disc:+blood+supply+in+relation+to+disc+height.">Factors regulating viable cell density in the intervertebral disc: blood supply in relation to disc height.</a> Journal of Anatomy. 222 (3), 341-348 (2013).</li><li>Maroudas, A., Stockwell, R. A., Nachemson, A., Urban, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+involved+in+the+nutrition+of+the+human+lumbar+intervertebral+disc:+cellularity+and+diffusion+of+glucose+in+vitro.">Factors involved in the nutrition of the human lumbar intervertebral disc: cellularity and diffusion of glucose in vitro.</a> Journal of Anatomy. 120, 113-130 (1975).</li><li>Beckstein, J. C., Sen, S., Schaer, T. P., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Animal+Discs+Used+in+Disc+Research+to+Human+Lumbar+Disc:+Axial+Compression+Mechanics+and+Glycosaminoglycan+Content.">Comparison of Animal Discs Used in Disc Research to Human Lumbar Disc: Axial Compression Mechanics and Glycosaminoglycan Content.</a> Spine. 33 (6), 166-173 (2008).</li><li>Walter, B. A., Illien-J&#252;nger, S., Nasser, P. R., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+bioreactor+system+for+dynamic+loading+and+mechanical+characterization+of+whole+human+intervertebral+discs+in+organ+culture.">Development and validation of a bioreactor system for dynamic loading and mechanical characterization of whole human intervertebral discs in organ culture.</a> Journal of Biomechanics. 47 (9), 2095-2101 (2014).</li><li>Rajan, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-Like+Receptor+4+(TLR4)+Expression+and+Stimulation+in+a+Model+of+Intervertebral+Disc+Inflammation+and+Degeneration.">Toll-Like Receptor 4 (TLR4) Expression and Stimulation in a Model of Intervertebral Disc Inflammation and Degeneration.</a> Spine. 38 (16), 1343-1351 (2013).</li><li>vanden Akker, G. G., Rorije, A. J., Davidson, E. N. B., vander Kraan, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+marker+genes+distinguish+inner+and+outer+annulus+fibrosus+from+nucleus+pulposus+tissue+in+the+bovine+intervertebral+disc.">Phenotypic marker genes distinguish inner and outer annulus fibrosus from nucleus pulposus tissue in the bovine intervertebral disc.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 25, 402 (2017).</li><li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cell+phenotype+induction+with+TGF-&#946;1+and+collagen-polyurethane+scaffold+for+annulus+fibrosus+rupture+repair.">Functional cell phenotype induction with TGF-&#946;1 and collagen-polyurethane scaffold for annulus fibrosus rupture repair.</a> European Cells &amp; Materials. 39, 1-17 (2020).</li><li>Risbud, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+phenotype+of+young+healthy+nucleus+pulposus+cells:+recommendations+of+the+Spine+Research+Interest+Group+at+the+2014+annual+ORS+meeting.">Defining the phenotype of young healthy nucleus pulposus cells: recommendations of the Spine Research Interest Group at the 2014 annual ORS meeting.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 33 (3), 283-293 (2015).</li></ol>

Vi har her gitt en detaljert protokoll for å simulere degenerativ og inflammatorisk IVDD. Denne protokollen kan brukes til detaljerte undersøkelser av inflammatoriske veier som fører til de ødeleggende effektene på platen. Videre kan protokollen bidra til å bestemme lovende terapeutiske mål involvert i sykdomsprogresjonen.
Vi viste nylig at human rekombinant TNF-α kunne indusere betennelse i både storfe og humane NP-celler21, som er i samsvar med andre studier ...

Ryggsmerter (LBP) kan påvirke individer i alle aldre og er en ledende årsak til funksjonshemming over hele verden1,2,3. Den totale kostnaden forbundet med LBP overstiger $ 100 milliarder per år4,5. Symptomatisk intervertebrale plate (IVD) degenerasjon (IDD), en tilstand preget av betennelse og vevsforringelse, er en viktig årsak til LBP6,7. Spesielt er IDD preget av en gradvis utviklende nedbrytning av IVDs ekstracellulære matrise (ECM), indusert og utløst av flere faktorer som fører til en akselerert patologi, nevrologiske lidelser og til slutt funksjonshemming. Videre er IDD forbundet med frigjøring av proinflammatoriske cytokiner, endret ryggbiomekanikk, angiogenese og nervevekst, noe som øker smertefølelsen, og til sammen forårsaker kronisk LBP (aktiv diskopati)6,8. Til dags dato inkluderer behandlingsalternativer diskektomi og påfølgende fusjon av tilstøtende ryggvirvler, implantasjon av en IVD-protese eller ikke-kirurgiske tilnærminger, for eksempel ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler, opioider og muskelavslappende midler for pasienter med IDD9. Både nåværende standard terapeutiske alternativer, kirurgiske og ikke-kirurgiske, er bare delvis effektive og unnlater å løse det underliggende biologiske problemet9,10. Tidlig degenerasjons skivesykdom er preget av en innledende inflammatorisk vevsrespons, spesielt en økning i tumornekrosefaktor-alfa (TNF-alfa) uttrykk11. Disse tidlige plateendringene skjer hovedsakelig på cellenivå uten å forstyrre platearkitekturen og kan tidligere etterlignes av ernæringsmessig mangel under proinflammatoriske forhold12. Derfor er presis simulering av in vivo-situasjonen for å undersøke disse degenerasjonsmekanismene og finne egnede terapeutiske mål avgjørende. I tillegg, til disse simuleringene av molekylære egenskaper, spiller det mekaniske lastemiljøet til platene en nøkkelrolle i patologiske og fysiologiske endringer av IVD. Følgelig vil det å kombinere disse tilnærmingene bringe oss et skritt fremover for å etterligne det komplekse mikromiljøet av IVDer in vivo. Det er for tiden ingen studier som vurderer aspektet av dynamisk lasting sammen med den proinflammatoriske og ernæringsmessige innstillingen etter beste evne.
Selv om store dyremodeller tillater undersøkelse av potensielle relevante in vivo-interaksjoner, er de kostbare og arbeidsintensive. Ettersom bruk av dyremodeller i forskning lenge har vært et spørsmål om kontrovers, er reduksjonen av antall dyr som trengs for å svare på viktige forskningsspørsmål av stor interesse. Til slutt er det for øyeblikket ingen ideell dyremodell for å etterligne IDD i IVD-forskning13,14. Derfor er det nødvendig å etablere en kostnadseffektiv og pålitelig erstatning, for eksempel en organkulturmodell for å simulere IDD og tilhørende inflammatoriske og degenerative prosesser. Nylig tillot anvendelsen av den nåværende protokollen om etablering av en proinflammatorisk og degenerativ organkulturmodell for å simulere mellomvirvelskivesykdom i tidlig fase oss å undersøke effekten av antiinflammatoriske legemidler i IDD-organkulturen15.
Her beskriver vi hvordan du oppnår bovine intervertebrale plater og induserer tilstanden til tidlig stadium IDD via en katabolsk og proinflammatorisk mikromiljø forårsaket av direkte intradiskal injeksjon av tumornekrosefaktor-alfa (TNF-α) og degenerativ belastning i en bioreaktor under lave næringsrike middels forhold. Figur 1 illustrerer den eksperimentelle modellen og viser bioreaktoren som brukes til å simulere degenerative og fysiologiske belastningsforhold.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62100/62100fig01.jpg"> Figur 1: Illustrasjon av det eksperimentelle oppsettet. A: bovin hale; B: dissekerte bovine intervertebrale plater; C: overføring av platen til en brønnplate med kulturmedium; D: laste simuleringen i en bioreaktor; E: intradiskal injeksjonsteknikk; F: IVD etter injeksjon av PBS/trypan blå fargestoff for å avsløre distribusjon. IDD: mellomvirvelskive degenerasjon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62100/62100fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Bromo-3-chloropropane(BCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>B9673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate-2-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band saw</td>
			<td>Exakt Apparatebau, Norderstedt, Germany</td>
			<td>model 30/833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Munndipharma, Frankfurt, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine IL-8 Do.it-Yourself ELISA</td>
			<td>Kingfisher Biotech, St. Paul, USA</td>
			<td>DIY1028B-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning ITS Premix</td>
			<td>Corning Inc., New York, USA</td>
			<td>354350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Gibco by life technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>10741574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>Gibco by life technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>11564446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol for molecular biology</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>09-0851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco by life technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>A4766801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acid solution</td>
			<td>Gibco by life technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin(P/S)</td>
			<td>gibco by life technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>11548876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution, tablet</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>10165921001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen, Sandiego, USA</td>
			<td>ant-pm-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulsavac Jet Lavage System</td>
			<td>Zimmer, IN,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>Quiagen, Venlo, Netherlands</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidinn-HRP</td>
			<td>Kingfisher Biotech, St. Paul, USA</td>
			<td>AR0068-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript VILO</td>
			<td>Invitrogen by life Technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>10704274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td>10400745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-alpha, recombinant human protein</td>
			<td>R&#38;D systems, Minnesota, USA</td>
			<td>210-TA-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI Reagent</td>
			<td>Molecular Research Center, Cincinnati, USA</td>
			<td>TR 118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA buffer solution</td>
			<td>sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>93283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene bIL-6</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td>Custom made probes</td>
			<td>Primer fw (5&#8242;&#8211;3&#8242;) TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A 
			Primer rev (5&#8242;&#8211;3&#8242;) TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTT 
			Probe (5&#8242;FAM/3&#8242;TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene bIL8</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td>Bt03211906_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene bTNF-alpha</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td>Custom made probes</td>
			<td>Primer fw (5&#8242;&#8211;3&#8242;) CCT CTT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A 
			Primer rev (5&#8242;&#8211;3&#8242;) GAG CTG CCC CGG AGA GTT 
			Probe (5&#8242;FAM/3&#8242;TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT ACC G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENE bIL1beta</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td>Custom made probes</td>
			<td>Primer fw (5&#8242;&#8211;3&#8242;) TTA CTA CAG TGA CGA GAA TGA GCT GTT 
			Primer rev (5&#8242;&#8211;3&#8242;) GGT CCA GGT GTT GGA TGC A 
			Probe (5&#8242;FAM/3&#8242;TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA GGG TCA TCA GCC TCA A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPLP0</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td>Bt03218086_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a proinflammatory, degenerative organ culture model to simulate early-stage intervertebral disc disease.

Symptomatisk intervertebrale plate (IVD) degenerasjon (IDD) er en stor sosioøkonomisk byrde og er preget av betennelse og vevsforringelse. På grunn av mangel på årsakssammenhenger er det et presserende behov for innovative eksperimentelle organkulturmodeller for å studere mekanismene som er involvert i sykdomsprogresjonen, finne terapeutiske mål og redusere behovet for dyremodeller. Vi presenterer her en ny, tredimensjonal organkulturmodellprotokoll som etterligner det proinflammatoriske og katabolske mikromiljøet, som er til stede under IDD. 
I utgangspunktet ble bovine kaudale IVDer dissekert, rengjort og dyrket i vevskulturmediet. Dynamisk fysiologisk eller patologisk lasting ble brukt i en skreddersydd bioreaktor i 2 timer per dag. IVDer ble tildelt en kontrollgruppe (høyt glukosemedium, fysiologisk belastning, fosfatbufret saltvannsinjeksjon) og en patologisk gruppe (lavt glukosemedium, patologisk belastning, tumornekrosefaktor-alfainjeksjon) i fire dager. Genuttrykksanalyse fra innsamlede massosusceller av IVD-er og enzymbundet immunosorbentanalyse av de betingede organkulturmediene ble utført. 
Våre data avdekket et høyere uttrykk for inflammatoriske markører og reduserte skivehøyder etter lasting i den patologiske gruppen sammenlignet med kontrollgruppen. Denne protokollen er pålitelig for å simulere IVD-betennelse og degenerasjon og kan utvides ytterligere for å utvide applikasjonsomfanget.

Degenerativ belastning i lavt glukosemedium kombinert med TNF-α injeksjon forårsaket en betydelig økning av genuttrykket til proinflammatoriske markører interleukin 6 (IL-6) og interleukin 8 (IL-8) sammenlignet med den fysiologiske kontrollgruppen i NP-celler etter 4 dager med kultur (Figur 2). Derimot observerte vi ikke signifikante endringer for proinflammatoriske gener interleukin 1β (IL-1β) og TNF-α i NP-celler (data ikke vist). Videre endret degenerative kulturforhold ikke genutt...

Watch this Scientific Journal Video about A Proinflammatory, Degenerative Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease. at JoVE.com

A Proinflammatory, Degenerative Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease.

Denne protokollen presenterer en ny eksperimentell modell av proinflammatorisk, degenerativ bovinorgankultur for å simulere mellomvirvelskivedegenerering i tidlig fase.

En proinflammatorisk, degenerativ organkulturmodell for å simulere mellomvirvelskivesykdom i tidlig fase.

Symptomatic intervertebral disc (IVD) degeneration (IDD) is a major socioeconomic burden and is characterized by inflammation and tissue degradation. Due ...

Protokollen tar sikte på å simulere in vivo forhold til intervertebral plate degenerasjon for å undersøke sin patofysiologi uten behov for dyremodeller. Sammenlignet med in vitro cellekultur opprettholder bioreaktororgankulturteknikken cellene i deres innfødte biologiske og biomekaniske mikromiljø i tillegg til tilførselen av en kontrollerbar og reproduserbar kulturtilstand. Begynn med å skylle hele bovinhalen grundig med vann fra springen for å fjerne smuss og hår på overflaten, og senk deretter halen i 1% betadineoppløsning i 10 minutter for å desinfisere overflaten.Bruk et skalpellnummer 20 for å fjerne bløtvevet fra kaudal ryggraden for å lette identifiseringen av mellomvirvelskivene eller IVDene. Fjern spinøse og tverrgående prosesser i ryggvirvlene med en benfjerningstanser. Klipp tverrgående med bentangen gjennom midten av hver vertebrale kropp for å oppnå individuelle bevegelsessegmenter, og legg deretter de oppsamlede bevegelsessegmentene i en Petri-tallerken med en gasbind fuktet i Ringers løsning.Finn IVD i ryggvirvler ved å flytte bevegelsessegmentene forsiktig, og identifiser deretter plasseringen av vekstplaten ved å berøre og finne den konvekse siden av den benete endeplaten. Avkjøl bladet på båndsagen med Ringers løsning og bruk den til å lage to parallelle kutt i vekstplaten på IVDene, en på hver side. Overfør IVDene til en ren Petri-tallerken med ren gasbind fuktet med Ringers løsning.Skrap av vertebrale kroppen og vekstplaten ved hjelp av skalpellbladet, slik at endeplaten er intakt. Plasser de to flatene flate og parallelle for lasteprosedyren og overfør skrapede IVDer til en frisk Petri-tallerken med gasbind fuktet med Ringers løsning. Mål skivehøyden og diameteren med et kaliper, og rengjør deretter blodproppene i ryggvirvlene med Ringers løsning ved hjelp av et jettoppsystem.Desinfiser IVDer i PBS og 10% penicillin streptomycin med risting i 15 minutter. Skyll av antibiotika med høy konsentrasjon med PBS og 1% penicillin streptomycin. Overfør plater til IVD-kamre som inneholder fem milliliter IVD-kulturmedium og plasser dem i bioreaktorsystemet med en inkubator ved 37 grader Celsius med 85% fuktighet og 5% karbondioksid.Kultur diskene i fire dager innenfor et bioreaktorsystem ved å opprettholde ulike lasteforhold i henhold til eksperimentelle grupper. I den fysiologiske kontrollgruppen, kultur IVDene med høyt glukosemedium ved hjelp av en lasteprotokoll på 0,02 til 0,2 megapascals og 0,2 hertz i to timer per dag. I den patologiske gruppen, kultur IVDene med lavt glukosemedium ved hjelp av en lasteprotokoll på 0,32 til 0,5 megapascals og fem hertz i to timer per dag.Mellom lasteprosedyrene plasserer du IVD-ene i seks brønnplater med syv milliliter IVD-kulturmedium for fri hevelse. Mål platehøyden daglig med et kaliper etter den frie hevelsesperioden og etter dynamisk lasting for eksperimentell varighet. Etter den første dynamiske lastesyklusen på dag én, plasser IVDene direkte i en Petri-tallerken i vertikal stilling og stabiliser dem med en pinsett.Injiser rekombinant TNF-alfa med en 30-gauge insulinnål sakte med en hastighet på ca. 70 mikroliter per minutt i IVDene til den patologiske gruppen. Etter injisering trekker du sprøyten halvveis tilbake og trekker stempelet for å lage et vakuum som forhindrer at den injiserte løsningen lekker, og fjern deretter sprøyten helt fra IVD. Degenerativ lasting kombinert med begrenset ernæringsforsyning og en TNF-alfa-injeksjon forårsaket en betydelig økning i genuttrykket til proinflammatoriske markører interleukin seks og interleukin åtte i NP vev etter fire dager med kultur.Interleukin åtte proteinutslipp i det betingede mediet viste en markert økning i den patologiske gruppen på dag to og dag fire. Skivehøydereduksjon etter lasting var høyere i den patologiske gruppen sammenlignet med den fysiologiske gruppen, og forskjellene ble mer uttalt etter dag to og tre sammenlignet med dag én, noe som indikerer en progressiv effekt av degenerative og inflammatoriske forhold. En standardisert disseksjonsteknikk er viktig for reproduserbare IVD helorgankulturmodeller.En bioreaktor er nødvendig for å bruke fysiologiske og degenerative belastninger på IVDer for å simulere ulike in vivo biomekaniske forhold. Denne teknikken kan brukes på menneskelige IVD-uttrekninger som er av høy klinisk relevans. Det er en ny preklinisk modell for å utvikle effektive behandlinger på tidlig stadium disk degenerasjon.

Research

JoVE Journal

Medicine

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Murine Hornhinnen Transplantasjon: En modell for å studere den vanligste formen for organtransplantasjon

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Måte Isolert<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Lung Perfusjons i en Rat Modell: Erfaringer fra å utvikle en Rat EVLP Program

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

A Model to Simulate Clinically Relevant Hypoxia in Humans

En modell for å simulere klinisk relevant Hypoksi i Humans

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to ...

Ovine Lumbar Intervertebral Disc Degeneration Model Utilizing a Lateral Retroperitoneal Drill Bit Injury

Ovine Lumbar Intervertebral Disc Degeneration Model Bruke en lateral retroperitoneal Drill Bit Skade

Intervertebral disc degeneration is a significant contributor to the development of back pain and the leading cause of disability worldwide. Numerous ...

A Cell Culture Model of Resistance Arteries

En celle kultur modell av motstand arterier

The myoendothelial junction (MEJ), a unique signaling microdomain in small diameter resistance arteries, exhibits localization of specific proteins and ...

A Protocol to Acquire the Degenerative Tenocyte from Humans

En protokoll for å skaffe det utarte Tenocyte fra mennesker

Tendinopathy, a painful condition that develops in response to tendon degeneration, is on the rise in the developed world due to increasing physical ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrisk Contractility måling av musen hvem arterien bruker Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex Vivo sårtilheling hornhinnen Organ kultur modell for studier

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons

En svin hornhinnen endothelial organ kultur modell ved hjelp av Split hornhinne knapper

Experimental research on corneal endothelial cells is associated with several difficulties. Human donor corneas are scarce and rarely available for ...

A Rat Lung Transplantation Model of Warm Ischemia/Reperfusion Injury: Optimizations to Improve Outcomes

En rottelungetransplantasjonsmodell av varm iskemi / reperfusjonsskade: optimaliseringer for å forbedre resultatene

From our experience with rat lung transplantation, we have found several areas for improvement. Information in the existing literature regarding methods ...