Name: a proinflammatory, degenerative organ culture model to simulate early-stage intervertebral disc disease.
Uploaded: 2021-02-14T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Proinflammatory, Degenerative Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease. at JoVE.com

Detta arbete stöddes av AO Foundation och AOSpine International. Babak Saravi fick stipendiestöd från tyska Ryggradsstiftelsen och tyska Artrosstiftelsen. Gernot Lang stöddes av Berta-Ottenstein-programmet för avancerade kliniker, medicinska fakulteten, universitetet i Freiburg, Tyskland.

Försök utfördes med hjälp av nötkreaturssvansar från lokala slakterier. De biologiska material som används i den aktuella studien är tagna från livsmedelskedjan och kräver inget etiskt godkännande i schweizisk och europeisk lagstiftning.
1. Dissekering av bovin intervertebral skiva
<ol><li>Skölj hela svansen noggrant med kranvatten för att avlägsna smuts och hår på ytan. OBS: Med intakta, distala ändar kan högst 9 IVDs (coccygeal 1-9) per svans användas för experimente...

<ol>
	<li>Vos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+incidence,+prevalence,+and+years+lived+with+disability+for+328+diseases+and+injuries+for+195+countries,+1990-2016:+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016.">Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 328 diseases and injuries for 195 countries, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> The Lancet. 390 (10100), 1211-1259 (2017).</li><li>Hoy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+the+global+burden+of+low+back+pain.">Measuring the global burden of low back pain.</a> Best Practice &amp; Research Clinical Rheumatology. 24 (2), 155-165 (2010).</li><li>Thiese, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+low+back+pain+by+anatomic+location+and+intensity+in+an+occupational+population.">Prevalence of low back pain by anatomic location and intensity in an occupational population.</a> BMC Musculoskeletal Disorders. 15 (1), 283 (2014).</li><li>Katz, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumbar+Disc+Disorders+and+Low-Back+Pain:+Socioeconomic+Factors+and+Consequences.">Lumbar Disc Disorders and Low-Back Pain: Socioeconomic Factors and Consequences.</a> The Journal of Bone and Joint Surgery (American). 88, 21 (2006).</li><li>Vlaeyen, J. W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+back+pain.">Low back pain.</a> Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 52 (2018).</li><li>Khan, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+biomarkers+of+low+back+pain+and+disc+degeneration:+a+review:+Biomarkers+of+disc+degeneration+and+back+pain.">Inflammatory biomarkers of low back pain and disc degeneration: a review: Biomarkers of disc degeneration and back pain.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1410 (1), 68-84 (2017).</li><li>Kim, H. S., Wu, P. H., Jang, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lumbar+Degenerative+Disease+Part+1:+Anatomy+and+Pathophysiology+of+Intervertebral+Discogenic+Pain+and+Radiofrequency+Ablation+of+Basivertebral+and+Sinuvertebral+Nerve+Treatment+for+Chronic+Discogenic+Back+Pain:+A+Prospective+Case+Series+and+Review+of+Literature.">Lumbar Degenerative Disease Part 1: Anatomy and Pathophysiology of Intervertebral Discogenic Pain and Radiofrequency Ablation of Basivertebral and Sinuvertebral Nerve Treatment for Chronic Discogenic Back Pain: A Prospective Case Series and Review of Literature.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 1483 (2020).</li><li>Adams, M. A., Roughley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+Intervertebral+Disc+Degeneration,+and+What+Causes+It.">What is Intervertebral Disc Degeneration, and What Causes It.</a> Spine. 31 (18), 2151-2161 (2006).</li><li>Wu, P. H., Kim, H. S., Jang, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intervertebral+Disc+Diseases+Part+2:+A+Review+of+the+Current+Diagnostic+and+Treatment+Strategies+for+Intervertebral+Disc+Disease.">Intervertebral Disc Diseases Part 2: A Review of the Current Diagnostic and Treatment Strategies for Intervertebral Disc Disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (6), 2135 (2020).</li><li>Lurie, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgical+Versus+Nonoperative+Treatment+for+Lumbar+Disc+Herniation:+Eight-Year+Results+for+the+Spine+Patient+Outcomes+Research+Trial.">Surgical Versus Nonoperative Treatment for Lumbar Disc Herniation: Eight-Year Results for the Spine Patient Outcomes Research Trial.</a> Spine. 39 (1), 3-16 (2014).</li><li>Risbud, M. V., Shapiro, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cytokines+in+intervertebral+disc+degeneration:+pain+and+disc+content.">Role of cytokines in intervertebral disc degeneration: pain and disc content.</a> Nature Reviews Rheumatology. 10 (1), 44-56 (2014).</li><li>Ponnappan, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+organ+culture+system+to+model+early+degenerative+changes+of+the+intervertebral+disc.">An organ culture system to model early degenerative changes of the intervertebral disc.</a> Arthritis Research &amp; Therapy. 13 (5), 171 (2011).</li><li>O'Connell, G. D., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Animals+Used+in+Disc+Research+to+Human+Lumbar+Disc+Geometry.">Comparison of Animals Used in Disc Research to Human Lumbar Disc Geometry.</a> Spine. 32 (3), 328-333 (2007).</li><li>Stannard, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+whole+organ+culture+model+for+intervertebral+disc+disease.">Development of a whole organ culture model for intervertebral disc disease.</a> Journal of Orthopaedic Translation. 5, 1-8 (2016).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+ex-vivo+Testing+of+Anti-inflammatory+Drugs+in+a+Bovine+Intervertebral+Degenerative+Disc+Model.">Preclinical ex-vivo Testing of Anti-inflammatory Drugs in a Bovine Intervertebral Degenerative Disc Model.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 583 (2020).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+ex+vivo+cavity+model+to+study+repair+strategies+in+loaded+intervertebral+discs.">Development of an ex vivo cavity model to study repair strategies in loaded intervertebral discs.</a> European Spine Journal. 25 (9), 2898-2908 (2016).</li><li>Kazezian, Z., Li, Z., Alini, M., Grad, S., Pandit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+hyaluronic+acid+down-regulates+interferon+signaling+molecules,+IGFBP3+and+IFIT3+in+the+bovine+intervertebral+disc.">Injectable hyaluronic acid down-regulates interferon signaling molecules, IGFBP3 and IFIT3 in the bovine intervertebral disc.</a> Acta Biomaterialia. 52, 118-129 (2017).</li><li>Caprez, S., Menzel, U., Li, Z., Grad, S., Alini, M., Peroglio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+high-quality+RNA+from+intervertebral+disc+tissue+via+pronase+predigestion+and+tissue+pulverization.">Isolation of high-quality RNA from intervertebral disc tissue via pronase predigestion and tissue pulverization.</a> JOR Spine. 1 (2), 1017 (2018).</li><li>Lopa, S., Ceriani, C., Cecchinato, R., Zagra, L., Moretti, M., Colombini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+housekeeping+genes+in+human+intervertebral+disc,+endplate+and+articular+cartilage+cells+in+multiple+conditions+for+reliable+transcriptional+analysis.">Stability of housekeeping genes in human intervertebral disc, endplate and articular cartilage cells in multiple conditions for reliable transcriptional analysis.</a> European Cells &amp; Materials. 31, 395-406 (2016).</li><li>Lang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+intervertebral+disc+whole+organ+culture+system+to+investigate+proinflammatory+and+degenerative+disc+disease+condition.">An intervertebral disc whole organ culture system to investigate proinflammatory and degenerative disc disease condition.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (4), 2051-2061 (2018).</li><li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proinflammatory+intervertebral+disc+cell+and+organ+culture+models+induced+by+tumor+necrosis+factor+alpha.">Proinflammatory intervertebral disc cell and organ culture models induced by tumor necrosis factor alpha.</a> JOR Spine. 3, 1104 (2020).</li><li>Purmessur, D., Walter, B. A., Roughley, P. J., Laudier, D. M., Hecht, A. C., Iatridis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+TNF&#945;+in+intervertebral+disc+degeneration:+A+non-recoverable+catabolic+shift.">A role for TNF&#945; in intervertebral disc degeneration: A non-recoverable catabolic shift.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 433 (1), 151-156 (2013).</li><li>Walter, B. A., Likhitpanichkul, M., Illien-Junger, S., Roughley, P. J., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF&#945;+Transport+Induced+by+Dynamic+Loading+Alters+Biomechanics+of+Intact+Intervertebral+Discs.">TNF&#945; Transport Induced by Dynamic Loading Alters Biomechanics of Intact Intervertebral Discs.</a> PLOS One. 10 (3), 0118358 (2015).</li><li>Gullbrand, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+animal+model+that+recapitulates+the+spectrum+of+human+intervertebral+disc+degeneration.">A large animal model that recapitulates the spectrum of human intervertebral disc degeneration.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 25 (1), 146-156 (2017).</li><li>Willems, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+intradiscal+injection+and+biocompatibility+of+polyester+amide+microspheres+in+a+canine+model+predisposed+to+intervertebral+disc+degeneration:+intradiscal+application+of+pea+microspheres.">Safety of intradiscal injection and biocompatibility of polyester amide microspheres in a canine model predisposed to intervertebral disc degeneration: intradiscal application of pea microspheres.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 105 (4), 707-714 (2017).</li><li>Michalek, A. J., Buckley, M. R., Bonassar, L. J., Cohen, I., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+needle+puncture+injury+on+microscale+shear+strain+in+the+intervertebral+disc+annulus+fibrosus.">The effects of needle puncture injury on microscale shear strain in the intervertebral disc annulus fibrosus.</a> The Spine Journal. 10 (12), 1098-1105 (2010).</li><li>Illien-J&#252;nger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+combined+effects+of+limited+nutrition+and+high-frequency+loading+on+intervertebral+discs+with+endplates.">The combined effects of limited nutrition and high-frequency loading on intervertebral discs with endplates.</a> Spine. 35 (19), 1744-1752 (2010).</li><li>Gantenbein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+culture+bioreactors--platforms+to+study+human+intervertebral+disc+degeneration+and+regenerative+therapy.">Organ culture bioreactors--platforms to study human intervertebral disc degeneration and regenerative therapy.</a> Current Stem Cell Research &amp; Therapy. 10 (4), 339-352 (2015).</li><li>Boubriak, O. A., Watson, N., Sivan, S. S., Stubbens, N., Urban, J. P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+regulating+viable+cell+density+in+the+intervertebral+disc:+blood+supply+in+relation+to+disc+height.">Factors regulating viable cell density in the intervertebral disc: blood supply in relation to disc height.</a> Journal of Anatomy. 222 (3), 341-348 (2013).</li><li>Maroudas, A., Stockwell, R. A., Nachemson, A., Urban, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+involved+in+the+nutrition+of+the+human+lumbar+intervertebral+disc:+cellularity+and+diffusion+of+glucose+in+vitro.">Factors involved in the nutrition of the human lumbar intervertebral disc: cellularity and diffusion of glucose in vitro.</a> Journal of Anatomy. 120, 113-130 (1975).</li><li>Beckstein, J. C., Sen, S., Schaer, T. P., Vresilovic, E. J., Elliott, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Animal+Discs+Used+in+Disc+Research+to+Human+Lumbar+Disc:+Axial+Compression+Mechanics+and+Glycosaminoglycan+Content.">Comparison of Animal Discs Used in Disc Research to Human Lumbar Disc: Axial Compression Mechanics and Glycosaminoglycan Content.</a> Spine. 33 (6), 166-173 (2008).</li><li>Walter, B. A., Illien-J&#252;nger, S., Nasser, P. R., Hecht, A. C., Iatridis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+bioreactor+system+for+dynamic+loading+and+mechanical+characterization+of+whole+human+intervertebral+discs+in+organ+culture.">Development and validation of a bioreactor system for dynamic loading and mechanical characterization of whole human intervertebral discs in organ culture.</a> Journal of Biomechanics. 47 (9), 2095-2101 (2014).</li><li>Rajan, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-Like+Receptor+4+(TLR4)+Expression+and+Stimulation+in+a+Model+of+Intervertebral+Disc+Inflammation+and+Degeneration.">Toll-Like Receptor 4 (TLR4) Expression and Stimulation in a Model of Intervertebral Disc Inflammation and Degeneration.</a> Spine. 38 (16), 1343-1351 (2013).</li><li>vanden Akker, G. G., Rorije, A. J., Davidson, E. N. B., vander Kraan, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+marker+genes+distinguish+inner+and+outer+annulus+fibrosus+from+nucleus+pulposus+tissue+in+the+bovine+intervertebral+disc.">Phenotypic marker genes distinguish inner and outer annulus fibrosus from nucleus pulposus tissue in the bovine intervertebral disc.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 25, 402 (2017).</li><li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cell+phenotype+induction+with+TGF-&#946;1+and+collagen-polyurethane+scaffold+for+annulus+fibrosus+rupture+repair.">Functional cell phenotype induction with TGF-&#946;1 and collagen-polyurethane scaffold for annulus fibrosus rupture repair.</a> European Cells &amp; Materials. 39, 1-17 (2020).</li><li>Risbud, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+phenotype+of+young+healthy+nucleus+pulposus+cells:+recommendations+of+the+Spine+Research+Interest+Group+at+the+2014+annual+ORS+meeting.">Defining the phenotype of young healthy nucleus pulposus cells: recommendations of the Spine Research Interest Group at the 2014 annual ORS meeting.</a> Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 33 (3), 283-293 (2015).</li></ol>

Vi här tillhandahöll ett detaljerat protokoll för att simulera degenerativ och inflammatorisk IVDD. Detta protokoll kan tillämpas för detaljerade undersökningar av inflammatoriska vägar som leder till de destruktiva effekterna på skivan. Dessutom kan protokollet hjälpa till att bestämma lovande terapeutiska mål som är involverade i sjukdomsförloppet.
Vi visade nyligen att mänskliga rekombinanta TNF-α kan inducera inflammation i både nötkreatur och mänskligaN...

Låg ryggsmärta (LBP) kan påverka individer i alla åldrar och är en ledande orsak till funktionshinder överhela världen 1,2,3. Den totala kostnaden i samband med LBP överstiger 100 miljarder USD per år4,5. Symptomatiskt intervertebral skiva (IVD) degeneration (IDD), ett tillstånd som kännetecknas av inflammation och vävnad nedbrytning, är en viktig orsak till LBP6,7. Specifikt kännetecknas IDD av en gradvis utvecklande nedbrytning av IVD: s extracellulära matris (ECM), inducerad och utlöst av flera faktorer som leder till en accelererad patologi, neurologiska störningar och så småningom funktionshinder. Dessutom är IDD förknippat med frisättning av proinflammatoriska cytokiner, förändrad ryggradsbiomekanik, angiogenes och nervväxt, vilket ökar smärtsensationen, vilket helt orsakar kronisk LBP (aktiv discopati)6,8. Hittills inkluderar behandlingsalternativ diskektomi och efterföljande fusion av angränsande ryggkotor, implantation av en IVD-protes eller icke-kirurgiska metoder, såsom icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel, opioider och muskelavslappnande medel för patienter med IDD9. Båda nuvarande standard terapeutiska alternativ, kirurgiska och icke-kirurgiska, är bara delvis effektiva och misslyckas med att ta itu med det underliggande biologiskaproblemet 9,10. Tidig degenerativ skivsjukdom kännetecknas av en första inflammatorisk vävnad svar, särskilt en ökning av tumör nekros faktor-alfa (TNF-alfa) uttryck11. Dessa tidiga skivförändringar sker främst på cellnivå utan att störa skivarkitekturen och kan tidigare efterliknas av näringsbrist under proinflammatoriska tillstånd12. Därför är exakt simulering av in vivo-situationen för att undersöka dessa degenerationsmekanismer och hitta lämpliga terapeutiska mål avgörande. Dessutom, till dessa simuleringar av molekylära egenskaper, spelar den mekaniska laddningsmiljön för skivorna en nyckelroll i patologiska och fysiologiska förändringar av IVD. Att kombinera dessa tillvägagångssätt skulle därför föra oss ett steg framåt för att efterlikna den komplexa mikromiljön för IVD-ämnen in vivo. Det finns för närvarande inga studier som tar hänsyn till aspekten av dynamisk lastning tillsammans med den proinflammatoriska och näringsmässiga inställningen efter bästa kunskap.
Även om stora djurmodeller gör det möjligt att undersökning av potentiella relevanta in vivo-interaktioner, är de kostsamma och arbetsintensiva. Eftersom användningen av djurmodeller i forskning länge har varit en tvistefråga är minskningen av antalet djur som behövs för att besvara viktiga forskningsfrågor av stort intresse. Slutligen finns det för närvarande ingen idealisk djurmodell för att efterlikna IDD i IVD-forskning13,14. Därför är det nödvändigt att upprätta en kostnadseffektiv och pålitlig ersättning, till exempel en organkulturmodell för att simulera IDD och tillhörande inflammatoriska och degenerativa processer. Nyligen tillät tillämpningen av det nuvarande protokollet om upprättandet av en proinflammatorisk och degenerativ organkulturmodell för att simulera intervertebral disc disease i ett tidigt skede oss att undersöka effekten av antiinflammatoriska läkemedel i IDD organkultur15.
Här beskriver vi hur man får nötkreatur intervertebral skivor och inducera tillståndet av tidiga IDD via en katabol och proinflammatory microenvironment orsakas av direkt intradiscal injektion av tumör nekros faktor-alfa (TNF-α) och degenerativ belastning i en bioreaktor under låga näringsrika medium villkor. Figur 1 illustrerar den experimentella modellen och visar den bioreaktor som används för att simulera degenerativa och fysiologiska belastningsförhållanden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62100/62100fig01.jpg"> Bild 1: Illustration av den experimentella inställningen. A: nötkreaturssvans. B: dissekerade bovina intervertebral skivor, C: överföring av skivan till en brunnsplatta med odlingsmedium; D: Lastning av simuleringen i en bioreaktor. E: intradiscal injektionsteknik; F: IVD efter injektion av PBS/trypan blå färgämne för att avslöja distribution. IDD: degenerering av intervertebral skiva. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62100/62100fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-Bromo-3-chloropropane(BCP)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>B9673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbate-2-phosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>A8960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Band saw</td>
			<td>Exakt Apparatebau, Norderstedt, Germany</td>
			<td>model 30/833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine</td>
			<td>Munndipharma, Frankfurt, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine IL-8 Do.it-Yourself ELISA</td>
			<td>Kingfisher Biotech, St. Paul, USA</td>
			<td>DIY1028B-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning ITS Premix</td>
			<td>Corning Inc., New York, USA</td>
			<td>354350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Gibco by life technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>10741574</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>Gibco by life technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>11564446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol for molecular biology</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>09-0851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco by life technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>A4766801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acid solution</td>
			<td>Gibco by life technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>11140050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin(P/S)</td>
			<td>gibco by life technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>11548876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution, tablet</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>10165921001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen, Sandiego, USA</td>
			<td>ant-pm-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulsavac Jet Lavage System</td>
			<td>Zimmer, IN,USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TissueLyser II</td>
			<td>Quiagen, Venlo, Netherlands</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidinn-HRP</td>
			<td>Kingfisher Biotech, St. Paul, USA</td>
			<td>AR0068-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superscript VILO</td>
			<td>Invitrogen by life Technologies, Carlsbad, USA</td>
			<td>10704274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td>10400745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Universal Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-alpha, recombinant human protein</td>
			<td>R&#38;D systems, Minnesota, USA</td>
			<td>210-TA-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRI Reagent</td>
			<td>Molecular Research Center, Cincinnati, USA</td>
			<td>TR 118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA buffer solution</td>
			<td>sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td>
			<td>93283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene bIL-6</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td>Custom made probes</td>
			<td>Primer fw (5&#8242;&#8211;3&#8242;) TTC CAA AAA TGG AGG AAA AGG A 
			Primer rev (5&#8242;&#8211;3&#8242;) TCC AGA AGA CCA GCA GTG GTT 
			Probe (5&#8242;FAM/3&#8242;TAMRA) CTT CCA ATC TGG GTT CAA TCA GGC GATT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene bIL8</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td>Bt03211906_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene bTNF-alpha</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td>Custom made probes</td>
			<td>Primer fw (5&#8242;&#8211;3&#8242;) CCT CTT CTC AAG CCT CAA GTA ACA A 
			Primer rev (5&#8242;&#8211;3&#8242;) GAG CTG CCC CGG AGA GTT 
			Probe (5&#8242;FAM/3&#8242;TAMRA) ATG TCG GCT ACA ACG TGG GCT ACC G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GENE bIL1beta</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td>Custom made probes</td>
			<td>Primer fw (5&#8242;&#8211;3&#8242;) TTA CTA CAG TGA CGA GAA TGA GCT GTT 
			Primer rev (5&#8242;&#8211;3&#8242;) GGT CCA GGT GTT GGA TGC A 
			Probe (5&#8242;FAM/3&#8242;TAMRA) CTC TTC ATC TGT TTA GGG TCA TCA GCC TCA A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPLP0</td>
			<td>Applied Biosystems by life technologies</td>
			<td>Bt03218086_m1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a proinflammatory, degenerative organ culture model to simulate early-stage intervertebral disc disease.

Symptomatiskt intervertebral skiva (IVD) degeneration (IDD) är en stor socioekonomisk börda och kännetecknas av inflammation och vävnad nedbrytning. På grund av bristen på orsakssambehandlingar finns det ett akut behov av innovativa experimentella organkulturmodeller för att studera mekanismerna i sjukdomsförloppet, hitta terapeutiska mål och minska behovet av djurmodeller. Vi presenterar här ett nytt, tredimensionellt organkulturmodellprotokoll som efterliknar den proinflammatoriska och katabola mikromiljön, som finns under IDD. 
Ursprungligen dissekerades, rengjordes och odlades nötkreatur caudal IVDs i vävnad kultur medium. Dynamiska fysiologiska eller patologiskt belastning tillämpades i en skräddarsydd bioreaktor i 2 timmar per dag. IVDs tilldelades en kontrollgrupp (hög glukos medium, fysiologisk belastning, fosfat-buffrad saltlösning injektion) och en patologisk grupp (låg glukos medium, patologiska belastning, tumör nekros faktor-alfa injektion) i fyra dagar. Genuttryck analys från insamlade kärnan pulposus celler i IVDs och enzym-linked immunosorbent analys av de betingade organ kultur medier utfördes. 
Våra data visade ett högre uttryck för inflammatoriska markörer och minskade skivhöjder efter laddning i den patologiska gruppen jämfört med kontrollgruppen. Detta protokoll är tillförlitligt för att simulera IVD inflammation och degeneration och kan utökas ytterligare för att bredda dess tillämpningsomfång.

Degenerativ belastning i lågsockermedium i kombination med TNF- α injektion orsakade en betydande ökning av genuttrycket av proinflammatoriska markörer interleukin 6 (IL-6) och interleukin 8 (IL-8) jämfört med den fysiologiska kontrollgruppen i NP-celler efter 4 dagars kultur (figur 2). Däremot observerade vi inte signifikanta förändringar för proinflammatoriska gener interleukin 1β (IL-1β) och TNF-α i NP-celler (data visas inte). Degenerativa odling villkor ändrade inte gen ut...

Watch this Scientific Journal Video about A Proinflammatory, Degenerative Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease. at JoVE.com

A Proinflammatory, Degenerative Organ Culture Model to Simulate Early-Stage Intervertebral Disc Disease.

Detta protokoll presenterar en ny experimentell modell av proinflammatoriska, degenerativa nötkreatur organ kultur att simulera tidigt stadium intervertebral skiva degeneration.

En proinflammatorisk, degenerativ organkulturmodell för att simulera intervertebral disc disease i ett tidigt skede.

Symptomatic intervertebral disc (IVD) degeneration (IDD) is a major socioeconomic burden and is characterized by inflammation and tissue degradation. Due ...

Protokollet syftar till att simulera in vivo-förhållanden för intervertebral disc degeneration för att undersöka dess patofysiologi utan behov av djurmodeller. Jämfört med in vitro-cellkulturen upprätthåller bioreaktororgankulturtekniken cellerna i deras inhemska biologiska och biomekaniska mikromiljö utöver tillhandahållandet av ett kontrollerbart och reproducerbart odlingstillstånd. Börja med att skölja hela nötkreaturssvansen noggrant med kranvatten för att ta bort smuts och hår på ytan och sänk sedan ner svansen i 1% betadinlösning i 10 minuter för att desinficera ytan.Använd ett skalpellnummer 20 för att avlägsna mjukvävnaden från kaudala ryggraden för att underlätta identifieringen av intervertebralskivorna eller IVD: erna. Ta bort kotornas spinous och tvärgående processer med en benborttagningstäng. Skär tvärgående med bentänger genom mitten av varje ryggradskropp för att få enskilda rörelsesegment och lägg sedan de insamlade rörelsesegmenten i en Petri-skål med en gasväv våt i Ringers lösning.Lokalisera IVD i ryggkotor genom att flytta rörelsesegmenten försiktigt, identifiera sedan tillväxtplattans placering genom att vidröra och hitta konvexsidan av den beniga ändplattan. Kyl bandsågens blad med Ringers lösning och använd det för att göra två parallella snitt i IVD:ns tillväxtplatta, en på varje sida. Överför IVD:erna till en ren Petri-skål med ren gasväv våt med Ringers lösning.Skrapa av ryggraden och tillväxtplattan med hjälp av skalpellbladet och lämna ändplattan intakt. Placera de två ytorna plana och parallella för lastproceduren och överför skrapade IVDs till en färsk Petri-skål med gasväv våt med Ringers lösning. Mät skivans höjd och diameter med en bromsok och rengör sedan blodpropparna i ryggradsbenet med Ringers lösning med hjälp av ett jet lavage-system.Desinficera IVDs i PBS och 10% penicillin streptomycin med skakningar i 15 minuter. Skölj av högkoncentrationsantibiotika med PBS och 1% penicillin streptomycin. Överför skivor till IVD-kammare som innehåller fem milliliter IVD-odlingsmedium och placera dem i bioreaktorsystemet med en inkubator vid 37 grader Celsius med 85% luftfuktighet och 5% koldioxid.Odla skivorna i fyra dagar inom ett bioreaktorsystem genom att upprätthålla olika belastningsförhållanden enligt försöksgrupperna. I den fysiologiska kontrollgruppen odlar IVDs med högt glukosmedium med ett belastningsprotokoll på 0,02 till 0,2 megapascals och 0,2 hertz i två timmar per dag. I den patologiska gruppen, kultur IVDs med låg glukos medium med hjälp av ett laddning protokoll på 0,32 till 0,5 megapascals och fem hertz för två timmar per dag.Mellan lastprocedurerna placerar du IVD:erna i sexbrunnsplattor med sju milliliter IVD-odlingsmedium för fri svullnadsåtervinning. Mät skivhöjden dagligen med en bromsok efter den fria svullnadsperioden och efter dynamisk belastning under försökstiden. Efter den första dynamiska laddningscykeln på dag ett, placera direkt IVDs i en Petri-skål i vertikalt läge och stabilisera dem med en pincett.Injicera rekombinant TNF-alfa med en 30-gauge insulinnål långsamt med en hastighet av cirka 70 mikroliter per minut i IVDs i den patologiska gruppen. Efter injektion, dra sprutan halvvägs tillbaka och dra kolven för att skapa ett vakuum som förhindrar att den injicerade lösningen läcker och ta sedan bort sprutan helt från IVD. Degenerativ belastning i kombination med begränsad näringstillförsel och en TNF-alfa injektion orsakade en betydande ökning av genuttrycket av pro-inflammatoriska markörer interleukin sex och interleukin åtta i NP vävnad efter fyra dagar av kultur.Interleukin åtta protein release i det konditionerade mediet visade en markant ökning av patologiska gruppen dag två och dag fyra. Skivhöjd minskning efter lastning var högre i den patologiska gruppen jämfört med den fysiologiska gruppen, och skillnaderna var mer uttalade efter dagar två och tre jämfört med dag ett, vilket indikerar en progressiv effekt av de degenerativa och inflammatoriska villkoren. En standardiserad dissekeringsteknik är viktig för reproducerbara IVD helorganskulturmodeller.En bioreaktor krävs för att tillämpa fysiologiska och degenerativa belastningar på IVDs för att simulera olika biomekaniska in vivo-förhållanden. Denna teknik kan tillämpas på mänskliga IVD explanter som är av hög klinisk relevans. Det är en ny preklinisk modell för att utveckla effektiva behandlingar på tidig skivdegeneration.

Research

JoVE Journal

Medicine

Murine Corneal Transplantation: A Model to Study the Most Common Form of Solid Organ Transplantation

Murina hornhinnetransplantation: En modell för att studera vanligaste formen av organtransplantation

Corneal transplantation is the most common form of organ transplantation in the United States with between 45,000 and 55,000 procedures performed each ...

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Metod för Isolerad<em&gt; Ex vivo</em&gt; Lung Perfusion i en råttmodell: Lärdomar från Utveckla en Rat EVLP Program

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

A Model to Simulate Clinically Relevant Hypoxia in Humans

En modell för att simulera kliniskt relevanta Hypoxi i människor

In case of apnea, arterial partial pressure of oxygen (pO2) decreases, while partial pressure of carbon dioxide (pCO2) increases. To avoid damage to ...

Ovine Lumbar Intervertebral Disc Degeneration Model Utilizing a Lateral Retroperitoneal Drill Bit Injury

Ovine Lumbar Intervertebral Disc Degeneration Modell utnyttjar en lateral retroperitoneal borrbiten skada

Intervertebral disc degeneration is a significant contributor to the development of back pain and the leading cause of disability worldwide. Numerous ...

A Cell Culture Model of Resistance Arteries

En Cell kultur modell av motstånd artärer

The myoendothelial junction (MEJ), a unique signaling microdomain in small diameter resistance arteries, exhibits localization of specific proteins and ...

A Protocol to Acquire the Degenerative Tenocyte from Humans

Ett protokoll för att förvärva den degenerativa Tenocyte från människor

Tendinopathy, a painful condition that develops in response to tendon degeneration, is on the rise in the developed world due to increasing physical ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrisk kontraktilitet mätning av mus mesenterica artär med Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex Vivo sårläkning korneal orgel kultur modell för studier

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model Using Split Corneal Buttons

En porcin hornhinnan endotelial orgel kultur modell med Split hornhinnan knappar

Experimental research on corneal endothelial cells is associated with several difficulties. Human donor corneas are scarce and rarely available for ...

A Rat Lung Transplantation Model of Warm Ischemia/Reperfusion Injury: Optimizations to Improve Outcomes

En råttlungtransplantationsmodell av varm ischemi / reperfusionsskada: optimeringar för att förbättra resultaten

From our experience with rat lung transplantation, we have found several areas for improvement. Information in the existing literature regarding methods ...