Name: stereocilia bundle imaging with nanoscale resolution in live mammalian auditory hair cells
Uploaded: 2021-01-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells at JoVE.com

نشكر البروفيسور يوري كورشيف (إمبريال كوليدج، المملكة المتحدة) على الدعم والمشورة على المدى الطويل في جميع مراحل المشروع. كما نشكر الدكتورين بافل نوفاك وأندرو شيفتشوك (إمبريال كوليدج، المملكة المتحدة) وكذلك أوليغ بيلوف (المركز الوطني للبحوث السمعية، روسيا) على مساعدتهما في تطوير البرمجيات. تم دعم الدراسة من قبل NIDCD / NIH (R01 DC008861 و R01 DC014658 إلى G.I.F.).

وقد أجريت الدراسة وفقا للتوصيات الواردة في دليل رعاية واستخدام المختبرات التابع للمعاهد الوطنية للصحة. تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه (IACUC) في جامعة كنتاكي (البروتوكول 00903M2005).
1. تصنيع واختبار nanopipettes
<ol><li>...

<ol>
	<li>Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+inner+hair+cell+mechanotransducer+channels+using+high-speed+calcium+imaging.">Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging.</a> Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).</li><li>Effertz, T., Becker, L., Peng, A. W., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositol-4,5-bisphosphate+regulates+auditory+hair-cell+mechanotransduction-channel+pore+properties+and+fast+adaptation.">Phosphoinositol-4,5-bisphosphate regulates auditory hair-cell mechanotransduction-channel pore properties and fast adaptation.</a> The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (48), 11632-11646 (2017).</li><li>Peng, A. W., Gnanasambandam, R., Sachs, F., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+independent+modulation+of+auditory+hair+cell+mechanotransduction+channel+open+probability+implicates+a+role+for+the+lipid+bilayer.">Adaptation independent modulation of auditory hair cell mechanotransduction channel open probability implicates a role for the lipid bilayer.</a> The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (10), 2945-2956 (2016).</li><li>Engstr&#246;m, H., Engstr&#246;m, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+hairs+on+cochlear+sensory+cells.">Structure of the hairs on cochlear sensory cells.</a> Hearing research. 1 (1), 49-66 (1978).</li><li>Conchello, J. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+microscopy.">Optical sectioning microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 920-931 (2005).</li><li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy.">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li><li>W&#228;ldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy.">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348 (2015).</li><li>Pickles, J. O., Comis, S. D., Osborne, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-links+between+stereocilia+in+the+guinea+pig+organ+of+Corti,+and+their+possible+relation+to+sensory+transduction.">Cross-links between stereocilia in the guinea pig organ of Corti, and their possible relation to sensory transduction.</a> Hearing Research. 15 (2), 103-112 (1984).</li><li>Furness, D. N., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-links+between+stereocilia+in+the+guinea+pig+cochlea.">Cross-links between stereocilia in the guinea pig cochlea.</a> Hearing Research. 18 (2), 177-188 (1985).</li><li>Jacobs, R. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+correlates+of+mechanoelectrical+transduction+in+hair+cells+of+the+bullfrog&#8217;s+internal+ear.">Ultrastructural correlates of mechanoelectrical transduction in hair cells of the bullfrog&#8217;s internal ear.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 547-561 (1990).</li><li>Goodyear, R. J., Marcotti, W., Kros, C. J., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+properties+of+stereociliary+link+types+in+hair+cells+of+the+mouse+cochlea.">Development and properties of stereociliary link types in hair cells of the mouse cochlea.</a> The Journal of Comparative Neurology. 485 (1), 75-85 (2005).</li><li>Kachar, B., Parakkal, M., Kurc, M., Zhao, Y., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+structure+of+hair-cell+tip+links.">High-resolution structure of hair-cell tip links.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 13336-13341 (2000).</li><li>V&#233;lez-Ortega, A. C., Freeman, M. J., Indzhykulian, A. A., Grossheim, J. M., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+current+is+essential+for+stability+of+the+transducing+stereocilia+in+mammalian+auditory+hair+cells.">Mechanotransduction current is essential for stability of the transducing stereocilia in mammalian auditory hair cells.</a> eLife. 6, 1-22 (2017).</li><li>Ivanchenko, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+scanning+electron+microscopy+of+anti-PKHD1L1+immuno-gold+labeled+mouse+hair+cell+stereocilia+bundles.">Serial scanning electron microscopy of anti-PKHD1L1 immuno-gold labeled mouse hair cell stereocilia bundles.</a> Scientific Data. 7 (1), 182 (2020).</li><li>Hadi, S., Alexander, A. J., V&#233;lez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-XVa+controls+both+staircase+architecture+and+diameter+gradation+of+stereocilia+rows+in+the+auditory+hair+cell+bundles.">Myosin-XVa controls both staircase architecture and diameter gradation of stereocilia rows in the auditory hair cell bundles.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology JARO. 21 (2), 121-135 (2020).</li><li>Metlagel, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryo-tomography+of+vestibular+hair-cell+stereocilia.">Electron cryo-tomography of vestibular hair-cell stereocilia.</a> Journal of Structural Biology. 206 (2), 149-155 (2019).</li><li>Langer, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+of+individual+stereocilia+of+living+cochlear+hair+cells+by+atomic+force+microscopy.">Mechanical stimulation of individual stereocilia of living cochlear hair cells by atomic force microscopy.</a> Ultramicroscopy. 82 (1-4), 269-278 (2000).</li><li>Dufr&#234;ne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+nanomicrobiology+using+atomic+force+microscopy.">Towards nanomicrobiology using atomic force microscopy.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (9), 674-680 (2008).</li><li>Putman, C. A., van der Werf, K. O., de Grooth, B. G., van Hulst, N. F., Greve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelasticity+of+living+cells+allows+high+resolution+imaging+by+tapping+mode+atomic+force+microscopy.">Viscoelasticity of living cells allows high resolution imaging by tapping mode atomic force microscopy.</a> Biophysical journal. 67 (4), 1749-1753 (1994).</li><li>Gavara, N., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncontact+microrheology+at+acoustic+frequencies+using+frequency-modulated+atomic+force+microscopy.">Noncontact microrheology at acoustic frequencies using frequency-modulated atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 7 (8), 650-654 (2010).</li><li>Cartagena-Rivera, A. X., Van Itallie, C. M., Anderson, J. M., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+surface+supracellular+mechanical+properties+in+polarized+epithelium+using+noninvasive+acoustic+force+spectroscopy.">Apical surface supracellular mechanical properties in polarized epithelium using noninvasive acoustic force spectroscopy.</a> Nature Communications. 8 (1), 1030 (2017).</li><li>Katsuno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRIOBP-5+sculpts+stereocilia+rootlets+and+stiffens+supporting+cells+enabling+hearing.">TRIOBP-5 sculpts stereocilia rootlets and stiffens supporting cells enabling hearing.</a> JCI Insight. 4 (12), (2019).</li><li>Hansma, P. K., Drake, B., Marti, O., Gould, S. A., Prater, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scanning+ion-conductance+microscope.">The scanning ion-conductance microscope.</a> Science. 243 (4891), 641-643 (1989).</li><li>Korchev, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+scanning+ion-conductance+microscope+for+imaging+of+living+cells.">Specialized scanning ion-conductance microscope for imaging of living cells.</a> Journal of Microscopy. 188 (Pt 1), 17-23 (1997).</li><li>Shevchuk, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+proteins+in+membranes+of+living+cells+by+high-resolution+scanning+ion+conductance+microscopy.">Imaging proteins in membranes of living cells by high-resolution scanning ion conductance microscopy.</a> Angewandte Chemie (International ed in English. 45 (14), 2212-2216 (2006).</li><li>Novak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+live-cell+imaging+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy.">Nanoscale live-cell imaging using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Nature Methods. 6 (4), 279-281 (2009).</li><li>V&#233;lez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+live+cochlear+stereocilia+at+a+nanoscale+resolution+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy.">Visualization of live cochlear stereocilia at a nanoscale resolution using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1427, 203-221 (2016).</li><li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+scanning+patch-clamp:+new+insights+into+cell+function.">High-resolution scanning patch-clamp: new insights into cell function.</a> FASEB Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (7), 748-750 (2002).</li><li>Frolenkov, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+recordings+from+the+apical+surface+of+outer+hair+cells+with+a+scanning+ion+conductance+probe.">Single-channel recordings from the apical surface of outer hair cells with a scanning ion conductance probe.</a> Association for Research in Otolaryngology. Abs. 444, (2004).</li><li>S&#225;nchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncontact+measurement+of+the+local+mechanical+properties+of+living+cells+using+pressure+applied+via+a+pipette.">Noncontact measurement of the local mechanical properties of living cells using pressure applied via a pipette.</a> Biophysical Journal. 95 (6), 3017-3027 (2008).</li><li>Korchev, Y. E., Negulyaev, Y. A., Edwards, C. R., Vodyanoy, I., Lab, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+localization+of+single+active+ion+channels+on+the+surface+of+a+living+cell.">Functional localization of single active ion channels on the surface of a living cell.</a> Nature Cell Biology. 2 (9), 616-619 (2000).</li><li>Shevchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angular+approach+scanning+ion+conductance+microscopy.">Angular approach scanning ion conductance microscopy.</a> Biophysical Journal. 110 (10), 2252-2265 (2016).</li><li>Furness, D. N., Katori, Y., Nirmal Kumar, B., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dimensions+and+structural+attachments+of+tip+links+in+mammalian+cochlear+hair+cells+and+the+effects+of+exposure+to+different+levels+of+extracellular+calcium.">The dimensions and structural attachments of tip links in mammalian cochlear hair cells and the effects of exposure to different levels of extracellular calcium.</a> Neuroscience. 154 (1), 10-21 (2008).</li></ol>

للحصول على صور HPICM ناجحة، يحتاج المستخدمون إلى إنشاء نظام منخفض الضوضاء والاهتزاز منخفضة وتصنيع ماصة المناسبة. نوصي بشدة باستخدام معايير معايرة AFM لاختبار استقرار النظام قبل محاولة إجراء أي تصوير للخلايا الحية. بمجرد اختبار دقة النظام ، يمكن للمستخدمين النظر في تصوير الجهاز الثابت لعينا?...

على الرغم من حقيقة أن حزم المجسمة في خلايا الشعر السمعية كبيرة بما يكفي لتصورها عن طريق المجهر البصري وانحرافها في الخلايا الحية في تجربة المشبك التصحيح ، يمكن تصوير المكونات الهيكلية الأساسية لآلات النقل مثل روابط البقشيش فقط مع المجهر الإلكتروني في الخلايا الميتة. في خلايا الشعر السمعي الثديي ، تقع آلات النقل في الطرف السفلي من روابط الطرف ، أي على أطراف الصف الأقصر stereocilia1 وتنظم محليا من خلال الإشارات على نصائح من stereocilia2،3. ومع ذلك ، فإن التصوير الخالي من التسمية للهياكل السطحية في هذا الموقع في خلايا الشعر الحية غير ممكن بسبب الأحجام الصغيرة من الاستريوسيليا.
القوقعة الثديية لديها نوعين من الخلايا الحسية السمعية: خلايا الشعر الداخلية والخارجية. في خلايا الشعر الداخلية، ستيريوسيليا أطول وأكثر سمكا بالمقارنة مع تلك الموجودة في خلايا الشعر الخارجي4. الصف الأول والثاني من ستيريوسيليا يبلغ قطرها 300-500 نانومتر في الماوس أو الفئران خلايا الشعر الداخلية. نظرا لحيود الضوء ، فإن الحد الأقصى للدقة القابلة للتحقيق باستخدام مجهر بصري خال من التسمية هو حوالي 200 نانومتر. وبالتالي ، فإن تصور المجسمة الفردية داخل الصفين الأول والثاني من حزمة خلايا الشعر الداخلية أمر سهل نسبيا مع المجهر البصري. في المقابل، أقصر صف مجسمة في خلايا الشعر الداخلية وجميع مجسمة من خلايا الشعر الخارجي لها أقطار حول 100-200 نانومتر ولا يمكن تصور مع المجهر البصري5. على الرغم من التقدم الأخير في التصوير فائق الدقة ، إلا أن هذا القيد الأساسي لا يزال قائما في أي تصوير بصري خال من التسمية. جميع التقنيات المتاحة تجاريا الحالية فائقة الدقة لا تتطلب نوعا من جزيئات الفلورسنت6، مما يحد من تطبيقاتها. بالإضافة إلى القيود بسبب الحاجة إلى جزيئات محددة الموسومة الفلورسنت، وقد ثبت التعرض للإشعاع الضوء المكثف للحث على الضرر الخلوي، ويمكن أن تؤثر على العمليات الخلوية، وهو عيب كبير عند دراسة الخلايا الحية7.
وقد تم الحصول على معرفتنا الحالية من التفاصيل ultrastructural من حزم مجسمة خلايا الشعر في الغالب مع مختلف تقنيات المجهر الإلكتروني (EM) ، مثل المسح المجهري الإلكتروني (SEM)، المجهر الإلكتروني الإرسال (TEM)، تجميد كسر EM، ومؤخرا مع تقنيات 3D مثل تقسيم المسلسل مع شعاع أيون مركزة أو التصوير المقطعي cryo-EM8،9،10،11،12،13، 14،15،16. لسوء الحظ، تتطلب جميع تقنيات EM هذه إزالة كيميائية أو التبريد للعينة. اعتمادا على النطاق الزمني للظواهر ، وهذا الشرط يجعل دراسة العمليات الديناميكية في نصائح من stereocilia إما مستحيلة أو كثيفة العمالة جدا.
بذلت جهود محدودة لتصوير حزم الشعر من خلايا الشعر الحية مع المجهر القوة الذرية (AFM)17،18. منذ AFM يعمل في الحلول الفسيولوجية، فإنه يمكن، من الناحية النظرية، تصور التغيرات الديناميكية في حزم ستيريوسيليا من خلايا الشعر الحية مع مرور الوقت. تكمن المشكلة في مبادئ AFM عالية الدقة ، والتي تنطوي على اتصال جسدي معين بين مسبار AFM والعينة ، حتى في وضع "التنصت" الأقل ضررا19. عندما يواجه مسبار AFM مجسما ، فإنه عادة ما يصطدم به ، مما يضر ببنية حزمة الشعر. ونتيجة لذلك، هذه التقنية ليست مناسبة لتصور العيش، أو حتى ثابتة، حزم خلايا الشعر17،18. قد يتم تخفيف المشكلة جزئيا باستخدام مسبار AFM كبير على شكل كرة يفرض فقط القوى الهيدروديناميكية على سطح العينة20. ومع ذلك ، على الرغم من أن مثل هذا المسبار مناسب بشكل مثالي لاختبار الخصائص الميكانيكية للعينة21، فإنه يوفر فقط دقة دون ميكرومتر عند تصوير جهاز Corti22 ولا يزال ينطبق على العينة قوة قد تكون كبيرة لحزم الاستريوميليا الحساسة للغاية.
المسح المجهري توصيل أيون (SICM) هو نسخة من المسح المجهري التحقيق الذي يستخدم مسبار ماصة زجاجية مليئة محلول موصل23. يكتشف SICM السطح عندما تقترب المصصة من الخلية وينخفض التيار الكهربائي من خلال المصصة. وبما أن هذا يحدث قبل لمس الخلية ، فإن SICM مناسب بشكل مثالي للتصوير غير الاتصالي للخلايا الحية في الحل الفسيولوجي24. أفضل قرار من SICM هو على ترتيب نانومتر واحد، والذي يسمح حل مجمعات البروتين الفردية في غشاء البلازما من خلية حية25. ومع ذلك ، على غرار تقنيات مسبار المسح الأخرى ، فإن SICM قادر على تصوير الأسطح المسطحة نسبيا فقط. تغلبنا على هذا القيد عن طريق اختراع القفز مسبار أيون المجهر التوصيل (HPICM)26، الذي يقترب nanopipette العينة في كل نقطة التصوير(الشكل 1A). باستخدام HPICM، كنا قادرين على صورة حزم stereocilia في خلايا الشعر السمعية الحية مع دقة نانوية27.
ميزة أساسية أخرى لهذه التقنية هي أن HPICM ليست فقط أداة تصوير. على النقيض من تقنيات مسبار المسح الضوئي الأخرى ، فإن مسبار HPICM / SICM هو قطب كهربائي يستخدم على نطاق واسع في فسيولوجيا الخلايا للتسجيلات الكهربائية والتسليم المحلي لمختلف المحفزات. نشاط قناة أيون لا تتداخل عادة مع التصوير HPICM، لأن التيار الكلي من خلال التحقيق HPICM هو عدة أوامر من حجم أكبر من التيار خارج الخلية التي تم إنشاؤها بواسطة أكبر القنوات الأيونية25. ومع ذلك، HPICM يسمح تحديد المواقع الدقيقة للnanopipette على هيكل من الاهتمام وتسجيل التصحيح المشبك قناة واحدة لاحقة من هذا الهيكل28. هذه هي الطريقة التي حصلنا على التسجيلات الأولية الأولى من نشاط قناة واحدة في نصائح من خلية الشعر الخارجي stereocilia29. ومن الجدير بالذكر أنه حتى تيار كبير من خلال nanopipette لا يمكن أن تنتج تغييرات كبيرة في الإمكانات عبر غشاء البلازما بسبب تحويلة كهربائية هائلة من المتوسط خارج الخلية. ومع ذلك، يمكن تنشيط القنوات الأيونية الفردية ميكانيكيا عن طريق تدفق السائل من خلال nanopipette30 أو كيميائيا عن طريق التطبيق المحلي لناهض31.
في HPICM، يتم إنشاء الصورة عندما تقترب nanopipette من العينة بشكل تسلسلي عند نقطة واحدة، وتتراجع، ثم تتحرك في اتجاه الجانبي لتكرار النهج (الشكل 1A). مكبر للصوت المشبك التصحيح ينطبق باستمرار الجهد إلى سلك AgCl في ماصة (الشكل 1B) لتوليد تيار من ~ 1 ن أ في حل الحمام. يتم تحديد قيمة هذا التيار عندما يتم تحديد ماصة بعيدا عن سطح الخلية كتيار مرجعي (أناالمرجع، الشكل 1C). ثم ينتقل المواسير في المحور Z للاقتراب من العينة حتى يتم تقليل التيار بمقدار معرف مسبقا من قبل المستخدم (نقطة تعيين)، وعادة 0.2٪-1٪ من المرجع الأول (الشكل 1C، تتبع أعلى). ثم يحفظ النظام قيمة Z في هذه اللحظة كطول العينة، جنبا إلى جنب مع إحداثيات X و Y لنقطة التصوير هذه. ثم يتم سحب ماصة بعيدا عن السطح(الشكل 1C،تتبع أسفل) بسرعة يحددها المستخدم، وعادة 700-900 نانومتر / مللي ثانية. بعد التراجع ، يتم نقل ماصة (أو ، في حالتنا ، العينة - انظر الشكل 1B)أفقيا إلى نقطة التصوير التالية ، ويتم الحصول على قيمة مرجعية جديدة الحالية ، ويقترب المصصة مرة أخرى من العينة ، وتكرار العملية. ويفضل حركة X-Y من ماصة في إعداد المجهر تستقيم التي تستخدم عادة لتسجيلات تيارات خلية الشعر mechanotransduction. في هذا الإعداد، يقترب مسبار HPICM من حزم خلايا الشعر ليس من الأعلى ولكن بزاوية32. ومع ذلك ، يتم تحقيق أفضل دقة للتصوير HPICM في إعداد المجهر المقلوب(الشكل 1A، B) ، حيث يتم إزالة حركة العينة في اتجاهات X-Y من حركة Z من nanopipette ، وبالتالي القضاء على القطع الأثرية الميكانيكية المحتملة.
باستخدام HPICM، حصلنا على الصور الطبوغرافية من الماوس والفأر الداخلية والخارجية حزم ستيريوسيليا خلية الشعر، وحتى تصور الروابط بين ستيريوسيليا التي هي حوالي 5 نانومتر في القطر26،27. نجاح التصوير حزمة خلايا الشعر مع هذه التقنية يعتمد على عدة عوامل. أولا، يجب أن يكون الضجيج (التباين) لتيار nanopipette صغيرا قدر الإمكان للسماح بأقل نقطة تعيين ممكنة للتصوير HPICM. تسمح نقطة تعيين منخفضة للتحقيق HPICM ب "استشعار" سطح ستيريوسيليا على مسافة أكبر وفي أي زاوية لنهج المسبار ، ومن المدهش أنه يحسن دقة X-Y للتصوير HPICM (انظر المناقشة). ثانيا، ينبغي تخفيض الاهتزازات والانجرافات في النظام إلى أقل من 10 نانومتر، لأنها تسهم مباشرة في القطع الأثرية التصوير. وأخيرا، على الرغم من أن المسبار HPICM ومرحلة العينة يتم نقلها في محاور Z و X-Y بواسطة مشغلات بيزو التي يتم التحكم فيها من خلال التغذية المرتدة التي تحتوي على دقة نانومتر واحد أو أفضل، فإن قطر طرف nanopipette يحدد انتشار التيار (حجم الاستشعار) وبالتالي القرار (الشكل 1A). لذلك ، قبل تصوير خلايا الشعر الحية ، من الضروري سحب المصايب الكافية ، والوصول إلى الدقة المطلوبة مع عينات المعايرة ، وتحقيق ضوضاء منخفضة في نظام التسجيل.
على الأقل بضعة عقود، تقنية SICM لم تكن متاحة تجاريا، وأنها قد تم تطويرها من قبل عدد قليل فقط من المختبرات في العالم مع المختبر الرائدة من البروفيسور كورشيف في الكلية الإمبراطورية (المملكة المتحدة). في الآونة الأخيرة، أصبحت العديد من أنظمة SICM متاحة تجاريا (انظر جدول المواد)،وكلها تستند إلى مبادئ HPICM الأصلية. ومع ذلك ، فإن حزم التصوير المجسمة في خلايا الشعر تتطلب العديد من التعديلات المخصصة التي تشكل تحديا تقنيا (أو حتى مستحيلا) في أنظمة "الجاهزة" المغلقة. لذلك، هناك حاجة إلى بعض التكامل بين المكونات. منذ إعداد HPICM يمثل تلاعب المشبك التصحيح مع الاهتزاز أكثر صرامة ومتطلبات الانجراف وحركة بيزو يحركها من المسبار HPICM والعينة (الشكل 1D)، وهذا التكامل من السهل نسبيا لأي باحث، الذي يتقن في لقط التصحيح. ومع ذلك ، فإن عالما من دون خلفية مناسبة تحتاج بالتأكيد بعض التدريب في علم الفيزيولوجيا الكهربائية أولا. على الرغم من التحديات المتبقية مثل زيادة سرعة التصوير (انظر المناقشة)، تمكنا من تصوير حزم stereocilia في خلايا الشعر الحية بدقة نانوية دون إتلافها.
تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا لإجراء تصوير HPICM ناجح لحزم خلايا الشعر السمعية الحية في الفئران الصغيرة بعد الولادة أو النباتات الخارجية ل قوقعة الماوس باستخدام نظامنا المخصص. يتم سرد المكونات المتكاملة في جدول المواد. كما توضح الورقة المشاكل الشائعة التي يمكن مواجهتها وكيفية استكشافها وإصلاحها.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Analog oscilloscope</td>
			<td>B&#38;K Precision</td>
			<td>2160C</td>
			<td>Analog oscilloscope for real-time monitoring of nanopipette current and Z-axis approach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM calibration standards</td>
			<td>TED PELLA Inc</td>
			<td>HS-100MG; HS-20MG</td>
			<td>These 100 and 20 nm calibration standards are used to test the performance of HPICM system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop vibration Isolator</td>
			<td>AMETEK/TMC</td>
			<td>Everstill K-400</td>
			<td>Active vibration isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>Borosilicate glass capillaries for the nanopipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>To be added to the bath solution to adjust osmolarity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>National Instruments Corporation</td>
			<td>PCI-6221</td>
			<td>Multi-channel input/output digitizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast analog Proportional-Integral-Derivative (PID) control for Z movement</td>
			<td>Standford Research Systems</td>
			<td>SIM900, SIM960, SIM980</td>
			<td>Instrumentation modules integrated in an external PID controller for Z movement. It requires a fast response that is usually not implemented in commercial piezo amplifiers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>AMETEK/TMC</td>
			<td>Type II</td>
			<td>Required to shield electromagnetic interference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td>Used as the dish for the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td>Extracellular (bath) solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrumentation amplifier</td>
			<td>Brownlee Precision</td>
			<td>Model 440</td>
			<td>Instrumentation amplifier provides required offsets, filtering, and secondary magnification or attenuation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-based micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2000/G</td>
			<td>Micropipette puller to fabricate the nanopipettes. Laser is needed for sharp quartz pipettes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lebovitz&#39;s L-15, without phenol red</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td>Extracellular (bath) solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>PatchStar</td>
			<td>Used for &#34;course&#34; positioning of the Z piezo actuator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td>Inverted optical microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td>The patch clamp amplifier measures the current through the nanopipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo amplifier (XY axes)</td>
			<td>Physik Instrumente (PI)</td>
			<td>E-500.00, E-505.00, E-509.C2A</td>
			<td>Amplification and PID control for XY piezo translation stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo amplifier (Z axis)</td>
			<td>Piezosystem jena</td>
			<td>ENT 400 &#38; 800</td>
			<td>Custom amplifier consisting of ENT 400 power supply and two ENT 800 amplifiers in parallel to achieve max current of 1.6 nA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Coverslips</td>
			<td>TED PELLA Inc</td>
			<td>26028</td>
			<td>Used in the fabrication of the chambers for the tissue&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SICM controller &#38; software*</td>
			<td>Ionscope, UK (ionscope.com)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom controller based on SBC6711 digital signal processing board from Innovative Integration Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer (Sylgard)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Used to attach the flexible glass fibers to the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon glue</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>734</td>
			<td>Used to glue the different parts of the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten rod</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>717500</td>
			<td>Used for holding the dental floss strands in the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY piezo nanopositioner</td>
			<td>Physik Instrumente (PI)</td>
			<td>P-733.2DD</td>
			<td>XY translation stage with capacitive sensors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z piezo nanopositioner</td>
			<td>Piezosystem jena</td>
			<td>RA 12/24 SG</td>
			<td>Ring piezoactuator with a strain gage sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">*Ionscope does not sell separate SICM controllers anymore. There are few other commercial systems:&#160; NX12-Bio and NX10 SICM,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Park Systems, Korea and SICM modules from ICAPPIC Limited, UK (icappic.com). All these systems are based on the original&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">HPICM principles. However, imaging stereocilia bundles in the hair cells requires several custom modifications that are technically&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">challenging (or even impossible) in the closed &#8220;ready-to-go&#8221; systems such as Ionscope or NX12-Bio/NX10. Currently, there is only one&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">modular system (ICAPPIC) that has the flexibility to suit any SICM/HPICM experiment but requires some component integration.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereocilia bundle imaging with nanoscale resolution in live mammalian auditory hair cells

خلايا شعر الأذن الداخلية الكشف عن التشريد الناجم عن الصوت ونقل هذه المحفزات إلى إشارات كهربائية في حزمة الشعر التي تتكون من ستيريوسيليا التي يتم ترتيبها في صفوف من ارتفاع متزايد. عندما يتم تحويل stereocilia، فإنها سحب على صغيرة (~ 5 نانومتر في القطر) طرف خارج الخلية يربط ستيريوسيليا، والتي تنقل القوات إلى قنوات نقل حساسة ميكانيكيا. على الرغم من أن الميكانوترانسدوكشن قد درس في خلايا الشعر الحية لعقود، فإن التفاصيل الهيكلية الفائقة المهمة وظيفيا لآلات النقل الميكانيكي على نصائح من المجسمة (مثل ديناميات وصلة تلميح أو إعادة عرض المجسمة المعتمدة على النقل) لا يزال من الممكن دراستها فقط في الخلايا الميتة مع المجهر الإلكتروني. نظريا، تقنيات مسبار المسح الضوئي، مثل المجهر القوة الذرية، لديها ما يكفي من الدقة لتصور سطح المجسمة. ومع ذلك ، بغض النظر عن وضع التصوير ، حتى أدنى اتصال من مسبار المجهر القوة الذرية مع حزمة مجسمة عادة ما يضر حزمة. هنا نقدم بروتوكول مفصل للقفز التحقيق أيون التوصيل المجهري (HPICM) التصوير من خلايا الشعر السمعي القوارض الحية. تسمح تقنية مسبار المسح الضوئي غير التلامسية هذه بتصوير سطح الخلايا الحية بطيوغرافيا معقدة ، مثل خلايا الشعر ، بدقة نانومتر واحدة ودون إجراء اتصال مادي مع العينة. يستخدم HPICM تيارا كهربائيا يمر عبر النانوبايت الزجاجي للكشف عن سطح الخلية بالقرب من المصصة ، في حين يقوم نظام كهرومغناطيس ثلاثي الأبعاد بمسح السطح وتوليد صورته. مع HPICM ، تمكنا من تصوير حزم stereocilia والروابط التي تربط ستيريوسيليا في خلايا الشعر السمعية الحية لعدة ساعات دون ضرر ملحوظ. نتوقع أن استخدام HPICM سيسمح بالاستكشاف المباشر للتغيرات الهيكلية الفائقة في الاستريوفيلية لخلايا الشعر الحية لفهم أفضل لوظيفتها.

يمكن استخدام البروتوكول المعروض في هذه الورقة لتصور أي خلايا حية ذات تضاريس معقدة. بعد هذه الخطوات، نحصل بشكل روتيني على صور لحزم خلايا الشعر السمعية الحية للفئران (الشكل 6B، D). على الرغم من وجود انخفاض دقة X-Y بالمقارنة مع صور SEM ، يمكن لصور HPICM لدينا حل الصفوف المختل...

Watch this Scientific Journal Video about Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells at JoVE.com

Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells

هنا نقدم بروتوكولا للتحقيق التنقل أيون التوصيل المجهر (HPICM)، وهي تقنية مسبار المسح الضوئي غير الاتصال الذي يسمح التصوير النانوي من حزم مجسمة في خلايا الشعر السمعية الحية.

Stereocilia حزمة التصوير مع قرار نانوية في خلايا الشعر السمعي الثدييات الحية

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia ...

هذا العملية يمكن أن تساعدنا على دراسة التغيرات الديناميكية للمكونات الهيكلية نانو من آلات النقل الكهربائية الميكانيكية على سطح حزم ستيريوسيليا خلية الشعر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي التصوير الفاصل الزمني لسطح الخلايا الحية ذات التضاريس المعقدة بدقة نانومتر واحدة ، ودون إجراء اتصال مادي مع العينة. يمكن تطبيق هذه التقنية على أي خلية حية تقريبا.كنا في السابق مطابقة سطح خطوط الخلايا الظهارية الرئة المصابة بالفيروسات، والخلايا العضلية، في بلدي صورة البكتيريا قريبا. اختبار nanopipettes في بداية كل جلسة التصوير. بعد تصنيع nanopipette، تحقق من وجود فقاعات، وإزالة أي فقاعات إذا كان موجودا، وجبل nanopipette على القفز التحقيق أيون موصل حامل مجهر ماصة.في أربعة ملليلتر من حل الحمام للغرفة ووضع الغرفة على خشبة المسرح HPICM. أدخل القطب الأرضي إلى محلول الحمام وتأكد من أن الجهد الذي يتم تطبيقه على المصصة من خلال مكبر الصوت المشبك التصحيح هو صفر. بعد وضع المتلاعب الصغير في الوضع الرأسي، حرك المصصة في Z حتى تلمس السائل وتعيين إزاحة مكبر الصوت إلى الصفر، قبل إضافة زائد 100 ملليفولت للتحقق من تيار ماصة.استخدم غراء السيليكون لإرفاق معيار معايرة AFM للغرفة وتغطية العينة بأربعة ملليلترات من HBSS. استخدم الشريط على الوجهين لتأمين الغرفة إلى المرحلة X Y من إعداد HPICM، وتحميل nanopipette جديدة على حامل كما هو موضح. بعد اختبار المقاومة nanopipette وقطرها، تعيين التيار إلى واحد نانو أمبير.استخدام المتلاعب المشبك التصحيح الخشنة لوضع nanopipette تقريبا فوق مركز معيار المعايرة وزيادة نقطة مجموعة أثناء رصد إشارة من جهاز استشعار المحرك بيزو Z على الذبذبة في الوقت الحقيقي. بعد إنشاء مستقرة قابلة للتكرار Z نهج دورة، تقليل نقطة مجموعة إلى قيمة فقط فوق نقطة عدم الاستقرار وتحريك ماصة أسفل بسرعة حوالي خمسة ميكرون في الثانية الواحدة، حتى تصل إلى العينة. سوف يزيد المستوى السفلي من إشارة تحديد المواقع Z في الوقت الحقيقي ، مما يشير إلى أن يتم سحب nanopipette بسبب استشعار سطح العينة.بسبب تصاعد متفاوتة على معيار AFM، قد تكون أعلى نقطة في مجال الاهتمام غير معروف. لذلك، تعيين سعة التراجع ماصة إلى ما لا يقل عن 200 إلى 500 نانومتر. مع الحرص على عدم تجاوز الحد الأعلى لحركة مشغل بيزو Z ، ابدأ التصوير بدقة منخفضة.بمجرد تحديد أعلى نقطة للعينة في منطقة التصوير ، قم بتقليل سعة القفزة وسحب المصة حوالي 200 ميكرون على طول محور Z لمنع أي تصادم غير مرغوب فيه مع العينة قبل نقلها إلى موقع X Y جديد. عند تحديد موقع منطقة الاهتمام، ابدأ التصوير بدقة أعلى. لتصوير خلايا الشعر السمعية، تأمين بحزم جهاز معزول حديثا من كورتي إلى غرفة باستخدام إما خيط الأسنان، أو ماصة زجاجية مرنة.استخدام الشريط على الوجهين لتأمين بحزم الغرفة إلى مرحلة بيزو س ص وتحميل nanopipette جديدة على حامل كما هو موضح. بعد التحقق من مقاومة nanopipette ، استخدم المتلاعب الدقيق المشبك التصحيح لوضع nanopipette على منطقة خلايا الشعر أثناء مراقبة الجهاز من نبات كورتي X في المجهر المقلوب. سجل، في الوقت الحقيقي الحالي و Z إشارة تحديد المواقع على الذبذبة للتحقق مما إذا كان النظام مستقر مع نقطة محددة من 0.5٪ 6or أقل، وتحديد نقطة مجموعة الأمثل والنهج العينة كما هو موضح.إجراء تصوير منخفض الدقة للعينة كما هو موضح باستخدام سعة قفزة لا تقل عن ستة إلى ثمانية ميكرون. إذا كان nanopipette يحتاج إلى نقل إلى موقع جديد X Y، تراجع ماصة حوالي 500 نانومتر لتجنب الاصطدام مع أي ميزات طويل القامة داخل الأنسجة وتكرار التصوير HPICM منخفضة الدقة حتى المنطقة ذات الاهتمام حيث توجد خلايا الشعر. ثم قم بتصوير المنطقة ذات الاهتمام بدقة أعلى في 15 دقيقة أو أقل.يمكن استخدام بروتوكول HPICM لتصور أي خلايا حية ذات تضاريس معقدة ، مثل حزم خلايا الشعر السمعية الحية للفئران. على الرغم من إظهار دقة X Y أقل مقارنة بمسح صور المجهر الإلكتروني ، يمكن لصور HPICM حل الصفوف المختلفة من المجسمة بنجاح. شكل نصائح ستيريوسيليا وحتى وصلات نانومتر الخمسة الصغيرة التي تربط بين ستيريوسيليا المجاورة.نظرا لطبيعة التصوير غير المتصلة ب HPICM ، يمكن إجراء التصوير المستمر الفاصل الزمني لنفس حزمة خلايا الشعر لعدة ساعات دون الإضرار بتماسك الحزمة. لاحظ أنه مع نقطة تعيين منخفضة جدا، قد يفسر النظام التقلبات الصغيرة في التيار على أنها تواجه سطح الخلية، مما يؤدي إلى ضوضاء النقطة البيضاء في الصورة. وبالمثل، قد تزيد اتساعات القفز الكبيرة من الرنين الجانبي للمصصة، مما يؤدي أيضا إلى إنتاج وحدات بكسل صاخبة.في المقابل، إذا كانت سعة الهوب صغيرة جدا، أو كانت نقطة الإعداد مرتفعة جدا، فقد تصطدم النانوبايت بالعينة مما يؤدي إلى تصوير القطع الأثرية أو تلف حزمة الشعر. أهم شيء يجب تذكره عند محاولة هذا الإجراء هو قضاء أقل من 15 دقيقة لكل حزمة خلايا شعر عند العمل مع الخلايا الحية. بعد الحصول على صورة لحزمة الشعر ، يمكن للمرء أن يحاول الحصول على تسجيلات قناة واحدة من مواقع محددة على سطح stereocilia للإجابة على الأسئلة حول خصائص قناة mechanotransduction.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

تصوير الحية إزفاء PKC في Sf9 خلايا في الخلايا العصبية والحسية Aplysia

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

الوقت الفاصل بين التصوير حية من خلايا ذات صلة Clonally السلف العصبية في الدماغ المقدم اسماك الزرد النامية

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

تعيش خلية التصوير الحسي للخلايا السليمة في الجهاز السلائف ذبابة الفاكهة شرانق

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

عالية الدقة التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي للطرق الدماغ المتوسط ​​الإنسان

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

عالية الدقة التصوير لايف من سلوك خلية في الظهارة العصبية النامية

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

تسجيلات المشبك التصحيح في الأذن الداخلية خلايا الشعر المعزولة من اسماك الزرد

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

التصوير الوظيفي للسمعي اللحاء في القطط الكبار باستخدام الحقل عالي الرنين المغناطيسي الوظيفي

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

فائقة الدقة التصوير من الخلايا العصبية الحويصلات كثيفة الأساسية

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

عالية الدقة<em&gt; في فيفو</em&gt; دليل بروتوكول تجزئة للالإنسان الحصين الحقول الفرعية عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي 3T

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

تحفيز Optogenetic من العصب السمعي

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...