Name: stereocilia bundle imaging with nanoscale resolution in live mammalian auditory hair cells
Uploaded: 2021-01-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells at JoVE.com

Vi takker prof. Yuri Korchev (Imperial College, UK) for den langsigtede støtte og rådgivning i alle faser af projektet. Vi takker også Drs. Pavel Novak og Andrew Shevchuk (Imperial College, UK) samt Oleg Belov (National Research Centre for Audiology, Rusland) for deres hjælp til softwareudvikling. Undersøgelsen blev støttet af NIDCD/NIH (R01 DC008861 og R01 DC014658 til G.I.F.).

Undersøgelsen blev udført i overensstemmelse med anbefalingerne i vejledningen for pleje og brug af laboratoriedyr fra National Institutes of Health. Alle dyreprocedurer blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Kentucky (protokol 00903M2005).
1. Fremstilling og afprøvning af nanopipetter
<ol><li>Opret et program i mikropipettrækkeren for at opnå pipetter med en modstand mellem 200 og 400 MΩ, hvilket svarer til indvendige sp...

<ol>
	<li>Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+inner+hair+cell+mechanotransducer+channels+using+high-speed+calcium+imaging.">Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging.</a> Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).</li><li>Effertz, T., Becker, L., Peng, A. W., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositol-4,5-bisphosphate+regulates+auditory+hair-cell+mechanotransduction-channel+pore+properties+and+fast+adaptation.">Phosphoinositol-4,5-bisphosphate regulates auditory hair-cell mechanotransduction-channel pore properties and fast adaptation.</a> The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (48), 11632-11646 (2017).</li><li>Peng, A. W., Gnanasambandam, R., Sachs, F., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+independent+modulation+of+auditory+hair+cell+mechanotransduction+channel+open+probability+implicates+a+role+for+the+lipid+bilayer.">Adaptation independent modulation of auditory hair cell mechanotransduction channel open probability implicates a role for the lipid bilayer.</a> The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (10), 2945-2956 (2016).</li><li>Engstr&#246;m, H., Engstr&#246;m, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+hairs+on+cochlear+sensory+cells.">Structure of the hairs on cochlear sensory cells.</a> Hearing research. 1 (1), 49-66 (1978).</li><li>Conchello, J. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+microscopy.">Optical sectioning microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 920-931 (2005).</li><li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy.">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li><li>W&#228;ldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy.">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348 (2015).</li><li>Pickles, J. O., Comis, S. D., Osborne, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-links+between+stereocilia+in+the+guinea+pig+organ+of+Corti,+and+their+possible+relation+to+sensory+transduction.">Cross-links between stereocilia in the guinea pig organ of Corti, and their possible relation to sensory transduction.</a> Hearing Research. 15 (2), 103-112 (1984).</li><li>Furness, D. N., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-links+between+stereocilia+in+the+guinea+pig+cochlea.">Cross-links between stereocilia in the guinea pig cochlea.</a> Hearing Research. 18 (2), 177-188 (1985).</li><li>Jacobs, R. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+correlates+of+mechanoelectrical+transduction+in+hair+cells+of+the+bullfrog&#8217;s+internal+ear.">Ultrastructural correlates of mechanoelectrical transduction in hair cells of the bullfrog&#8217;s internal ear.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 547-561 (1990).</li><li>Goodyear, R. J., Marcotti, W., Kros, C. J., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+properties+of+stereociliary+link+types+in+hair+cells+of+the+mouse+cochlea.">Development and properties of stereociliary link types in hair cells of the mouse cochlea.</a> The Journal of Comparative Neurology. 485 (1), 75-85 (2005).</li><li>Kachar, B., Parakkal, M., Kurc, M., Zhao, Y., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+structure+of+hair-cell+tip+links.">High-resolution structure of hair-cell tip links.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 13336-13341 (2000).</li><li>V&#233;lez-Ortega, A. C., Freeman, M. J., Indzhykulian, A. A., Grossheim, J. M., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+current+is+essential+for+stability+of+the+transducing+stereocilia+in+mammalian+auditory+hair+cells.">Mechanotransduction current is essential for stability of the transducing stereocilia in mammalian auditory hair cells.</a> eLife. 6, 1-22 (2017).</li><li>Ivanchenko, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+scanning+electron+microscopy+of+anti-PKHD1L1+immuno-gold+labeled+mouse+hair+cell+stereocilia+bundles.">Serial scanning electron microscopy of anti-PKHD1L1 immuno-gold labeled mouse hair cell stereocilia bundles.</a> Scientific Data. 7 (1), 182 (2020).</li><li>Hadi, S., Alexander, A. J., V&#233;lez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-XVa+controls+both+staircase+architecture+and+diameter+gradation+of+stereocilia+rows+in+the+auditory+hair+cell+bundles.">Myosin-XVa controls both staircase architecture and diameter gradation of stereocilia rows in the auditory hair cell bundles.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology JARO. 21 (2), 121-135 (2020).</li><li>Metlagel, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryo-tomography+of+vestibular+hair-cell+stereocilia.">Electron cryo-tomography of vestibular hair-cell stereocilia.</a> Journal of Structural Biology. 206 (2), 149-155 (2019).</li><li>Langer, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+of+individual+stereocilia+of+living+cochlear+hair+cells+by+atomic+force+microscopy.">Mechanical stimulation of individual stereocilia of living cochlear hair cells by atomic force microscopy.</a> Ultramicroscopy. 82 (1-4), 269-278 (2000).</li><li>Dufr&#234;ne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+nanomicrobiology+using+atomic+force+microscopy.">Towards nanomicrobiology using atomic force microscopy.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (9), 674-680 (2008).</li><li>Putman, C. A., van der Werf, K. O., de Grooth, B. G., van Hulst, N. F., Greve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelasticity+of+living+cells+allows+high+resolution+imaging+by+tapping+mode+atomic+force+microscopy.">Viscoelasticity of living cells allows high resolution imaging by tapping mode atomic force microscopy.</a> Biophysical journal. 67 (4), 1749-1753 (1994).</li><li>Gavara, N., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncontact+microrheology+at+acoustic+frequencies+using+frequency-modulated+atomic+force+microscopy.">Noncontact microrheology at acoustic frequencies using frequency-modulated atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 7 (8), 650-654 (2010).</li><li>Cartagena-Rivera, A. X., Van Itallie, C. M., Anderson, J. M., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+surface+supracellular+mechanical+properties+in+polarized+epithelium+using+noninvasive+acoustic+force+spectroscopy.">Apical surface supracellular mechanical properties in polarized epithelium using noninvasive acoustic force spectroscopy.</a> Nature Communications. 8 (1), 1030 (2017).</li><li>Katsuno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRIOBP-5+sculpts+stereocilia+rootlets+and+stiffens+supporting+cells+enabling+hearing.">TRIOBP-5 sculpts stereocilia rootlets and stiffens supporting cells enabling hearing.</a> JCI Insight. 4 (12), (2019).</li><li>Hansma, P. K., Drake, B., Marti, O., Gould, S. A., Prater, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scanning+ion-conductance+microscope.">The scanning ion-conductance microscope.</a> Science. 243 (4891), 641-643 (1989).</li><li>Korchev, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+scanning+ion-conductance+microscope+for+imaging+of+living+cells.">Specialized scanning ion-conductance microscope for imaging of living cells.</a> Journal of Microscopy. 188 (Pt 1), 17-23 (1997).</li><li>Shevchuk, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+proteins+in+membranes+of+living+cells+by+high-resolution+scanning+ion+conductance+microscopy.">Imaging proteins in membranes of living cells by high-resolution scanning ion conductance microscopy.</a> Angewandte Chemie (International ed in English. 45 (14), 2212-2216 (2006).</li><li>Novak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+live-cell+imaging+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy.">Nanoscale live-cell imaging using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Nature Methods. 6 (4), 279-281 (2009).</li><li>V&#233;lez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+live+cochlear+stereocilia+at+a+nanoscale+resolution+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy.">Visualization of live cochlear stereocilia at a nanoscale resolution using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1427, 203-221 (2016).</li><li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+scanning+patch-clamp:+new+insights+into+cell+function.">High-resolution scanning patch-clamp: new insights into cell function.</a> FASEB Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (7), 748-750 (2002).</li><li>Frolenkov, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+recordings+from+the+apical+surface+of+outer+hair+cells+with+a+scanning+ion+conductance+probe.">Single-channel recordings from the apical surface of outer hair cells with a scanning ion conductance probe.</a> Association for Research in Otolaryngology. Abs. 444, (2004).</li><li>S&#225;nchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncontact+measurement+of+the+local+mechanical+properties+of+living+cells+using+pressure+applied+via+a+pipette.">Noncontact measurement of the local mechanical properties of living cells using pressure applied via a pipette.</a> Biophysical Journal. 95 (6), 3017-3027 (2008).</li><li>Korchev, Y. E., Negulyaev, Y. A., Edwards, C. R., Vodyanoy, I., Lab, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+localization+of+single+active+ion+channels+on+the+surface+of+a+living+cell.">Functional localization of single active ion channels on the surface of a living cell.</a> Nature Cell Biology. 2 (9), 616-619 (2000).</li><li>Shevchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angular+approach+scanning+ion+conductance+microscopy.">Angular approach scanning ion conductance microscopy.</a> Biophysical Journal. 110 (10), 2252-2265 (2016).</li><li>Furness, D. N., Katori, Y., Nirmal Kumar, B., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dimensions+and+structural+attachments+of+tip+links+in+mammalian+cochlear+hair+cells+and+the+effects+of+exposure+to+different+levels+of+extracellular+calcium.">The dimensions and structural attachments of tip links in mammalian cochlear hair cells and the effects of exposure to different levels of extracellular calcium.</a> Neuroscience. 154 (1), 10-21 (2008).</li></ol>

For at opnå vellykkede HPICM-billeder skal brugerne etablere et system med lav støj og lav vibration og fremstille passende pipetter. Vi anbefaler på det kraftigste, at der anvendes AFM-kalibreringsstandarder for at teste systemets stabilitet, før du forsøger at udføre strømbilleddannelse. Når opløsningen af systemet er testet, brugere kan overveje billeddannelse fast organ corti prøver til at blive fortrolig med billeddannelse indstillinger, før du forsøger nogen levende celle billeddannelse.
<p class="j...

På trods af at stereocilia bundter i de auditive hårceller er store nok til at blive visualiseret ved optisk mikroskopi og afbøjet i levende celler i et plaster klemme eksperiment, de væsentlige strukturelle komponenter i transduktion maskiner såsom spids links kunne kun afbildes med elektronmikroskopi i døde celler. I pattedyrets auditive hårceller er transduktionsmaskineriet placeret i de nederste ender af tipledene, dvs. ved spidsen af den kortere række stereocilia1 og reguleres lokalt gennem signalering ved spidsen af stereocilia2,3. Men, label-fri billeddannelse af overfladen strukturer på dette sted i levende hårceller er ikke muligt på grund af de små størrelser af stereocilia.
Pattedyr cochlea har to typer af auditive sensoriske celler: indre og ydre hårceller. I de indre hårceller er stereocilia længere og tykkere sammenlignet med dem i de ydre hårceller4. Den første og anden række af stereocilia har en diameter på 300-500 nm i mus eller rotte indre hårceller. På grund af lysets diffraktion er den maksimale opløsning, der kan opnås med en etiketfri optisk mikroskopi, ca. 200 nm. Derfor visualisering af individuelle stereocilia inden for første og anden række af den indre hår celle bundt er relativt let med optisk mikroskopi. I modsætning hertil har kortere række stereocilia i de indre hårceller og alle stereocilia af de ydre hårceller diametre omkring 100-200 nm og kan ikke visualiseres med optisk mikroskopi5. På trods af de seneste fremskridt inden for superopløsningsbilleddannelse fortsætter denne grundlæggende begrænsning i enhver optisk etiketfri billedbehandling. Alle nuværende kommercielt tilgængelige superopløsningsteknikker kræver en slags fluorescerende molekyler6, hvilket begrænser deres applikationer. Ud over begrænsninger på grund af behovet for specifikke fluorescerende mærkede molekyler har eksponering for intens lysbestråling vist sig at fremkalde cellulær skade og kan påvirke cellulære processer, hvilket er en stor ulempe ved undersøgelse af levende celler7.
Vores nuværende viden om de ultrastrukturelle detaljer i hår celle stereocilia bundter er opnået for det meste med forskellige elektronmikroskopi (EM) teknikker, såsom scanning elektronmikroskopi (SEM), transmission elektronmikroskopi (TEM), fryse-fraktur EM, og for nylig med 3D-teknikker såsom seriel skæring med fokuseret ion stråle eller kryo-EM tomografi8,9,10,11,12,13, 14,15,16. Desværre kræver alle disse EM-teknikker kemisk eller kryofixing af prøven. Afhængigt af fænomenets tidsskala gør dette krav en undersøgelse af de dynamiske processer ved spidsen af stereocilia enten umulig eller meget arbejdskrævende.
Begrænset indsats er blevet gjort for at billedet hår bundter af levende hårceller med atomare kraft mikroskopi (AFM)17,18. Da AFM opererer i fysiologiske løsninger, det kunne i teorien visualisere dynamiske ændringer i stereocilia bundter af levende hårceller over tid. Problemet ligger i principperne om høj opløsning AFM, hvilket indebærer en vis fysisk kontakt mellem AFM sonden og prøven, selv i den mindst skadelige "aflytning" mode19. Når AFM sonden støder på et stereocilium, det normalt går ned mod det, beskadige strukturen af håret bundt. Som følge heraf er denne teknik ikke egnet til at visualisere levende eller endda faste hårceller bundter17,18. Problemet kan delvist afhjælpes ved hjælp af en stor kugleformet AFM-sonde, der kun pålægger hydrodynamiske kræfter på overfladen af prøven20. Men selv om en sådan sonde er ideel til at teste mekaniske egenskaber af prøven21, det giver kun en sub-mikrometer opløsning ved billeddannelse af organ corti22 og stadig gælder for prøven en kraft, der kan være betydelig for de meget følsomme stereocilia bundter.
Scanning ionledningskopi (SICM) er en version af scanning sonde mikroskopi, der bruger et glas pipette sonde fyldt med en ledende løsning23. SICM registrerer overfladen, når pipetten nærmer sig cellen, og den elektriske strøm gennem pipetten falder. Da dette sker længe før du rører cellen, er SICM ideel til ikke-kontakt billeddannelse af levende celler i fysiologisk løsning24. Den bedste opløsning af SICM er på rækkefølgen af enkelte nanometer, som gør det muligt at løse individuelle proteinkomplekser ved plasmamembranen i en levende celle25. I lighed med andre scanningssondeteknikker er SICM imidlertid kun i stand til kun at afbilde relativt flade overflader. Vi overvandt denne begrænsning ved at opfinde hopping sonde ionledningsskala mikroskop (HPICM)26, hvor nanopipetten nærmer sig prøven på hvert billeddannelsespunkt (Figur 1A). Ved hjælp af HPICM, vi var i stand til at billedet stereocilia bundter i levende auditive hårceller med nanoskala opløsning27.
En anden grundlæggende fordel ved denne teknik er, at HPICM ikke kun er et billedbehandlingsværktøj. I modsætning til andre scanningssondeteknikker er HPICM/SICM-sonden en elektrode, der i vid udstrækning anvendes i cellefysiologi til elektriske optagelser og lokal levering af forskellige stimuli. Ionkanalaktivitet forstyrrer normalt ikke HPICM-billeddannelse, fordi den samlede strøm gennem HPICM-sonden er flere størrelsesordener større end den ekstracellulære strøm, der genereres af de største ionkanaler25. HPICM giver dog mulighed for præcis positionering af nanopipetten over en struktur af interesse og efterfølgende single-channel patch-clamp optagelse fra denne struktur28. Sådan fik vi de første foreløbige optagelser af enkeltkanalaktivitet ved spidsen af den ydre hårcelle stereocilia29. Det er værd at nævne, at selv en stor strøm gennem nanopipetten ikke kan producere væsentlige ændringer i potentialet på tværs af plasmamembranen på grund af enorme elektriske shunt af det ekstracellulære medium. Individuelle ionkanaler kan dog aktiveres mekanisk ved væskestrøm gennem nanopipetten30 eller kemisk ved lokal anvendelse af en agonist31.
I HPICM genereres billedet, når en nanopipet fortløbende nærmer sig prøven på et tidspunkt, trækker sig tilbage og derefter bevæger sig i sideretningen for at gentage tilgangen (Figur 1A). En patch klemme forstærker konstant anvender spænding på en AgCl ledning i pipetten (Figur 1B) til at generere en strøm på ~ 1 nA i badet løsning. Værdien af denne strøm, når pipetten er væk fra cellens overflade, bestemmes som referencestrøm (Iref, Figur 1C). Derefter flyttes pipetten i Z-aksen for at nærme sig prøven, indtil strømmen reduceres med et beløb, der er foruddefineret af brugeren (setpoint), normalt 0,2%-1% af Iref (Figur 1C, top trace). Systemet sparer derefter Z-værdien i dette øjeblik som prøvens højde sammen med X- og Y-koordinaterne for dette billedpunkt. Derefter trækkes pipetten væk fra overfladen (Figur 1C, bundspor) med en hastighed, der er defineret af brugeren, normalt 700-900 nm /ms. Efter tilbagetrækning flyttes pipetten (eller i vores tilfælde prøven - se figur 1B) sideværts til det næste billedpunkt, der opnås en ny referencestrømsværdi, og pipetten nærmer sig igen prøven og gentager processen. X-Y bevægelse af pipetten foretrækkes i en opretstående mikroskop setup, der typisk bruges til optagelser af hårcelle mechanotransduction strømme. I denne indstilling nærmer HPICM-sonden sig hårcellebundterne ikke fra toppen, men i en vinkel32. Den bedste opløsning af HPICM-billeddannelse opnås dog i en omvendt mikroskopopsætning (Figur 1A, B), hvor prøvens bevægelse i X-Y-retninger afkobles fra Z-bevægelse af nanopipetten, hvorved potentielle mekaniske genstande elimineres.
Ved hjælp af HPICM opnåede vi topografiske billeder af mus og rotte indre og ydre hår celle stereocilia bundter, og selv visualiseret forbindelserne mellem stereocilia, der er omkring 5 nm i diameter26,27. Succesen af hår celle bundt billeddannelse med denne teknik bygger på flere faktorer. For det første bør støjen (variansen) af nanopipetstrømmen være så lille som muligt for at muliggøre det lavest mulige setpoint for HPICM-billeddannelse. Et lavt setpunkt gør det muligt for HPICM-sonden at "fornemme" stereociliaoverfladen i en større afstand og i enhver vinkel til sondens tilgang og forbedrer overraskende nok X-Y-opløsningen af HPICM-billeddannelse (se Diskussion). For det andet bør vibrationerne og driverne i systemet reduceres til mindre end 10 nm, da de bidrager direkte til billedgenstandene. Endelig, selv om HPICM sonden og prøvestadiet flyttes i Z- og X-Y-akser af de kalibrerede feedbackstyrede piezo-aktuatorer, der har en nøjagtighed på et enkelt nanometer eller bedre, bestemmer nanopipettespidsens diameter spredning af strømmen (sensingvolumen) og dermed opløsningen (figur 1A). Derfor, før billeddannelse levende hårceller, er det vigtigt at trække de tilstrækkelige pipetter, nå den ønskede opløsning med kalibrering prøver, og opnå lav støj i registreringssystemet.
I mindst et par årtier har SICM-teknikken ikke været kommercielt tilgængelig, og den har kun udviklet sig af få laboratorier i verden med det førende laboratorium af prof. Korchev i Imperial College (UK). For nylig blev flere SICM-systemer kommercielt tilgængelige (se Materialetabel), som alle er baseret på de oprindelige HPICM-principper. Men, imaging stereocilia bundter i hårcellerne kræver flere brugerdefinerede ændringer, der er teknisk udfordrende (eller endda umuligt) i de lukkede "ready-to-go" systemer. Derfor er der behov for en vis komponentintegration. Da HPICM-opsætningen repræsenterer en plasterklemmeplatform med strengere vibrations- og driftskrav og en piezodrevet bevægelse af HPICM-sonden og prøven (Figur 1D), er denne integration relativt let for enhver forsker, der er dygtig til patchfastspænding. Men en videnskabsmand uden ordentlig baggrund ville helt sikkert brug for nogle uddannelse i elektrofysiologi først. På trods af de resterende udfordringer såsom at øge hastigheden af billeddannelse (se Diskussion), har vi været i stand til at billedet stereocilia bundter i levende hårceller med nanoskala opløsning uden at beskadige dem.
Dette papir præsenterer en detaljeret protokol til at udføre en vellykket HPICM billeddannelse af de levende auditive hår celle bundter i unge postnatal rotte eller mus cochlear explants ved hjælp af vores brugerdefinerede system. De integrerede komponenter er angivet i materialetabellen. Papiret beskriver også almindelige problemer, der kan opstå, og hvordan du foretager fejlfinding af dem.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Analog oscilloscope</td>
			<td>B&#38;K Precision</td>
			<td>2160C</td>
			<td>Analog oscilloscope for real-time monitoring of nanopipette current and Z-axis approach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM calibration standards</td>
			<td>TED PELLA Inc</td>
			<td>HS-100MG; HS-20MG</td>
			<td>These 100 and 20 nm calibration standards are used to test the performance of HPICM system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop vibration Isolator</td>
			<td>AMETEK/TMC</td>
			<td>Everstill K-400</td>
			<td>Active vibration isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>Borosilicate glass capillaries for the nanopipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>To be added to the bath solution to adjust osmolarity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>National Instruments Corporation</td>
			<td>PCI-6221</td>
			<td>Multi-channel input/output digitizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast analog Proportional-Integral-Derivative (PID) control for Z movement</td>
			<td>Standford Research Systems</td>
			<td>SIM900, SIM960, SIM980</td>
			<td>Instrumentation modules integrated in an external PID controller for Z movement. It requires a fast response that is usually not implemented in commercial piezo amplifiers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>AMETEK/TMC</td>
			<td>Type II</td>
			<td>Required to shield electromagnetic interference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td>Used as the dish for the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td>Extracellular (bath) solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrumentation amplifier</td>
			<td>Brownlee Precision</td>
			<td>Model 440</td>
			<td>Instrumentation amplifier provides required offsets, filtering, and secondary magnification or attenuation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-based micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2000/G</td>
			<td>Micropipette puller to fabricate the nanopipettes. Laser is needed for sharp quartz pipettes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lebovitz&#39;s L-15, without phenol red</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td>Extracellular (bath) solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>PatchStar</td>
			<td>Used for &#34;course&#34; positioning of the Z piezo actuator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td>Inverted optical microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td>The patch clamp amplifier measures the current through the nanopipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo amplifier (XY axes)</td>
			<td>Physik Instrumente (PI)</td>
			<td>E-500.00, E-505.00, E-509.C2A</td>
			<td>Amplification and PID control for XY piezo translation stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo amplifier (Z axis)</td>
			<td>Piezosystem jena</td>
			<td>ENT 400 &#38; 800</td>
			<td>Custom amplifier consisting of ENT 400 power supply and two ENT 800 amplifiers in parallel to achieve max current of 1.6 nA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Coverslips</td>
			<td>TED PELLA Inc</td>
			<td>26028</td>
			<td>Used in the fabrication of the chambers for the tissue&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SICM controller &#38; software*</td>
			<td>Ionscope, UK (ionscope.com)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom controller based on SBC6711 digital signal processing board from Innovative Integration Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer (Sylgard)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Used to attach the flexible glass fibers to the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon glue</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>734</td>
			<td>Used to glue the different parts of the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten rod</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>717500</td>
			<td>Used for holding the dental floss strands in the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY piezo nanopositioner</td>
			<td>Physik Instrumente (PI)</td>
			<td>P-733.2DD</td>
			<td>XY translation stage with capacitive sensors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z piezo nanopositioner</td>
			<td>Piezosystem jena</td>
			<td>RA 12/24 SG</td>
			<td>Ring piezoactuator with a strain gage sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">*Ionscope does not sell separate SICM controllers anymore. There are few other commercial systems:&#160; NX12-Bio and NX10 SICM,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Park Systems, Korea and SICM modules from ICAPPIC Limited, UK (icappic.com). All these systems are based on the original&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">HPICM principles. However, imaging stereocilia bundles in the hair cells requires several custom modifications that are technically&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">challenging (or even impossible) in the closed &#8220;ready-to-go&#8221; systems such as Ionscope or NX12-Bio/NX10. Currently, there is only one&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">modular system (ICAPPIC) that has the flexibility to suit any SICM/HPICM experiment but requires some component integration.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereocilia bundle imaging with nanoscale resolution in live mammalian auditory hair cells

Indre øre hårceller opdage lyd-induceret forskydninger og transduce disse stimuli i elektriske signaler i et hår bundt, der består af stereocilia, der er arrangeret i rækker af stigende højde. Når stereocilia afbøjes, trækker de på små (~ 5 nm i diameter) ekstracellulære spidsforbindelser, der forbinder stereocilia, som formidler kræfter til de mechanosensitive transduktionskanaler. Selv om mechanotransduktion er blevet undersøgt i levende hårceller i årtier, kan de funktionelt vigtige ultrastrukturelle detaljer i mechanotransduktionsmaskineriet ved spidsen af stereocilia (såsom tip link dynamik eller transduktionsafhængig stereocilia remodeling) stadig kun studeres i døde celler med elektronmikroskopi. Teoretisk set, scanning sonde teknikker, såsom atomare kraft mikroskopi, har nok opløsning til at visualisere overfladen af stereocilia. Men uafhængigt af billeddannelsestilstand beskadiger selv den mindste kontakt af atomprøvens mikroskopisonde med stereocilia-bundtet normalt bundtet. Her præsenterer vi en detaljeret protokol for hopping sonde ion ledningskopi (HPICM) billeddannelse af levende gnaver auditive hårceller. Denne ikke-kontakt scanning sonde teknik giver tid bortfalder billeddannelse af overfladen af levende celler med en kompleks topografi, ligesom hårceller, med enkelt nanometer opløsning og uden at gøre fysisk kontakt med prøven. HPICM bruger en elektrisk strøm, der passerer gennem glas nanopipetten til at detektere celleoverfladen i nærheden af pipetten, mens et 3D-positionering piezoelektrisk system scanner overfladen og genererer sit billede. Med HPICM, var vi i stand til at billedet stereocilia bundter og links forbinder stereocilia i levende auditive hårceller i flere timer uden mærkbar skade. Vi forventer, at brugen af HPICM vil tillade direkte udforskning af ultrastrukturelle ændringer i stereocilia af levende hårceller for bedre forståelse af deres funktion.

Protokollen præsenteres i dette papir kan bruges til at visualisere eventuelle levende celler med kompleks topografi. Efter disse trin, vi rutinemæssigt få billeder af levende rotte auditiv hår celle bundter (Figur 6B,D). På trods af at have lavere X-Y opløsning i forhold til SEM-billeder, kan vores HPICM-billeder med succes løse de forskellige rækker af stereocilia, formen af stereocilia tips, og selv de små links (~ 5 nm i diameter) forbinder tilstødende stereoci...

Watch this Scientific Journal Video about Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells at JoVE.com

Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells

Her præsenterer vi en protokol til Hopping Probe Ion Conductance Microscopy (HPICM), en ikke-kontakt scanning sonde teknik, der tillader nanoskala billeddannelse af stereocilia bundter i levende auditive hårceller.

Stereocilia Bundle Imaging med Nanoskala Opløsning i Live Mammalian auditive hårceller

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia ...

Denne praktiske kan hjælpe os med at studere dynamiske ændringer af nano strukturelle komponenter i den mekaniske elektriske transduktion maskiner på overfladen af hårcelle stereocilia bundter. Den største fordel ved denne teknik er time-lapse billeddannelse af overfladen af levende celler med kompleks topografi ved enkelt nanometer opløsning, og uden at gøre fysisk kontakt med prøven. Denne teknik kan anvendes på næsten enhver levende celle.Vi har tidligere matchet overfladen af lunge epitel cellelinjer inficeret med vira, muskelceller, i Mit Billede Bakterier snart. Test nanopipetterne i begyndelsen af hver billedbehandlingssession. Efter fremstilling af en nanopipette skal du kontrollere for bobler, fjerne eventuelle bobler, hvis de er til stede, og montere nanopipetten på hopping sondensledningsmikroskoprørholderen.Ved fire milliliter badopløsning til kammeret og læg kammeret på HPICM-stadiet. Indfør jordelektroden til badeopløsningen, og sørg for, at den spænding, der påføres pipetten gennem patchklemmeforstærkeren, er nul. Når du har placeret mikromanipulatoren i lodret position, skal du flytte pipetten i Z, indtil den rører ved væsken, og indstille forstærkerforskydningen til nul, før du tilføjer plus 100 millivolt for at kontrollere pipettestrømmen.Brug siliciumlim til at fastgøre AFM-kalibreringsstandarden til kammeret og dække prøven med fire milliliter HBSS. Brug dobbeltsidet tape til at fastgøre kammeret til X Y-stadiet i HPICM-opsætningen, og læg en ny nanopipette på holderen som demonstreret. Efter at have testet nanopipettens modstand og diameter skal du indstille strømmen til en nanoforstærker.Brug en grov patch klemme manipulator til at placere nanopipetten ca over midten af kalibreringsstandarden og øge det indstillede punkt, mens du overvåger signalet fra sensoren på Z piezo aktuator på et oscilloskop i realtid. Efter at have etableret en stabil repeterbar Z-tilgangscyklus, skal du reducere sættet til værdien lige over ustabilitetspunktet og flytte pipetten ned med en hastighed på ca. fem mikron i sekundet, indtil den når prøven. Det nederste niveau af realtidS Z-positioneringssignalet vil stige, hvilket indikerer, at nanopipetten trækkes tilbage på grund af sensing af prøveoverfladen.På grund af ujævn montering på AFM-standarden kan det højeste punkt i interesseområdet være ukendt. Sæt derfor amplituden af pipetten tilbagetrækning til mindst 200 til 500 nanometer. Pas på ikke at overskride den øvre grænse for Z piezo aktuator bevægelse, begynde billeddannelse ved lav opløsning.Når det højeste punkt i prøven i billeddannelsesområdet er blevet identificeret, skal du reducere humle amplituden og trække pipetten ca. 200 mikron tilbage langs Z-aksen for at forhindre uønsket kollision med prøven, før du flytter den til et nyt X Y-sted. Når interesseområdet er placeret, skal du begynde at billeddanne ved en højere opløsning. For auditiv hår celle billeddannelse, fast sikre en frisk isoleret organ Corti til et kammer ved hjælp af enten tandtråd, eller fleksible glas pipetter.Brug dobbeltsidet tape til at fastgøre kammeret fast til X Y piezo-stadiet og læg en ny nanopipette på holderen som demonstreret. Efter at have kontrolleret nanopipetmodstanden skal du bruge plasterklemmemikulatoren til at placere nanopipetten over hårcelleregionen, mens du observerer Corti X-plantens organ i et omvendt mikroskop. Optag, realtidsstrøm og Z-positioneringssignal på oscilloskopet for at kontrollere, om systemet er stabilt med et sætpunkt på 0,5% 6 eller lavere, og bestemme det optimale sætpunkt og nærme sig prøven som demonstreret.Udfør lav opløsning billeddannelse af prøven som demonstreret ved hjælp af en hop amplitud på mindst seks til otte mikron. Hvis nanopipetten skal flyttes til et nyt X Y-sted, skal pipetten trækkes tilbage omkring 500 nanometer for at undgå en kollision med høje træk i vævet og gentage hpicm-billeddannelsen med lav opløsning indtil det område af interesse, hvor hårcellerne er placeret. Derefter billede området af interesse på en højere opløsning i 15 minutter eller mindre.HPICM-protokollen kan bruges til at visualisere alle levende celler med en kompleks topografi, såsom levende rotte auditive hårcellebundter. På trods af at demonstrere en lavere X Y-opløsning i forhold til scanning elektron mikroskopi billeder, hpicm billeder kan med succes løse de forskellige rækker af stereocilia. Formen af stereociliaspidserne og endda de små fem nanometerforbindelser, der forbinder de tilstødende stereocilia.I betragtning af hpicm-billeddannelsens manglende kontakt kan kontinuerlig time-lapse-billeddannelse af den samme hårcellebundt udføres i flere timer uden at beskadige bundtets sammenhængskraft. Bemærk, at med et meget lavt sætpunkt kan systemet fortolke små udsving i strømmen som støder på celleoverfladen, hvilket fører til hvid prikstøj i billedet. Tilsvarende kan store hop amplituder øge pipettens laterale resonans, hvilket også resulterer i produktion af støjende pixels.I modsætning hertil, hvis hop amplituden er for lille, eller setpointet er for højt, kan nanopipetten kollidere med prøven, hvilket resulterer i billedartefakter eller hårbundtskader. Det vigtigste at huske, når du forsøger denne procedure er at tilbringe mindre end 15 minutter pr hår celle bundt, når du arbejder med levende celler. Efter at have fået et billede af håret bundt, kunne man forsøge at få enkelt kanal optagelser fra bestemte steder på overfladen af stereocilia til at besvare spørgsmål om mechanotransduction kanal egenskaber.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Høj opløsning funktionel magnetisk resonans Metoder til human midthjernen

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Høj opløsning Live-Imaging af celle adfærd i udviklingslandene neuroepitel

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp optagelser i indre øre-hårceller isoleret fra zebrafisk

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Funktionel Imaging af Auditory Cortex i voksne katte ved hjælp af High-felt fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Super-opløsning Imaging af neuronale Dense-core blærer

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

Høj opløsning<em&gt; In vivo</em&gt; Manuel Segmentering Protokol for humant hippocampus Underfelter Brug 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Optogenetic Stimulering af hørenerven

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...