Name: stereocilia bundle imaging with nanoscale resolution in live mammalian auditory hair cells
Uploaded: 2021-01-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells at JoVE.com

We danken Prof. Yuri Korchev (Imperial College, UK) voor de langdurige ondersteuning en het advies in alle fasen van het project. We bedanken ook Drs. Pavel Novak en Andrew Shevchuk (Imperial College, VK) en Oleg Belov (National Research Centre for Audiology, Rusland) voor hun hulp bij softwareontwikkeling. De studie werd ondersteund door NIDCD/NIH (R01 DC008861 en R01 DC014658 tot G.I.F.).

De studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen in de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals van de National Institutes of Health. Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Kentucky (protocol 00903M2005).
1. Productie en testen van de nanopipettes
<ol><li>Maak een programma in de micropipette-trekker om pipetten te verkrijgen met een weerstand tussen 200 en 400 MΩ, wat...

<ol>
	<li>Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+inner+hair+cell+mechanotransducer+channels+using+high-speed+calcium+imaging.">Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging.</a> Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).</li><li>Effertz, T., Becker, L., Peng, A. W., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositol-4,5-bisphosphate+regulates+auditory+hair-cell+mechanotransduction-channel+pore+properties+and+fast+adaptation.">Phosphoinositol-4,5-bisphosphate regulates auditory hair-cell mechanotransduction-channel pore properties and fast adaptation.</a> The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (48), 11632-11646 (2017).</li><li>Peng, A. W., Gnanasambandam, R., Sachs, F., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+independent+modulation+of+auditory+hair+cell+mechanotransduction+channel+open+probability+implicates+a+role+for+the+lipid+bilayer.">Adaptation independent modulation of auditory hair cell mechanotransduction channel open probability implicates a role for the lipid bilayer.</a> The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (10), 2945-2956 (2016).</li><li>Engstr&#246;m, H., Engstr&#246;m, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+hairs+on+cochlear+sensory+cells.">Structure of the hairs on cochlear sensory cells.</a> Hearing research. 1 (1), 49-66 (1978).</li><li>Conchello, J. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+microscopy.">Optical sectioning microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 920-931 (2005).</li><li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy.">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li><li>W&#228;ldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy.">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348 (2015).</li><li>Pickles, J. O., Comis, S. D., Osborne, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-links+between+stereocilia+in+the+guinea+pig+organ+of+Corti,+and+their+possible+relation+to+sensory+transduction.">Cross-links between stereocilia in the guinea pig organ of Corti, and their possible relation to sensory transduction.</a> Hearing Research. 15 (2), 103-112 (1984).</li><li>Furness, D. N., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-links+between+stereocilia+in+the+guinea+pig+cochlea.">Cross-links between stereocilia in the guinea pig cochlea.</a> Hearing Research. 18 (2), 177-188 (1985).</li><li>Jacobs, R. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+correlates+of+mechanoelectrical+transduction+in+hair+cells+of+the+bullfrog&#8217;s+internal+ear.">Ultrastructural correlates of mechanoelectrical transduction in hair cells of the bullfrog&#8217;s internal ear.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 547-561 (1990).</li><li>Goodyear, R. J., Marcotti, W., Kros, C. J., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+properties+of+stereociliary+link+types+in+hair+cells+of+the+mouse+cochlea.">Development and properties of stereociliary link types in hair cells of the mouse cochlea.</a> The Journal of Comparative Neurology. 485 (1), 75-85 (2005).</li><li>Kachar, B., Parakkal, M., Kurc, M., Zhao, Y., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+structure+of+hair-cell+tip+links.">High-resolution structure of hair-cell tip links.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 13336-13341 (2000).</li><li>V&#233;lez-Ortega, A. C., Freeman, M. J., Indzhykulian, A. A., Grossheim, J. M., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+current+is+essential+for+stability+of+the+transducing+stereocilia+in+mammalian+auditory+hair+cells.">Mechanotransduction current is essential for stability of the transducing stereocilia in mammalian auditory hair cells.</a> eLife. 6, 1-22 (2017).</li><li>Ivanchenko, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+scanning+electron+microscopy+of+anti-PKHD1L1+immuno-gold+labeled+mouse+hair+cell+stereocilia+bundles.">Serial scanning electron microscopy of anti-PKHD1L1 immuno-gold labeled mouse hair cell stereocilia bundles.</a> Scientific Data. 7 (1), 182 (2020).</li><li>Hadi, S., Alexander, A. J., V&#233;lez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-XVa+controls+both+staircase+architecture+and+diameter+gradation+of+stereocilia+rows+in+the+auditory+hair+cell+bundles.">Myosin-XVa controls both staircase architecture and diameter gradation of stereocilia rows in the auditory hair cell bundles.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology JARO. 21 (2), 121-135 (2020).</li><li>Metlagel, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryo-tomography+of+vestibular+hair-cell+stereocilia.">Electron cryo-tomography of vestibular hair-cell stereocilia.</a> Journal of Structural Biology. 206 (2), 149-155 (2019).</li><li>Langer, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+of+individual+stereocilia+of+living+cochlear+hair+cells+by+atomic+force+microscopy.">Mechanical stimulation of individual stereocilia of living cochlear hair cells by atomic force microscopy.</a> Ultramicroscopy. 82 (1-4), 269-278 (2000).</li><li>Dufr&#234;ne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+nanomicrobiology+using+atomic+force+microscopy.">Towards nanomicrobiology using atomic force microscopy.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (9), 674-680 (2008).</li><li>Putman, C. A., van der Werf, K. O., de Grooth, B. G., van Hulst, N. F., Greve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelasticity+of+living+cells+allows+high+resolution+imaging+by+tapping+mode+atomic+force+microscopy.">Viscoelasticity of living cells allows high resolution imaging by tapping mode atomic force microscopy.</a> Biophysical journal. 67 (4), 1749-1753 (1994).</li><li>Gavara, N., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncontact+microrheology+at+acoustic+frequencies+using+frequency-modulated+atomic+force+microscopy.">Noncontact microrheology at acoustic frequencies using frequency-modulated atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 7 (8), 650-654 (2010).</li><li>Cartagena-Rivera, A. X., Van Itallie, C. M., Anderson, J. M., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+surface+supracellular+mechanical+properties+in+polarized+epithelium+using+noninvasive+acoustic+force+spectroscopy.">Apical surface supracellular mechanical properties in polarized epithelium using noninvasive acoustic force spectroscopy.</a> Nature Communications. 8 (1), 1030 (2017).</li><li>Katsuno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRIOBP-5+sculpts+stereocilia+rootlets+and+stiffens+supporting+cells+enabling+hearing.">TRIOBP-5 sculpts stereocilia rootlets and stiffens supporting cells enabling hearing.</a> JCI Insight. 4 (12), (2019).</li><li>Hansma, P. K., Drake, B., Marti, O., Gould, S. A., Prater, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scanning+ion-conductance+microscope.">The scanning ion-conductance microscope.</a> Science. 243 (4891), 641-643 (1989).</li><li>Korchev, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+scanning+ion-conductance+microscope+for+imaging+of+living+cells.">Specialized scanning ion-conductance microscope for imaging of living cells.</a> Journal of Microscopy. 188 (Pt 1), 17-23 (1997).</li><li>Shevchuk, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+proteins+in+membranes+of+living+cells+by+high-resolution+scanning+ion+conductance+microscopy.">Imaging proteins in membranes of living cells by high-resolution scanning ion conductance microscopy.</a> Angewandte Chemie (International ed in English. 45 (14), 2212-2216 (2006).</li><li>Novak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+live-cell+imaging+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy.">Nanoscale live-cell imaging using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Nature Methods. 6 (4), 279-281 (2009).</li><li>V&#233;lez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+live+cochlear+stereocilia+at+a+nanoscale+resolution+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy.">Visualization of live cochlear stereocilia at a nanoscale resolution using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1427, 203-221 (2016).</li><li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+scanning+patch-clamp:+new+insights+into+cell+function.">High-resolution scanning patch-clamp: new insights into cell function.</a> FASEB Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (7), 748-750 (2002).</li><li>Frolenkov, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+recordings+from+the+apical+surface+of+outer+hair+cells+with+a+scanning+ion+conductance+probe.">Single-channel recordings from the apical surface of outer hair cells with a scanning ion conductance probe.</a> Association for Research in Otolaryngology. Abs. 444, (2004).</li><li>S&#225;nchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncontact+measurement+of+the+local+mechanical+properties+of+living+cells+using+pressure+applied+via+a+pipette.">Noncontact measurement of the local mechanical properties of living cells using pressure applied via a pipette.</a> Biophysical Journal. 95 (6), 3017-3027 (2008).</li><li>Korchev, Y. E., Negulyaev, Y. A., Edwards, C. R., Vodyanoy, I., Lab, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+localization+of+single+active+ion+channels+on+the+surface+of+a+living+cell.">Functional localization of single active ion channels on the surface of a living cell.</a> Nature Cell Biology. 2 (9), 616-619 (2000).</li><li>Shevchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angular+approach+scanning+ion+conductance+microscopy.">Angular approach scanning ion conductance microscopy.</a> Biophysical Journal. 110 (10), 2252-2265 (2016).</li><li>Furness, D. N., Katori, Y., Nirmal Kumar, B., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dimensions+and+structural+attachments+of+tip+links+in+mammalian+cochlear+hair+cells+and+the+effects+of+exposure+to+different+levels+of+extracellular+calcium.">The dimensions and structural attachments of tip links in mammalian cochlear hair cells and the effects of exposure to different levels of extracellular calcium.</a> Neuroscience. 154 (1), 10-21 (2008).</li></ol>

Om succesvolle HPICM-beelden te verkrijgen, moeten gebruikers een geluidsarm en trillingsarm systeem opzetten en geschikte pipetten produceren. We raden ten zeerste aan om AFM-kalibratiestandaarden te gebruiken om de stabiliteit van het systeem te testen voordat u probeert live cell imaging uit te voeren. Zodra de resolutie van het systeem is getest, kunnen gebruikers overwegen om vaste organen van Corti-monsters af te beelden om vertrouwd te raken met de beeldvormingsinstellingen voordat ze live cell imaging proberen.</...

Ondanks het feit dat stereociliabundels in de auditieve haarcellen groot genoeg zijn om te worden gevisualiseerd door optische microscopie en afgebogen in levende cellen in een patchklemexperiment, konden de essentiële structurele componenten van de transductiemachinerie zoals tiplinks alleen worden afgebeeld met de elektronenmicroscopie in dode cellen. In de auditieve haarcellen van zoogdieren bevindt de transductiemachinerie zich aan de onderkant van de tiplinks, d.w.z. aan de uiteinden van de kortere rij stereocilia1 en lokaal geregeld door de signalering aan de uiteinden van stereocilia2,3. Toch is labelvrije beeldvorming van de oppervlaktestructuren op deze locatie in levende haarcellen niet mogelijk vanwege de kleine afmetingen van stereocilia.
Het slakkenhuis van zoogdieren heeft twee soorten auditieve sensorische cellen: binnenste en buitenste haarcellen. In de binnenste haarcellen zijn stereocilia langer en dikker in vergelijking met die in de buitenste haarcellen4. De eerste en tweede rij stereocilia hebben een diameter van 300-500 nm in binnenste haarcellen van muizen of ratten. Door de diffractie van licht is de maximale resolutie die haalbaar is met een labelvrije optische microscopie ongeveer 200 nm. Vandaar dat visualisatie van individuele stereocilia binnen de eerste en tweede rij van de binnenste haarcelbundel relatief eenvoudig is met optische microscopie. Daarentegen hebben kortere rijen stereocilia in de binnenste haarcellen en alle stereocilia van de buitenste haarcellen diameters rond 100-200 nm en kunnen niet worden gevisualiseerd met optische microscopie5. Ondanks de recente vooruitgang in superresolutiebeeldvorming, blijft deze fundamentele beperking bestaan in elke optische labelvrije beeldvorming. Alle huidige commercieel verkrijgbare superresolutietechnieken vereisen een soort fluorescerendemoleculen 6, wat hun toepassingen beperkt. Naast beperkingen als gevolg van de behoefte aan specifieke fluorescerend gelabelde moleculen, is aangetoond dat blootstelling aan intense lichtbestraling cellulaire schade veroorzaakt en cellulaire processen kan beïnvloeden, wat een groot nadeel is bij het bestuderen van levende cellen7.
Onze huidige kennis van de ultrastructurele details van haarcel stereocilia bundels is meestal verkregen met verschillende elektronenmicroscopie (EM) technieken, zoals scanning elektronenmicroscopie (SEM), transmissie elektronenmicroscopie (TEM), freeze-fracture EM, en onlangs met 3D-technieken zoals seriële sectie met gerichte ionenbundel of cryo-EM tomografie8,9,10,11,12,13, 14,15,16. Helaas vereisen al deze EM-technieken chemische of cryofixatie van het monster. Afhankelijk van de tijdschaal van de verschijnselen, maakt deze vereiste een studie van de dynamische processen aan de uiteinden van stereocilia onmogelijk of zeer arbeidsintensief.
Er zijn beperkte inspanningen geleverd om haarbundels van levende haarcellen in beeld te brengen met atoomkrachtmicroscopie (AFM)17,18. Omdat AFM in fysiologische oplossingen werkt, zou het in theorie dynamische veranderingen in de stereociliabundels van levende haarcellen in de loop van de tijd kunnen visualiseren. Het probleem ligt in de principes van hoge resolutie AFM, wat een zeker fysiek contact tussen de AFM-sonde en het monster impliceert, zelfs in de minst schadelijke "tapmodus"19. Wanneer de AFM-sonde een stereocilium tegenkomt, crasht deze er meestal tegenaan en beschadigt de structuur van de haarbundel. Als gevolg hiervan is deze techniek niet geschikt voor het visualiseren van levende of zelfs vaste haarcellenbundels17,18. Het probleem kan gedeeltelijk worden verlicht door een grote balvormige AFM-sonde te gebruiken die alleen hydrodynamische krachten oplegt aan het oppervlak van het monster20. Hoewel een dergelijke sonde bij uitstek geschikt is om de mechanische eigenschappen van het monster21te testen, biedt deze slechts een resolutie van minder dan een micrometer bij het afbeelden van het orgaan van Corti22 en past het nog steeds een kracht toe op het monster die aanzienlijk kan zijn voor de zeer gevoelige stereociliabundels.
Scanning ion conductance microscopie (SICM) is een versie van scanning probe microscopie die gebruik maakt van een glazen pipet sonde gevuld met een geleidende oplossing23. SICM detecteert het oppervlak wanneer de pipet de cel nadert en de elektrische stroom door de pipet afneemt. Omdat dit gebeurt ruim voordat de cel wordt aangeraakt, is de SICM bij uitstek geschikt voor contactloze beeldvorming van levende cellen in fysiologische oplossing24. De beste resolutie van SICM is in de orde van enkele nanometers, waarmee individuele eiwitcomplexen kunnen worden opgelost bij het plasmamembraan van een levende cel25. Net als bij andere scanning probe-technieken is SICM echter in staat om alleen relatief vlakke oppervlakken in beeld te brengen. We hebben deze beperking overwonnen door het uitvinden van de hoppende sonde ionengeleidingsmicroscoop (HPICM)26, waarbij de nanopipette het monster op elk beeldvormingspunt nadert (Figuur 1A). Met behulp van HPICM konden we stereociliabundels in levende auditieve haarcellen met nanoschaalresolutie27 inbeeld brengen.
Een ander fundamenteel voordeel van deze techniek is dat HPICM niet alleen een imaging tool is. In tegenstelling tot andere scanning probe technieken, is de HPICM/SICM probe een elektrode die veel gebruikt wordt in de celfysiologie voor elektrische opnames en lokale afgifte van verschillende stimuli. Ionkanaalactiviteit interfereert meestal niet met HPICM-beeldvorming, omdat de totale stroom door de HPICM-sonde enkele ordes van grootte groter is dan de extracellulaire stroom die wordt gegenereerd door de grootste ionkanalen25. HPICM maakt echter een nauwkeurige positionering van de nanopipette over een interessante structuur en daaropvolgende eenkanaals patch-clamp-opname van deze structuurmogelijk 28. Dit is hoe we de eerste voorlopige opnames van eenkanaalsactiviteit aan de uiteinden van de buitenste haarcel stereocilia29verkregen . Het is vermeldenswaard dat zelfs een grote stroom door de nanopipette geen significante veranderingen van het potentieel over het plasmamembraan kan veroorzaken als gevolg van enorme elektrische shunt van het extracellulaire medium. Individuele ionkanalen kunnen echter mechanisch worden geactiveerd door vloeistofstroom door de nanopipette30 of chemisch door lokale toepassing van een agonist31.
In HPICM wordt het beeld gegenereerd wanneer een nanopipette het monster op een bepaald punt achtereenvolgens nadert, zich terugtrekt en vervolgens in laterale richting beweegt om de benadering te herhalen (Figuur 1A). Een patchklemversterker past constant spanning toe op een AgCl-draad in de pipet(figuur 1B)om een stroom van ~ 1 nA in de badoplossing te genereren. De waarde van deze stroom wanneer de pipet zich van het oppervlak van de cel bevindt, wordt bepaald als een referentiestroom (Iref, Figuur 1C). Vervolgens beweegt de pipet in de Z-as om het monster te benaderen totdat de stroom wordt verminderd met een hoeveelheid die vooraf is gedefinieerd door de gebruiker (instelpunt), meestal 0,2% -1% van de Iref (figuur 1C, bovenste trace). Het systeem slaat vervolgens de Z-waarde op dit moment op als de hoogte van het monster, samen met X- en Y-coördinaten van dit beeldpunt. Vervolgens wordt de pipet weggetrokken van het oppervlak(figuur 1C,onderste spoor) met een snelheid die door de gebruiker is gedefinieerd, meestal 700-900 nm / ms. Na intrekking wordt de pipet (of, in ons geval, het monster - zie figuur 1B) zijdelings naar het volgende beeldvormingspunt verplaatst, wordt een nieuwe referentiestroomwaarde verkregen en nadert de pipet opnieuw het monster en herhaalt het proces. De X-Y-beweging van de pipet heeft de voorkeur in een rechtopstaande microscoopopstelling die meestal wordt gebruikt voor opnames van de mechanotransductiestromen van de haarcel. In deze instelling benadert de HPICM-sonde de haarcelbundels niet van bovenaf, maar onder een hoek32. De beste resolutie van HPICM-beeldvorming wordt echter bereikt in een omgekeerde microscoopopstelling(Figuur 1A,B),waarbij de beweging van het monster in X-Y-richtingen wordt ontkoppeld van Z-beweging van de nanopipette, waardoor potentiële mechanische artefacten worden geëlimineerd.
Met behulp van HPICM verkregen we topografische beelden van muis en rat binnen- en buitenste haarcel stereocilia bundels, en visualiseerden zelfs de verbindingen tussen de stereocilia die ongeveer 5 nm in diameter26,27zijn. Het succes van beeldvorming van haarcellenbundels met deze techniek is afhankelijk van verschillende factoren. Ten eerste moet de ruis (variantie) van de nanopipettestroom zo klein mogelijk zijn om het laagst mogelijke instelpunt voor HPICM-beeldvorming mogelijk te maken. Een laag instelpunt stelt HPICM-sonde in staat om het stereocilia-oppervlak op een grotere afstand en onder elke hoek ten opzichte van de sondebenadering te "detecteren" en verbetert verrassend genoeg de X-Y-resolutie van HPICM-beeldvorming (zie discussie). Ten tweede moeten de trillingen en driften in het systeem worden verminderd tot minder dan 10 nm, omdat ze direct bijdragen aan de beeldvormingsartefacten. Ten slotte, hoewel de HPICM-sonde en de monstertrap in Z- en X-Y-assen worden verplaatst door de gekalibreerde feedbackgestuurde piëzo-actuatoren met een nauwkeurigheid van een enkele nanometer of beter, bepaalt de diameter van de nanopipettepunt de spreiding van de stroom (detectievolume) en dus de resolutie(figuur 1A). Daarom is het van vitaal belang om, voordat u levende haarcellen in beeld brengt, de juiste pipetten te trekken, de gewenste resolutie te bereiken met kalibratiemonsters en een laag geluidsniveau in het opnamesysteem te bereiken.
Al minstens een paar decennia is de SICM-techniek niet commercieel beschikbaar en is deze door slechts enkele laboratoria ter wereld ontwikkeld met het toonaangevende laboratorium van Prof. Korchev in het Imperial College (VK). Onlangs zijn verschillende SICM-systemen commercieel beschikbaar geworden (zie Tabel met materialen),die allemaal zijn gebaseerd op de oorspronkelijke HPICM-principes. Het afbeelden van stereociliabundels in de haarcellen vereist echter verschillende aangepaste aanpassingen die technisch uitdagend (of zelfs onmogelijk) zijn in de gesloten "ready-to-go" -systemen. Daarom is enige componentintegratie nodig. Aangezien HPICM-opstelling een patchkleminstallatie vertegenwoordigt met strengere trillings- en driftvereisten en een piëzo-aangedreven beweging van de HPICM-sonde en het monster(figuur 1D),is deze integratie relatief eenvoudig voor elke onderzoeker, die bekwaam is in patchklemmen. Een wetenschapper zonder de juiste achtergrond zou echter zeker eerst enige training in elektrofysiologie nodig hebben. Ondanks resterende uitdagingen zoals het verhogen van de snelheid van beeldvorming (zie Discussie),zijn we in staat geweest om stereocilia-bundels in levende haarcellen met nanoschaalresolutie in beeld te brengen zonder ze te beschadigen.
Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol om succesvolle HPICM-beeldvorming uit te voeren van de levende auditieve haarcelbundels in jonge postnatale rat- of muiscochleaire explantaten met behulp van ons aangepaste systeem. De geïntegreerde componenten zijn opgenomen in de tabel met materialen. Het artikel beschrijft ook veelvoorkomende problemen die kunnen worden ondervonden en hoe u deze kunt oplossen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Analog oscilloscope</td>
			<td>B&#38;K Precision</td>
			<td>2160C</td>
			<td>Analog oscilloscope for real-time monitoring of nanopipette current and Z-axis approach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM calibration standards</td>
			<td>TED PELLA Inc</td>
			<td>HS-100MG; HS-20MG</td>
			<td>These 100 and 20 nm calibration standards are used to test the performance of HPICM system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop vibration Isolator</td>
			<td>AMETEK/TMC</td>
			<td>Everstill K-400</td>
			<td>Active vibration isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>Borosilicate glass capillaries for the nanopipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>To be added to the bath solution to adjust osmolarity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>National Instruments Corporation</td>
			<td>PCI-6221</td>
			<td>Multi-channel input/output digitizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast analog Proportional-Integral-Derivative (PID) control for Z movement</td>
			<td>Standford Research Systems</td>
			<td>SIM900, SIM960, SIM980</td>
			<td>Instrumentation modules integrated in an external PID controller for Z movement. It requires a fast response that is usually not implemented in commercial piezo amplifiers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>AMETEK/TMC</td>
			<td>Type II</td>
			<td>Required to shield electromagnetic interference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td>Used as the dish for the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td>Extracellular (bath) solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrumentation amplifier</td>
			<td>Brownlee Precision</td>
			<td>Model 440</td>
			<td>Instrumentation amplifier provides required offsets, filtering, and secondary magnification or attenuation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-based micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2000/G</td>
			<td>Micropipette puller to fabricate the nanopipettes. Laser is needed for sharp quartz pipettes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lebovitz&#39;s L-15, without phenol red</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td>Extracellular (bath) solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>PatchStar</td>
			<td>Used for &#34;course&#34; positioning of the Z piezo actuator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td>Inverted optical microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td>The patch clamp amplifier measures the current through the nanopipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo amplifier (XY axes)</td>
			<td>Physik Instrumente (PI)</td>
			<td>E-500.00, E-505.00, E-509.C2A</td>
			<td>Amplification and PID control for XY piezo translation stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo amplifier (Z axis)</td>
			<td>Piezosystem jena</td>
			<td>ENT 400 &#38; 800</td>
			<td>Custom amplifier consisting of ENT 400 power supply and two ENT 800 amplifiers in parallel to achieve max current of 1.6 nA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Coverslips</td>
			<td>TED PELLA Inc</td>
			<td>26028</td>
			<td>Used in the fabrication of the chambers for the tissue&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SICM controller &#38; software*</td>
			<td>Ionscope, UK (ionscope.com)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom controller based on SBC6711 digital signal processing board from Innovative Integration Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer (Sylgard)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Used to attach the flexible glass fibers to the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon glue</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>734</td>
			<td>Used to glue the different parts of the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten rod</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>717500</td>
			<td>Used for holding the dental floss strands in the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY piezo nanopositioner</td>
			<td>Physik Instrumente (PI)</td>
			<td>P-733.2DD</td>
			<td>XY translation stage with capacitive sensors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z piezo nanopositioner</td>
			<td>Piezosystem jena</td>
			<td>RA 12/24 SG</td>
			<td>Ring piezoactuator with a strain gage sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">*Ionscope does not sell separate SICM controllers anymore. There are few other commercial systems:&#160; NX12-Bio and NX10 SICM,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Park Systems, Korea and SICM modules from ICAPPIC Limited, UK (icappic.com). All these systems are based on the original&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">HPICM principles. However, imaging stereocilia bundles in the hair cells requires several custom modifications that are technically&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">challenging (or even impossible) in the closed &#8220;ready-to-go&#8221; systems such as Ionscope or NX12-Bio/NX10. Currently, there is only one&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">modular system (ICAPPIC) that has the flexibility to suit any SICM/HPICM experiment but requires some component integration.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereocilia bundle imaging with nanoscale resolution in live mammalian auditory hair cells

Binnenoorhaarcellen detecteren door geluid geïnduceerde verplaatsingen en transduceren deze stimuli in elektrische signalen in een haarbundel die bestaat uit stereocilia die zijn gerangschikt in rijen van toenemende hoogte. Wanneer stereocilia worden afgebogen, trekken ze aan kleine (~ 5 nm in diameter) extracellulaire tiplinks die stereocilia met elkaar verbinden, die krachten overbrengen naar de mechanosensitieve transductiekanalen. Hoewel mechanotransductie al tientallen jaren wordt bestudeerd in levende haarcellen, kunnen de functioneel belangrijke ultrastructurele details van de mechanotransductiemachinerie aan de uiteinden van stereocilia (zoals tiplinkdynamica of transductie-afhankelijke stereocilia remodeling) nog steeds alleen worden bestudeerd in dode cellen met elektronenmicroscopie. Theoretisch hebben scanning probe technieken, zoals atoomkrachtmicroscopie, voldoende resolutie om het oppervlak van stereocilia te visualiseren. Echter, onafhankelijk van de beeldvormingsmodus, beschadigt zelfs het geringste contact van de atoomkrachtmicroscopiesonde met de stereociliabundel meestal de bundel. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de hoppping probe ion conductance microscopy (HPICM) beeldvorming van levende knaagdier auditieve haarcellen. Deze contactloze scanning probe-techniek maakt time-lapse beeldvorming van het oppervlak van levende cellen mogelijk met een complexe topografie, zoals haarcellen, met een resolutie van enkele nanometers en zonder fysiek contact met het monster te maken. De HPICM maakt gebruik van een elektrische stroom die door de glazen nanopipette gaat om het celoppervlak in de nabijheid van de pipet te detecteren, terwijl een piëzo-elektrisch systeem met 3D-positionering het oppervlak scant en zijn beeld genereert. Met HPICM waren we in staat om stereociliabundels en de verbindingen die stereocilia met elkaar verbinden in live auditieve haarcellen gedurende enkele uren in beeld te brengen zonder merkbare schade. We verwachten dat het gebruik van HPICM directe verkenning van ultrastructurele veranderingen in de stereocilia van levende haarcellen mogelijk zal maken voor een beter begrip van hun functie.

Het protocol dat in dit artikel wordt gepresenteerd, kan worden gebruikt om levende cellen met complexe topografie te visualiseren. Door deze stappen te volgen, verkrijgen we routinematig beelden van levende auditieve haarcelbundels van ratten(Figuur 6B,D). Ondanks het feit dat ze een lagere X-Y-resolutie hebben in vergelijking met SEM-beelden, kunnen onze HPICM-beelden met succes de verschillende rijen stereocilia, de vorm van de stereocilia-tips en zelfs de kleine links (~...

Watch this Scientific Journal Video about Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells at JoVE.com

Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells

Hier presenteren we een protocol voor de Hopping Probe Ion Conductance Microscopy (HPICM), een contactloze scanning probe-techniek die beeldvorming op nanoschaal van stereocilia-bundels in levende auditieve haarcellen mogelijk maakt.

Stereocilia bundel beeldvorming met nanoschaalresolutie in levende auditieve haarcellen van zoogdieren

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia ...

Deze praktische kan ons helpen dynamische veranderingen van de nano structurele componenten van de mechanische elektrische transductiemachines aan het oppervlak van de haarcel stereocilia bundels te bestuderen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de time-lapse beeldvorming van het oppervlak van levende cellen met complexe topografie met een resolutie van één nanometer en zonder fysiek contact met het monster te maken. Deze techniek kan worden toegepast op bijna elke levende cel.We hebben eerder het oppervlak van longepitheelcellijnen die zijn geïnfecteerd met virussen, spiercellen, gematcht in My Image Bacteria Soon. Test de nanopipettes aan het begin van elke beeldvormingssessie. Controleer na het vervaardigen van een nanopipette op bubbels, verwijder eventuele bubbels indien aanwezig en monteer de nanopipette op de pipethouder van de iongeleidingsmicroscoop van de hoppende sonde.Bij vier milliliter badoplossing naar de kamer en plaats de kamer op het HPICM-podium. Breng de aardelektrode in de badoplossing en zorg ervoor dat de spanning die via de patchklemversterker op de pipet wordt uitgeoefend nul is. Nadat u de micromanipulator in de verticale positie hebt geplaatst, beweegt u de pipet in Z totdat deze de vloeistof raakt en stelt u de offset van de versterker in op nul, voordat u plus 100 millivolt toevoegt om de pipetstroom te controleren.Gebruik siliconenlijm om de AFM-kalibratiestandaard aan de kamer te bevestigen en bedek het monster met vier milliliter HBSS. Gebruik dubbelzijdige tape om de kamer vast te maken aan de X Y-fase van de HPICM-opstelling en laad een nieuwe nanopipette op de houder zoals gedemonstreerd. Na het testen van de nanopipetteweerstand en diameter, stelt u de stroom in op één nano-versterker.Gebruik een grove patchklemmanipulator om de nanopipette ongeveer boven het midden van de kalibratiestandaard te plaatsen en het instelpunt te verhogen terwijl het signaal van de sensor van de Z-piëzo-actuator op een oscilloscoop in realtime wordt bewaakt. Nadat een stabiele herhaalbare Z-naderingscyclus is vastgesteld, verlaagt u het instelpunt tot de waarde net boven het instabiliteitspunt en beweegt u de pipet met een snelheid van ongeveer vijf micron per seconde naar beneden, totdat deze het monster bereikt. Het onderste niveau van het real-time Z-positioneringssignaal zal toenemen, wat aangeeft dat de nanopipette wordt teruggetrokken als gevolg van het detecteren van het monsteroppervlak.Door ongelijke montage op de AFM-norm kan het hoogste punt van het interessegebied onbekend zijn. Stel daarom de amplitude van de pipetterugtrekking in op ten minste 200 tot 500 nanometer. Zorg ervoor dat u de bovengrens van de Z-piëzo-actuatorbeweging niet overschrijdt en begin met beeldvorming met een lage resolutie.Zodra het hoogste punt van het monster in het beeldvormingsgebied is geïdentificeerd, verlaagt u de hopamplitude en trekt u de pipet ongeveer 200 micron langs de Z-as in om een ongewenste botsing met het monster te voorkomen voordat u het naar een nieuwe X Y-locatie verplaatst. Wanneer het interessegebied is gelokaliseerd, begint u met het afbeelden met een hogere resolutie. Voor auditieve beeldvorming van haarcellen, bevestig een vers geïsoleerd orgaan van Corti stevig aan een kamer met behulp van tandzijde of flexibele glazen pipetten.Gebruik dubbelzijdige tape om de kamer stevig vast te zetten aan het X Y piëzostadium en laad een nieuwe nanopipette op de houder zoals gedemonstreerd. Na het controleren van de nanopipetteweerstand, gebruikt u de patchklemmicromanipor om de nanopipette over het haarcelgebied te plaatsen terwijl u het orgaan van de Corti X-plant in een omgekeerde microscoop observeert. Registreer het real-time stroom- en Z-positioneringssignaal op de oscilloscoop om te controleren of het systeem stabiel is met een instelpunt van 0,5% 6 of lager, en bepaal het optimale instelpunt en benader het monster zoals gedemonstreerd.Voer lage resolutie beeldvorming van het monster uit zoals aangetoond met behulp van een hopamplitude van ten minste zes tot acht micron. Als de nanopipette naar een nieuwe X Y-locatie moet worden verplaatst, trekt u de pipet ongeveer 500 nanometer in om een botsing met hoge functies in het weefsel te voorkomen en herhaalt u de HPICM-beeldvorming met lage resolutie tot het gebied van belang waar de haarcellen zich bevinden. Stel vervolgens het gewenste gebied in een hogere resolutie in 15 minuten of minder voor.Het HPICM-protocol kan worden gebruikt om levende cellen met een complexe topografie te visualiseren, zoals levende auditieve haarcelbundels van ratten. Ondanks het aantonen van een lagere X Y-resolutie in vergelijking met scanning elektronenmicroscopiebeelden, kunnen HPICM-beelden met succes de verschillende rijen stereocilia oplossen. De vorm van de stereocilia-tips en zelfs de kleine vijf nanometerverbindingen verbinden de aangrenzende stereocilia.Gezien de contactloze aard van HPICM-beeldvorming, kan continue time-lapse-beeldvorming van dezelfde haarcelbundel gedurende enkele uren worden uitgevoerd zonder de bundelcohesie te beschadigen. Merk op dat bij een zeer laag instelpunt het systeem kleine fluctuaties in de stroom kan interpreteren als het tegenkomen van het celoppervlak, wat leidt tot witte puntruis in de afbeelding. Evenzo kunnen grote hopamplitudes de laterale resonantie van de pipet verhogen, wat ook resulteert in de productie van luidruchtige pixels.Als de hopamplitude daarentegen te klein is of het instelpunt te hoog is, kan de nanopipette botsen met het monster, wat resulteert in beeldartefacten of schade aan de haarbundel. Het belangrijkste om te onthouden bij het proberen van deze procedure is om minder dan 15 minuten per haarcelbundel door te brengen bij het werken met levende cellen. Na het verkrijgen van een beeld van de haarbundel, zou men kunnen proberen om enkelkanaalsopnamen te verkrijgen van specifieke locaties op het oppervlak van stereocilia om vragen over mechanotransductiekanaaleigenschappen te beantwoorden.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Live-beeldvorming van PKC Translocatie in Sf9 cellen en in Aplysia sensorische neuronen

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Time-lapse Live-Imaging van klonaal verwante neurale progenitorcellen in de ontwikkelingslanden zebravis voorhersenen

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell imaging van zintuig voorloper cellen in Intact Drosophila Poppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Hoge resolutie functionele magnetische resonantie imaging methoden voor Human middenhersenen

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Met een hoge resolutie Live-Imaging van cel gedrag in de ontwikkelingslanden Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch Clamp Opnamen in Binnen-oorhaar cellen geïsoleerd uit zebravis

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Functionele Beeldvorming van de auditieve cortex in volwassen katten met behulp van High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Super-resolution Imaging van Neuronal Dense-core Blaasjes

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

Hoge resolutie<em&gt; In Vivo</em&gt; Manual Segmentatie Protocol voor menselijk hippocampus met behulp van 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Optogenetische stimulatie van de gehoorzenuw

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...