Name: stereocilia bundle imaging with nanoscale resolution in live mammalian auditory hair cells
Uploaded: 2021-01-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells at JoVE.com

Wir danken Prof. Yuri Korchev (Imperial College, UK) für die langjährige Unterstützung und Beratung in allen Phasen des Projekts. Wir danken auch Dr. Pavel Novak und Andrew Shevchuk (Imperial College, UK) sowie Oleg Belov (National Research Centre for Audiology, Russland) für ihre Hilfe bei der Softwareentwicklung. Die Studie wurde von NIDCD/NIH unterstützt (R01 DC008861 und R01 DC014658 bis G.I.F.).

Die Studie wurde in Übereinstimmung mit den Empfehlungen im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren der National Institutes of Health durchgeführt. Alle Tierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of Kentucky genehmigt (Protokoll 00903M2005).
1. Herstellung und Prüfung der Nanopipetten
<ol><li>Erstellen Sie im Mikropipettenzieher ein Programm, um Pipetten mit einem Widerstand zwischen 200 und 400 MΩ z...

<ol>
	<li>Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+inner+hair+cell+mechanotransducer+channels+using+high-speed+calcium+imaging.">Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging.</a> Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).</li><li>Effertz, T., Becker, L., Peng, A. W., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositol-4,5-bisphosphate+regulates+auditory+hair-cell+mechanotransduction-channel+pore+properties+and+fast+adaptation.">Phosphoinositol-4,5-bisphosphate regulates auditory hair-cell mechanotransduction-channel pore properties and fast adaptation.</a> The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (48), 11632-11646 (2017).</li><li>Peng, A. W., Gnanasambandam, R., Sachs, F., Ricci, A. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+correlates+of+mechanoelectrical+transduction+in+hair+cells+of+the+bullfrog&#8217;s+internal+ear.">Ultrastructural correlates of mechanoelectrical transduction in hair cells of the bullfrog&#8217;s internal ear.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 547-561 (1990).</li><li>Goodyear, R. J., Marcotti, W., Kros, C. J., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+properties+of+stereociliary+link+types+in+hair+cells+of+the+mouse+cochlea.">Development and properties of stereociliary link types in hair cells of the mouse cochlea.</a> The Journal of Comparative Neurology. 485 (1), 75-85 (2005).</li><li>Kachar, B., Parakkal, M., Kurc, M., Zhao, Y., Gillespie, P. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+scanning+electron+microscopy+of+anti-PKHD1L1+immuno-gold+labeled+mouse+hair+cell+stereocilia+bundles.">Serial scanning electron microscopy of anti-PKHD1L1 immuno-gold labeled mouse hair cell stereocilia bundles.</a> Scientific Data. 7 (1), 182 (2020).</li><li>Hadi, S., Alexander, A. J., V&#233;lez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+of+individual+stereocilia+of+living+cochlear+hair+cells+by+atomic+force+microscopy.">Mechanical stimulation of individual stereocilia of living cochlear hair cells by atomic force microscopy.</a> Ultramicroscopy. 82 (1-4), 269-278 (2000).</li><li>Dufr&#234;ne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+nanomicrobiology+using+atomic+force+microscopy.">Towards nanomicrobiology using atomic force microscopy.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (9), 674-680 (2008).</li><li>Putman, C. A., van der Werf, K. O., de Grooth, B. G., van Hulst, N. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+surface+supracellular+mechanical+properties+in+polarized+epithelium+using+noninvasive+acoustic+force+spectroscopy.">Apical surface supracellular mechanical properties in polarized epithelium using noninvasive acoustic force spectroscopy.</a> Nature Communications. 8 (1), 1030 (2017).</li><li>Katsuno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRIOBP-5+sculpts+stereocilia+rootlets+and+stiffens+supporting+cells+enabling+hearing.">TRIOBP-5 sculpts stereocilia rootlets and stiffens supporting cells enabling hearing.</a> JCI Insight. 4 (12), (2019).</li><li>Hansma, P. K., Drake, B., Marti, O., Gould, S. A., Prater, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scanning+ion-conductance+microscope.">The scanning ion-conductance microscope.</a> Science. 243 (4891), 641-643 (1989).</li><li>Korchev, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+scanning+ion-conductance+microscope+for+imaging+of+living+cells.">Specialized scanning ion-conductance microscope for imaging of living cells.</a> Journal of Microscopy. 188 (Pt 1), 17-23 (1997).</li><li>Shevchuk, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+proteins+in+membranes+of+living+cells+by+high-resolution+scanning+ion+conductance+microscopy.">Imaging proteins in membranes of living cells by high-resolution scanning ion conductance microscopy.</a> Angewandte Chemie (International ed in English. 45 (14), 2212-2216 (2006).</li><li>Novak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+live-cell+imaging+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy.">Nanoscale live-cell imaging using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Nature Methods. 6 (4), 279-281 (2009).</li><li>V&#233;lez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+live+cochlear+stereocilia+at+a+nanoscale+resolution+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy.">Visualization of live cochlear stereocilia at a nanoscale resolution using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1427, 203-221 (2016).</li><li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+scanning+patch-clamp:+new+insights+into+cell+function.">High-resolution scanning patch-clamp: new insights into cell function.</a> FASEB Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (7), 748-750 (2002).</li><li>Frolenkov, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+recordings+from+the+apical+surface+of+outer+hair+cells+with+a+scanning+ion+conductance+probe.">Single-channel recordings from the apical surface of outer hair cells with a scanning ion conductance probe.</a> Association for Research in Otolaryngology. Abs. 444, (2004).</li><li>S&#225;nchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncontact+measurement+of+the+local+mechanical+properties+of+living+cells+using+pressure+applied+via+a+pipette.">Noncontact measurement of the local mechanical properties of living cells using pressure applied via a pipette.</a> Biophysical Journal. 95 (6), 3017-3027 (2008).</li><li>Korchev, Y. E., Negulyaev, Y. A., Edwards, C. R., Vodyanoy, I., Lab, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+localization+of+single+active+ion+channels+on+the+surface+of+a+living+cell.">Functional localization of single active ion channels on the surface of a living cell.</a> Nature Cell Biology. 2 (9), 616-619 (2000).</li><li>Shevchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angular+approach+scanning+ion+conductance+microscopy.">Angular approach scanning ion conductance microscopy.</a> Biophysical Journal. 110 (10), 2252-2265 (2016).</li><li>Furness, D. N., Katori, Y., Nirmal Kumar, B., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dimensions+and+structural+attachments+of+tip+links+in+mammalian+cochlear+hair+cells+and+the+effects+of+exposure+to+different+levels+of+extracellular+calcium.">The dimensions and structural attachments of tip links in mammalian cochlear hair cells and the effects of exposure to different levels of extracellular calcium.</a> Neuroscience. 154 (1), 10-21 (2008).</li></ol>

Um erfolgreiche HPICM-Bilder zu erhalten, müssen Benutzer ein rausch- und vibrationsarmes System einrichten und geeignete Pipetten herstellen. Wir empfehlen dringend die Verwendung von AFM-Kalibrierstandards, um die Stabilität des Systems zu testen, bevor Sie versuchen, eine Lebendzellbildgebung durchzuführen. Sobald die Auflösung des Systems getestet wurde, können Benutzer die Bildgebung eines festen Organs von Corti-Proben in Betracht ziehen, um sich mit den Bildgebungseinstellungen vertraut zu machen, bevor sie e...

Trotz der Tatsache, dass Stereozilienbündel in den auditiven Haarzellen groß genug sind, um durch optische Mikroskopie sichtbar gemacht und in einem Patch-Clamp-Experiment in lebenden Zellen abgelenkt zu werden, konnten die wesentlichen strukturellen Komponenten der Transduktionsmaschinerie wie Spitzenverbindungen nur mit der Elektronenmikroskopie in toten Zellen abgebildet werden. In den Säugetier-Hörhaarzellen befindet sich die Transduktionsmaschinerie an den unteren Enden der Spitzenverbindungen, d.h. an den Spitzen der kürzeren Reihe Stereozilien1 und wird lokal durch die Signalübertragung an den Spitzen der Stereozilien2,3reguliert. Eine markierungsfreie Abbildung der Oberflächenstrukturen an dieser Stelle in lebenden Haarzellen ist jedoch aufgrund der geringen Größe von Stereozilien nicht möglich.
Die Cochlea von Säugetieren hat zwei Arten von auditiven Sinneszellen: innere und äußere Haarzellen. In den inneren Haarzellen sind Stereozilien länger und dicker als in den äußeren Haarzellen4. Die erste und zweite Reihe von Stereozilien haben einen Durchmesser von 300-500 nm in inneren Haarzellen von Mäusen oder Ratten. Durch die Beugung des Lichts beträgt die maximale Auflösung, die mit einer markierungsfreien optischen Mikroskopie erreicht werden kann, etwa 200 nm. Daher ist die Visualisierung einzelner Stereozilien in der ersten und zweiten Reihe des inneren Haarzellbündels mit der optischen Mikroskopie relativ einfach. Im Gegensatz dazu haben kürzere Stereozilien in den inneren Haarzellen und alle Stereozilien der äußeren Haarzellen Durchmesser um 100-200 nm und können mit optischer Mikroskopie nicht sichtbar gemacht werden5. Trotz der jüngsten Fortschritte bei der hochauflösenden Bildgebung besteht diese grundlegende Einschränkung bei jeder optischen, markierungsfreien Bildgebung fort. Alle derzeit kommerziell erhältlichen Superauflösungstechniken erfordern eine Art fluoreszierende Moleküle6, was ihre Anwendungen einschränkt. Zusätzlich zu den Einschränkungen aufgrund des Bedarfs an spezifischen fluoreszenzmarkierten Molekülen hat sich gezeigt, dass die Exposition gegenüber intensiver Lichtbestrahlung zelluläre Schäden induziert und zelluläre Prozesse beeinflussen könnte, was bei der Untersuchung lebender Zellen ein großer Nachteil ist7.
Unser aktuelles Wissen über die ultrastrukturellen Details von Haarzell-Stereozilienbündeln wurde hauptsächlich mit verschiedenen Elektronenmikroskopietechniken (EM) wie Rasterelektronenmikroskopie (REM), Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Gefrierbruch-EM und kürzlich mit 3D-Techniken wie seriellem Schnitt mit fokussiertem Ionenstrahl oder Kryo-EM-Tomographie8,9,10,11,12,13, 14,15,16. Leider erfordern alle diese EM-Techniken eine chemische oder Kryofixierung der Probe. Abhängig von der Zeitskala der Phänomene macht diese Anforderung eine Untersuchung der dynamischen Prozesse an den Spitzen der Stereozilien entweder unmöglich oder sehr arbeitsintensiv.
Es wurden begrenzte Anstrengungen unternommen, um Haarbündel lebender Haarzellen mit Rasterkraftmikroskopie (AFM)abzubilden 17,18. Da AFM in physiologischen Lösungen arbeitet, könnte es theoretisch dynamische Veränderungen in den Stereozilienbündeln lebender Haarzellen im Laufe der Zeit visualisieren. Das Problem liegt in den Prinzipien des hochauflösenden AFM, das einen gewissen physikalischen Kontakt zwischen der AFM-Sonde und der Probe impliziert, selbst im am wenigsten schädlichen "Tapping" -Modus19. Wenn die AFM-Sonde auf ein Stereocilium trifft, prallt sie normalerweise dagegen und beschädigt die Struktur des Haarbündels. Infolgedessen ist diese Technik nicht geeignet, um lebende oder sogar feste Haarzellenbündel17,18 zu visualisieren. Das Problem kann teilweise durch die Verwendung einer großen kugelförmigen AFM-Sonde gelindert werden, die nur hydrodynamische Kräfte auf die Oberfläche der Probe ausübt20. Obwohl eine solche Sonde ideal geeignet ist, um die mechanischen Eigenschaften der Probe21zu testen, liefert sie bei der Abbildung des Corti22-Organs nur eine Auflösung im Submikrometerbereich und übt dennoch eine Kraft auf die Probe aus, die für die hochempfindlichen Stereozilienbündel erheblich sein kann.
Die Rasterionenleitwertmikroskopie (SICM) ist eine Version der Rastersondenmikroskopie, bei der eine Glaspipettensonde verwendet wird, die mit einer leitfähigen Lösung gefüllt ist23. SICM erkennt die Oberfläche, wenn sich die Pipette der Zelle nähert und der elektrische Strom durch die Pipette abnimmt. Da dies lange vor dem Berühren der Zelle geschieht, eignet sich das SICM ideal für die berührungslose Bildgebung lebender Zellen in physiologischer Lösung24. Die beste Auflösung von SICM liegt in der Größenordnung von einzelnen Nanometern, was die Auflösung einzelner Proteinkomplexe an der Plasmamembran einer lebenden Zelleermöglicht 25. Ähnlich wie andere Rastersondentechniken ist SICM jedoch in der Lage, nur relativ flache Oberflächen abzubilden. Wir haben diese Einschränkung überwunden, indem wir das Hopping-Probe-Ionenleitfähigkeitsmikroskop (HPICM)26erfunden haben, bei dem sich die Nanopipette an jedem Bildgebungspunkt der Probe nähert (Abbildung 1A). Mit HPICM konnten wir Stereozilienbündel in lebenden auditiven Haarzellen mit nanoskaliger Auflösung27 abbilden.
Ein weiterer grundlegender Vorteil dieser Technik ist, dass HPICM nicht nur ein bildgebendes Werkzeug ist. Im Gegensatz zu anderen Rastersondentechniken ist die HPICM/SICM-Sonde eine Elektrode, die in der Zellphysiologie für elektrische Aufzeichnungen und die lokale Abgabe verschiedener Reize weit verbreitet ist. Die Ionenkanalaktivität stört die HPICM-Bildgebung normalerweise nicht, da der Gesamtstrom durch die HPICM-Sonde um mehrere Größenordnungen größer ist als der extrazelluläre Strom, der von den größten Ionenkanälen erzeugt wird25. HPICM ermöglicht jedoch die präzise Positionierung der Nanopipette über einer interessierenden Struktur und die anschließende einkanalige Patch-Clamp-Aufzeichnung von dieser Struktur28. So erhielten wir die ersten Voraufnahmen der Einkanalaktivität an den Spitzen der äußeren Haarzelle Stereozilien29. Es ist erwähnenswert, dass selbst ein großer Strom durch die Nanopipette aufgrund des enormen elektrischen Shunts des extrazellulären Mediums keine signifikanten Änderungen des Potentials über die Plasmamembran erzeugen kann. Einzelne Ionenkanäle können jedoch mechanisch durch Flüssigkeitsfluss durch die Nanopipette30 oder chemisch durch lokale Anwendung eines Agonisten31aktiviert werden.
In HPICM wird das Bild erzeugt, wenn sich eine Nanopipette an einem Punkt sequentiell der Probe nähert, sich zurückzieht und sich dann in lateraler Richtung bewegt, um die Annäherung zu wiederholen (Abbildung 1A). Ein Patch-Clamp-Verstärker legt ständig Spannung an einen AgCl-Draht in der Pipette an (Abbildung 1B), um einen Strom von ~ 1 nA in der Badlösung zu erzeugen. Der Wert dieses Stroms, wenn die Pipette von der Oberfläche der Zelle entfernt ist, wird als Referenzstrom bestimmt (Iref, Abbildung 1C). Dann bewegt sich die Pipette in der Z-Achse, um sich der Probe zu nähern, bis der Strom um einen vom Benutzer vordefinierten Betrag (Sollwert) reduziert wird, normalerweise 0,2% -1% der I-Referenz (Abbildung 1C,obere Spur). Das System speichert dann in diesem Moment den Z-Wert als Höhe der Probe zusammen mit X- und Y-Koordinaten dieses Abbildungspunkts. Dann wird die Pipette von der Oberfläche weggezogen(Abbildung 1C,untere Spur) mit einer vom Benutzer definierten Geschwindigkeit, normalerweise 700-900 nm/ms. Nach dem Zurückziehen wird die Pipette (oder in unserem Fall die Probe - siehe Abbildung 1B) seitlich zum nächsten Bildgebungspunkt bewegt, ein neuer Referenzstromwert wird erhalten, und die Pipette nähert sich erneut der Probe und wiederholt den Vorgang. Die X-Y-Bewegung der Pipette wird in einem aufrechten Mikroskopaufbau bevorzugt, der typischerweise für Aufzeichnungen der Mechanotransduktionsströme der Haarzellen verwendet wird. In dieser Einstellung nähert sich die HPICM-Sonde den Haarzellbündeln nicht von oben, sondern in einem Winkelvon 32. Die beste Auflösung der HPICM-Bildgebung wird jedoch in einem inversen Mikroskopaufbau (Abbildung 1A,B) erreicht, bei dem die Bewegung der Probe in X-Y-Richtung von der Z-Bewegung der Nanopipette entkoppelt wird, wodurch potenzielle mechanische Artefakte eliminiert werden.
Mit HPICM erhielten wir topographische Bilder von inneren und äußeren Haarzellen-Stereozilienbündeln von Maus und Ratte und visualisierten sogar die Verbindungen zwischen den Stereozilien mit einem Durchmesser von etwa 5 nm26,27. Der Erfolg der Haarzellbündelbildgebung mit dieser Technik hängt von mehreren Faktoren ab. Erstens sollte das Rauschen (Varianz) des Nanopipettenstroms so gering wie möglich sein, um einen möglichst niedrigen Sollwert für die HPICM-Bildgebung zu ermöglichen. Ein niedriger Sollwert ermöglicht es der HPICM-Sonde, die Stereozillenoberfläche in einem größeren Abstand und in jedem Winkel zum Sondenansatz zu "erfassen" und überraschenderweise die X-Y-Auflösung der HPICM-Bildgebung zu verbessern (siehe Diskussion). Zweitens sollten die Vibrationen und Drifts im System auf weniger als 10 nm reduziert werden, da sie direkt zu den bildgebenden Artefakten beitragen. Obwohl die HPICM-Sonde und der Probentisch in der Z- und X-Y-Achse von den kalibrierten rückkopplungsgesteuerten Piezoaktuatoren bewegt werden, die eine Genauigkeit von einem Nanometer oder besser haben, bestimmt der Durchmesser der Nanopipettenspitze die Ausbreitung des Stroms (Erfassungsvolumen) und damit die Auflösung (Abbildung 1A). Daher ist es vor der Bildgebung lebender Haarzellen wichtig, die entsprechenden Pipetten zu ziehen, die gewünschte Auflösung mit Kalibrierproben zu erreichen und ein geringes Rauschen im Aufnahmesystem zu erreichen.
Seit mindestens ein paar Jahrzehnten ist die SICM-Technik nicht mehr kommerziell verfügbar und wurde nur von wenigen Labors auf der Welt mit dem führenden Labor von Prof. Korchev am Imperial College (UK) entwickelt. In jüngster Zeit sind mehrere SICM-Systeme kommerziell verfügbar geworden (siehe Materialtabelle),die alle auf den ursprünglichen HPICM-Prinzipien basieren. Die Abbildung von Stereozilienbündeln in den Haarzellen erfordert jedoch mehrere kundenspezifische Modifikationen, die in den geschlossenen "ready-to-go"-Systemen technisch anspruchsvoll (oder sogar unmöglich) sind. Daher ist eine gewisse Komponentenintegration erforderlich. Da der HPICM-Aufbau ein Patch-Clamp-Rig mit strengeren Vibrations- und Driftanforderungen und einer piezogetriebenen Bewegung der HPICM-Sonde und der Probe darstellt (Abbildung 1D), ist diese Integration für jeden Forscher, der sich mit Patch-Clamping auskennt, relativ einfach. Ein Wissenschaftler ohne richtigen Hintergrund würde jedoch definitiv zuerst eine Ausbildung in Elektrophysiologie benötigen. Trotz verbleibender Herausforderungen wie der Erhöhung der Bildgebungsgeschwindigkeit (siehe Diskussion)konnten wir Stereozilienbündel in lebenden Haarzellen mit nanoskaliger Auflösung abbilden, ohne sie zu beschädigen.
Dieses Papier stellt ein detailliertes Protokoll vor, um eine erfolgreiche HPICM-Bildgebung der lebenden auditiven Haarzellbündel in jungen postnatalen Ratten- oder Maus-Cochlea-Explantaten mit unserem benutzerdefinierten System durchzuführen. Die integrierten Komponenten sind in der Materialtabelle aufgeführt. In diesem Dokument werden auch häufige Probleme beschrieben, die auftreten können, und wie Sie diese beheben können.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Analog oscilloscope</td>
			<td>B&#38;K Precision</td>
			<td>2160C</td>
			<td>Analog oscilloscope for real-time monitoring of nanopipette current and Z-axis approach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM calibration standards</td>
			<td>TED PELLA Inc</td>
			<td>HS-100MG; HS-20MG</td>
			<td>These 100 and 20 nm calibration standards are used to test the performance of HPICM system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop vibration Isolator</td>
			<td>AMETEK/TMC</td>
			<td>Everstill K-400</td>
			<td>Active vibration isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>Borosilicate glass capillaries for the nanopipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>To be added to the bath solution to adjust osmolarity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>National Instruments Corporation</td>
			<td>PCI-6221</td>
			<td>Multi-channel input/output digitizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast analog Proportional-Integral-Derivative (PID) control for Z movement</td>
			<td>Standford Research Systems</td>
			<td>SIM900, SIM960, SIM980</td>
			<td>Instrumentation modules integrated in an external PID controller for Z movement. It requires a fast response that is usually not implemented in commercial piezo amplifiers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>AMETEK/TMC</td>
			<td>Type II</td>
			<td>Required to shield electromagnetic interference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td>Used as the dish for the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td>Extracellular (bath) solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrumentation amplifier</td>
			<td>Brownlee Precision</td>
			<td>Model 440</td>
			<td>Instrumentation amplifier provides required offsets, filtering, and secondary magnification or attenuation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-based micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2000/G</td>
			<td>Micropipette puller to fabricate the nanopipettes. Laser is needed for sharp quartz pipettes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lebovitz&#39;s L-15, without phenol red</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td>Extracellular (bath) solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>PatchStar</td>
			<td>Used for &#34;course&#34; positioning of the Z piezo actuator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td>Inverted optical microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td>The patch clamp amplifier measures the current through the nanopipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo amplifier (XY axes)</td>
			<td>Physik Instrumente (PI)</td>
			<td>E-500.00, E-505.00, E-509.C2A</td>
			<td>Amplification and PID control for XY piezo translation stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo amplifier (Z axis)</td>
			<td>Piezosystem jena</td>
			<td>ENT 400 &#38; 800</td>
			<td>Custom amplifier consisting of ENT 400 power supply and two ENT 800 amplifiers in parallel to achieve max current of 1.6 nA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Coverslips</td>
			<td>TED PELLA Inc</td>
			<td>26028</td>
			<td>Used in the fabrication of the chambers for the tissue&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SICM controller &#38; software*</td>
			<td>Ionscope, UK (ionscope.com)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom controller based on SBC6711 digital signal processing board from Innovative Integration Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer (Sylgard)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Used to attach the flexible glass fibers to the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon glue</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>734</td>
			<td>Used to glue the different parts of the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten rod</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>717500</td>
			<td>Used for holding the dental floss strands in the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY piezo nanopositioner</td>
			<td>Physik Instrumente (PI)</td>
			<td>P-733.2DD</td>
			<td>XY translation stage with capacitive sensors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z piezo nanopositioner</td>
			<td>Piezosystem jena</td>
			<td>RA 12/24 SG</td>
			<td>Ring piezoactuator with a strain gage sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">*Ionscope does not sell separate SICM controllers anymore. There are few other commercial systems:&#160; NX12-Bio and NX10 SICM,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Park Systems, Korea and SICM modules from ICAPPIC Limited, UK (icappic.com). All these systems are based on the original&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">HPICM principles. However, imaging stereocilia bundles in the hair cells requires several custom modifications that are technically&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">challenging (or even impossible) in the closed &#8220;ready-to-go&#8221; systems such as Ionscope or NX12-Bio/NX10. Currently, there is only one&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">modular system (ICAPPIC) that has the flexibility to suit any SICM/HPICM experiment but requires some component integration.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereocilia bundle imaging with nanoscale resolution in live mammalian auditory hair cells

Innenohr-Haarzellen detektieren schallinduzierte Verschiebungen und wandeln diese Reize in elektrische Signale in einem Haarbündel um, das aus Stereozilien besteht, die in reihen zunehmender Höhe angeordnet sind. Wenn Stereozilien abgelenkt werden, ziehen sie an winzigen (~ 5 nm Durchmesser) extrazellulären Spitzenverbindungen, die Stereozilien miteinander verbinden, die Kräfte zu den mechanosensitiven Transduktionskanälen transportieren. Obwohl die Mechanotransduktion in lebenden Haarzellen seit Jahrzehnten untersucht wird, können die funktionell wichtigen ultrastrukturellen Details der Mechanotransduktionsmaschinerie an den Spitzen der Stereozilien (wie z.B. Tip-Link-Dynamik oder transduktionsabhängiges Stereozilien-Remodeling) immer noch nur in toten Zellen mit Elektronenmikroskopie untersucht werden. Theoretisch haben Rastersondentechniken wie die Rasterkraftmikroskopie eine ausreichende Auflösung, um die Oberfläche von Stereozilien sichtbar zu machen. Unabhängig vom Bildgebungsmodus beschädigt jedoch selbst der geringste Kontakt der rasterkraftmikroskopischen Sonde mit dem Stereozilienbündel in der Regel das Bündel. Hier präsentieren wir ein detailliertes Protokoll für die Hopping-Probe-Ionenleitfähigkeitsmikroskopie (HPICM) Bildgebung von lebenden auditiven Nagetierhaarzellen. Diese berührungslose Scanning-Sondentechnik ermöglicht die Zeitraffer-Bildgebung der Oberfläche lebender Zellen mit einer komplexen Topographie, wie Haarzellen, mit einer Auflösung von nur einem Nanometer und ohne physischen Kontakt mit der Probe. Das HPICM verwendet einen elektrischen Strom, der durch die Glasnanopipette fließt, um die Zelloberfläche in unmittelbarer Nähe zur Pipette zu erfassen, während ein piezoelektrisches 3D-Positionierungssystem die Oberfläche abtastet und ihr Bild erzeugt. Mit HPICM waren wir in der Lage, Stereozilienbündel und die Verbindungen, die Stereozilien in lebenden auditiven Haarzellen miteinander verbinden, mehrere Stunden lang ohne merkliche Schäden abzubilden. Wir gehen davon aus, dass der Einsatz von HPICM eine direkte Erforschung ultrastruktureller Veränderungen in den Stereozilien lebender Haarzellen ermöglichen wird, um deren Funktion besser zu verstehen.

Das in diesem Artikel vorgestellte Protokoll kann verwendet werden, um lebende Zellen mit komplexer Topographie zu visualisieren. Nach diesen Schritten erhalten wir routinemäßig Bilder von lebenden auditiven Haarzellbündeln der Ratte (Abbildung 6B, D). Trotz der im Vergleich zu REM-Bildern niedrigeren X-Y-Auflösung können unsere HPICM-Bilder die verschiedenen Reihen von Stereozilien, die Form der Stereozilienspitzen und sogar die kleinen Glieder (~ 5 nm Durchmesser), di...

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Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells

Hier stellen wir ein Protokoll für die Hopping Probe Ion Conductance Microscopy (HPICM) vor, eine berührungslose Scanning-Sondentechnik, die die nanoskalige Abbildung von Stereozilienbündeln in lebenden auditiven Haarzellen ermöglicht.

Stereozilien-Bündelbildgebung mit nanoskaliger Auflösung in lebenden Säugetier-Hörhaarzellen

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia ...

Diese Praktische kann uns helfen, dynamische Veränderungen der Nanostrukturkomponenten der mechanischen elektrischen Transduktionsmaschinerie an der Oberfläche der Haarzellsterixzilienbündel zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Zeitraffer-Bildgebung der Oberfläche lebender Zellen mit komplexer Topographie bei einzelnen Nanometern Auflösung und ohne physischen Kontakt mit der Probe. Diese Technik kann auf fast jede lebende Zelle angewendet werden.Wir haben zuvor die Oberfläche von Lungenepithelzelllinien, die mit Viren, Muskelzellen, infiziert sind, in My Image Bacteria Soon abgeglichen. Testen Sie die Nanopipetten zu Beginn jeder Bildgebungssitzung. Nachdem Sie eine Nanopipette hergestellt haben, suchen Sie nach Blasen, entfernen Sie eventuell vorhandene Blasen und montieren Sie die Nanopipette auf dem Pipettenhalter des Hopping-Probe-Ionenleitfähigkeitsmikroskops.Bei vier Millilitern Badlösung in die Kammer und legen Sie die Kammer auf die HPICM-Stufe. Führen Sie die Masseelektrode in die Badlösung ein und stellen Sie sicher, dass die Spannung, die über den Patch-Clamp-Verstärker an die Pipette angelegt wird, Null ist. Nachdem Sie den Mikromanipulator in die vertikale Position gebracht haben, bewegen Sie die Pipette in Z, bis sie die Flüssigkeit berührt, und stellen Sie den Verstärkerversatz auf Null, bevor Sie plus 100 Millivolt hinzufügen, um den Pipettenstrom zu überprüfen.Verwenden Sie Silikonkleber, um den AFM-Kalibrierstandard an der Kammer zu befestigen und die Probe mit vier Millilitern HBSS zu bedecken. Verwenden Sie doppelseitiges Klebeband, um die Kammer an der X Y-Stufe des HPICM-Setups zu befestigen, und laden Sie wie gezeigt eine neue Nanopipette auf den Halter. Nachdem Sie den Widerstand und den Durchmesser der Nanopipette getestet haben, stellen Sie den Strom auf ein Nanoampere ein.Verwenden Sie einen groben Patch-Clamp-Manipulator, um die Nanopipette ungefähr über der Mitte des Kalibrierstandards zu positionieren und den Sollwert zu erhöhen, während Sie das Signal vom Sensor des Z-Piezoaktors auf einem Oszilloskop in Echtzeit überwachen. Nachdem Sie einen stabilen wiederholbaren Z-Ansatzzyklus festgelegt haben, verringern Sie den Sollwert auf den Wert knapp über dem Instabilitätspunkt und bewegen Sie die Pipette mit einer Geschwindigkeit von etwa fünf Mikrometern pro Sekunde nach unten, bis sie die Probe erreicht. Die untere Ebene des Echtzeit-Z-Positionierungssignals nimmt zu, was darauf hindeutet, dass die Nanopipette aufgrund der Erfassung der Probenoberfläche zurückgezogen wird.Aufgrund der ungleichmäßigen Montage auf dem AFM-Standard kann der höchste Punkt des Interessengebiets unbekannt sein. Stellen Sie daher die Amplitude des Pipettenrückzugs auf mindestens 200 bis 500 Nanometer ein. Achten Sie darauf, die obere Grenze der Z-Piezo-Aktorbewegung nicht zu überschreiten, und beginnen Sie mit der Bildgebung mit niedriger Auflösung.Sobald der höchste Punkt der Probe im Bildgebungsbereich identifiziert wurde, verringern Sie die Hop-Amplitude und ziehen Sie die Pipette um etwa 200 Mikrometer entlang der Z-Achse zurück, um eine unerwünschte Kollision mit der Probe zu vermeiden, bevor Sie sie an eine neue X Y-Position bringen. Wenn der Interessenbereich lokalisiert wurde, beginnen Sie mit der Bildgebung mit einer höheren Auflösung. Für die auditive Haarzellbildgebung befestigen Sie ein frisch isoliertes Corti-Organ entweder mit Zahnseide oder flexiblen Glaspipetten fest in einer Kammer.Verwenden Sie doppelseitiges Klebeband, um die Kammer fest an der X Y-Piezostufe zu befestigen, und laden Sie wie gezeigt eine neue Nanopipette auf den Halter. Nachdem Sie den Nanopipettenwiderstand überprüft haben, verwenden Sie den Patch-Clamp-Mikromanipulator, um die Nanopipette über der Haarzellregion zu positionieren, während Sie das Organ der Corti X-Pflanze in einem inversen Mikroskop beobachten. Zeichnen Sie den Echtzeitstrom und das Z-Positionierungssignal auf dem Oszilloskop auf, um zu überprüfen, ob das System mit einem Sollwert von 0,5% 6 oder niedriger stabil ist, und bestimmen Sie den optimalen Sollwert und nähern Sie sich der Probe wie gezeigt.Führen Sie eine Bildgebung der Probe mit niedriger Auflösung durch, wie unter Verwendung einer Hop-Amplitude von mindestens sechs bis acht Mikrometern demonstriert. Wenn die Nanopipette an einen neuen X-Y-Ort bewegt werden muss, ziehen Sie die Pipette um etwa 500 Nanometer ein, um eine Kollision mit hohen Merkmalen im Gewebe zu vermeiden, und wiederholen Sie die HPICM-Bildgebung mit niedriger Auflösung bis zu der Region von Interesse, in der sich die Haarzellen befinden. Stellen Sie dann die Region von Interesse mit einer höheren Auflösung in 15 Minuten oder weniger dar.Das HPICM-Protokoll kann verwendet werden, um alle lebenden Zellen mit einer komplexen Topographie zu visualisieren, wie z. B. lebende auditive Haarzellbündel von Ratten. Trotz einer niedrigeren X-Y-Auflösung im Vergleich zu Rasterelektronenmikroskopie-Bildern können HPICM-Bilder die verschiedenen Reihen von Stereozilien erfolgreich auflösen. Die Form der Stereozilienspitzen und sogar die kleinen fünf Nanometer großen Glieder, die die benachbarten Stereozilien verbinden.Aufgrund der berührungslosen Natur der HPICM-Bildgebung kann die kontinuierliche Zeitrafferbildgebung desselben Haarzellbündels für mehrere Stunden durchgeführt werden, ohne die Kohäsion des Bündels zu beeinträchtigen. Beachten Sie, dass das System bei einem sehr niedrigen Sollwert kleine Schwankungen im Strom als Begegnung mit der Zelloberfläche interpretieren kann, was zu einem Rauschen weißer Punkte im Bild führt. In ähnlicher Weise können große Hopamplituden die laterale Resonanz der Pipette erhöhen, was ebenfalls zur Erzeugung von verrauschten Pixeln führt.Im Gegensatz dazu, wenn die Hop-Amplitude zu klein oder der Sollwert zu hoch ist, kann die Nanopipette mit der Probe kollidieren, was zu bildgebenden Artefakten oder Haarbündelschäden führt. Das Wichtigste, woran Sie sich erinnern sollten, wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist, weniger als 15 Minuten pro Haarzellbündel zu verbringen, wenn Sie mit lebenden Zellen arbeiten. Nachdem man ein Bild des Haarbündels erhalten hat, könnte man versuchen, Einkanalaufnahmen von bestimmten Stellen auf der Oberfläche der Stereozilien zu erhalten, um Fragen zu den Eigenschaften des Mechanotransduktionskanals zu beantworten.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Live-Darstellung von PKC-Translokation in Sf9-Zellen und in Aplysia sensorischen Neuronen

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Zeitraffer-Live-Imaging von klonal verbundenen neuronalen Vorläuferzellen in der Entwicklung von Zebrafisch Vorderhirnneuronen

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-Cell-Imaging von Sinnesorgan Vorläuferzellen im Intact Drosophila Puppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Hochauflösende Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Mittelhirn

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Hochauflösende Live-Bildgebung von Zell-Verhalten in der Entwicklung von Neuroepithel

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch-Clamp-Aufnahmen im inneren Haarsinneszellen Isoliert von Zebrafisch

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Funktionelle Bildgebung Auditory Cortex bei erwachsenen Katzen mit Hochfeld-fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Super-Resolution Imaging neuronaler Dense-Core-Vesikel

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

Hohe Auflösung<em&gt; In-vivo-</em&gt; Manuelle Segmentierung Protokoll für Menschen Hippocampus Teilfelder Verwenden von 3T Kernspintomographie

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Optogenetische Stimulation des Hörnervs

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...