Name: stereocilia bundle imaging with nanoscale resolution in live mammalian auditory hair cells
Uploaded: 2021-01-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells at JoVE.com

אנו מודים לפרופ' יורי קורצ'וב (אימפריאל קולג', בריטניה) על התמיכה והייעוץ ארוכי הטווח לאורך כל שלבי הפרויקט. אנו מודים גם לד"ר פאבל נובאק ואנדרו שבצ'וק (אימפריאל קולג', בריטניה) וכן לאולג בלוב (מרכז המחקר הלאומי לאודיולוגיה, רוסיה) על עזרתם בפיתוח תוכנה. המחקר נתמך על ידי NIDCD/NIH (R01 DC008861 ו- R01 DC014658 ל- G.I.F.).

המחקר נערך בהתאם להמלצות במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות. כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) באוניברסיטת קנטאקי (פרוטוקול 00903M2005).
1. ייצור ובדיקה של הננו-פיפטים
<ol><li>צור תוכנית ב puller micropipette כ...

<ol>
	<li>Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+inner+hair+cell+mechanotransducer+channels+using+high-speed+calcium+imaging.">Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging.</a> Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).</li><li>Effertz, T., Becker, L., Peng, A. W., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositol-4,5-bisphosphate+regulates+auditory+hair-cell+mechanotransduction-channel+pore+properties+and+fast+adaptation.">Phosphoinositol-4,5-bisphosphate regulates auditory hair-cell mechanotransduction-channel pore properties and fast adaptation.</a> The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (48), 11632-11646 (2017).</li><li>Peng, A. W., Gnanasambandam, R., Sachs, F., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+independent+modulation+of+auditory+hair+cell+mechanotransduction+channel+open+probability+implicates+a+role+for+the+lipid+bilayer.">Adaptation independent modulation of auditory hair cell mechanotransduction channel open probability implicates a role for the lipid bilayer.</a> The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (10), 2945-2956 (2016).</li><li>Engstr&#246;m, H., Engstr&#246;m, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+hairs+on+cochlear+sensory+cells.">Structure of the hairs on cochlear sensory cells.</a> Hearing research. 1 (1), 49-66 (1978).</li><li>Conchello, J. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+microscopy.">Optical sectioning microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 920-931 (2005).</li><li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy.">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li><li>W&#228;ldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy.">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348 (2015).</li><li>Pickles, J. O., Comis, S. D., Osborne, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-links+between+stereocilia+in+the+guinea+pig+organ+of+Corti,+and+their+possible+relation+to+sensory+transduction.">Cross-links between stereocilia in the guinea pig organ of Corti, and their possible relation to sensory transduction.</a> Hearing Research. 15 (2), 103-112 (1984).</li><li>Furness, D. N., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-links+between+stereocilia+in+the+guinea+pig+cochlea.">Cross-links between stereocilia in the guinea pig cochlea.</a> Hearing Research. 18 (2), 177-188 (1985).</li><li>Jacobs, R. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+correlates+of+mechanoelectrical+transduction+in+hair+cells+of+the+bullfrog&#8217;s+internal+ear.">Ultrastructural correlates of mechanoelectrical transduction in hair cells of the bullfrog&#8217;s internal ear.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 547-561 (1990).</li><li>Goodyear, R. J., Marcotti, W., Kros, C. J., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+properties+of+stereociliary+link+types+in+hair+cells+of+the+mouse+cochlea.">Development and properties of stereociliary link types in hair cells of the mouse cochlea.</a> The Journal of Comparative Neurology. 485 (1), 75-85 (2005).</li><li>Kachar, B., Parakkal, M., Kurc, M., Zhao, Y., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+structure+of+hair-cell+tip+links.">High-resolution structure of hair-cell tip links.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 13336-13341 (2000).</li><li>V&#233;lez-Ortega, A. C., Freeman, M. J., Indzhykulian, A. A., Grossheim, J. M., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+current+is+essential+for+stability+of+the+transducing+stereocilia+in+mammalian+auditory+hair+cells.">Mechanotransduction current is essential for stability of the transducing stereocilia in mammalian auditory hair cells.</a> eLife. 6, 1-22 (2017).</li><li>Ivanchenko, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+scanning+electron+microscopy+of+anti-PKHD1L1+immuno-gold+labeled+mouse+hair+cell+stereocilia+bundles.">Serial scanning electron microscopy of anti-PKHD1L1 immuno-gold labeled mouse hair cell stereocilia bundles.</a> Scientific Data. 7 (1), 182 (2020).</li><li>Hadi, S., Alexander, A. J., V&#233;lez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-XVa+controls+both+staircase+architecture+and+diameter+gradation+of+stereocilia+rows+in+the+auditory+hair+cell+bundles.">Myosin-XVa controls both staircase architecture and diameter gradation of stereocilia rows in the auditory hair cell bundles.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology JARO. 21 (2), 121-135 (2020).</li><li>Metlagel, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryo-tomography+of+vestibular+hair-cell+stereocilia.">Electron cryo-tomography of vestibular hair-cell stereocilia.</a> Journal of Structural Biology. 206 (2), 149-155 (2019).</li><li>Langer, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+of+individual+stereocilia+of+living+cochlear+hair+cells+by+atomic+force+microscopy.">Mechanical stimulation of individual stereocilia of living cochlear hair cells by atomic force microscopy.</a> Ultramicroscopy. 82 (1-4), 269-278 (2000).</li><li>Dufr&#234;ne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+nanomicrobiology+using+atomic+force+microscopy.">Towards nanomicrobiology using atomic force microscopy.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (9), 674-680 (2008).</li><li>Putman, C. A., van der Werf, K. O., de Grooth, B. G., van Hulst, N. F., Greve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelasticity+of+living+cells+allows+high+resolution+imaging+by+tapping+mode+atomic+force+microscopy.">Viscoelasticity of living cells allows high resolution imaging by tapping mode atomic force microscopy.</a> Biophysical journal. 67 (4), 1749-1753 (1994).</li><li>Gavara, N., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncontact+microrheology+at+acoustic+frequencies+using+frequency-modulated+atomic+force+microscopy.">Noncontact microrheology at acoustic frequencies using frequency-modulated atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 7 (8), 650-654 (2010).</li><li>Cartagena-Rivera, A. X., Van Itallie, C. M., Anderson, J. M., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+surface+supracellular+mechanical+properties+in+polarized+epithelium+using+noninvasive+acoustic+force+spectroscopy.">Apical surface supracellular mechanical properties in polarized epithelium using noninvasive acoustic force spectroscopy.</a> Nature Communications. 8 (1), 1030 (2017).</li><li>Katsuno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRIOBP-5+sculpts+stereocilia+rootlets+and+stiffens+supporting+cells+enabling+hearing.">TRIOBP-5 sculpts stereocilia rootlets and stiffens supporting cells enabling hearing.</a> JCI Insight. 4 (12), (2019).</li><li>Hansma, P. K., Drake, B., Marti, O., Gould, S. A., Prater, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scanning+ion-conductance+microscope.">The scanning ion-conductance microscope.</a> Science. 243 (4891), 641-643 (1989).</li><li>Korchev, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+scanning+ion-conductance+microscope+for+imaging+of+living+cells.">Specialized scanning ion-conductance microscope for imaging of living cells.</a> Journal of Microscopy. 188 (Pt 1), 17-23 (1997).</li><li>Shevchuk, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+proteins+in+membranes+of+living+cells+by+high-resolution+scanning+ion+conductance+microscopy.">Imaging proteins in membranes of living cells by high-resolution scanning ion conductance microscopy.</a> Angewandte Chemie (International ed in English. 45 (14), 2212-2216 (2006).</li><li>Novak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+live-cell+imaging+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy.">Nanoscale live-cell imaging using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Nature Methods. 6 (4), 279-281 (2009).</li><li>V&#233;lez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+live+cochlear+stereocilia+at+a+nanoscale+resolution+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy.">Visualization of live cochlear stereocilia at a nanoscale resolution using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1427, 203-221 (2016).</li><li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+scanning+patch-clamp:+new+insights+into+cell+function.">High-resolution scanning patch-clamp: new insights into cell function.</a> FASEB Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (7), 748-750 (2002).</li><li>Frolenkov, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+recordings+from+the+apical+surface+of+outer+hair+cells+with+a+scanning+ion+conductance+probe.">Single-channel recordings from the apical surface of outer hair cells with a scanning ion conductance probe.</a> Association for Research in Otolaryngology. Abs. 444, (2004).</li><li>S&#225;nchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncontact+measurement+of+the+local+mechanical+properties+of+living+cells+using+pressure+applied+via+a+pipette.">Noncontact measurement of the local mechanical properties of living cells using pressure applied via a pipette.</a> Biophysical Journal. 95 (6), 3017-3027 (2008).</li><li>Korchev, Y. E., Negulyaev, Y. A., Edwards, C. R., Vodyanoy, I., Lab, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+localization+of+single+active+ion+channels+on+the+surface+of+a+living+cell.">Functional localization of single active ion channels on the surface of a living cell.</a> Nature Cell Biology. 2 (9), 616-619 (2000).</li><li>Shevchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angular+approach+scanning+ion+conductance+microscopy.">Angular approach scanning ion conductance microscopy.</a> Biophysical Journal. 110 (10), 2252-2265 (2016).</li><li>Furness, D. N., Katori, Y., Nirmal Kumar, B., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dimensions+and+structural+attachments+of+tip+links+in+mammalian+cochlear+hair+cells+and+the+effects+of+exposure+to+different+levels+of+extracellular+calcium.">The dimensions and structural attachments of tip links in mammalian cochlear hair cells and the effects of exposure to different levels of extracellular calcium.</a> Neuroscience. 154 (1), 10-21 (2008).</li></ol>

כדי להשיג תמונות HPICM מוצלחות, המשתמשים צריכים להקים מערכת רעש נמוכה ורטט נמוך ולייצר צינורות מתאימים. אנו ממליצים בחום להשתמש בתקני כיול AFM כדי לבדוק את יציבות המערכת לפני ניסיון לבצע הדמיה של תאים חיים. לאחר הרזולוציה של המערכת נבדקת, משתמשים יכולים לשקול הדמיה איבר קבוע של דגימות Corti כדי ?...

למרות העובדה כי חבילות סטריאוסיליה בתאי השיער השמיעתיים גדולות מספיק כדי להיות דמיינו על ידי מיקרוסקופיה אופטית ולהסיט בתאים חיים בניסוי מהדק תיקון, המרכיבים המבניים החיוניים של מכונות transduction כגון קישורי קצה ניתן לדמיין רק עם מיקרוסקופיית אלקטרונים בתאים מתים. בתאי השיער השמיעתי של היונקים, מכונות התמרה ממוקמות בקצוות התחתונים של קישורי הקצה, כלומר, בקצות סטריאציליה שורה קצרהיותר 1 ומוסדרת באופן מקומי באמצעות האיתות בקצות סטרירוצ'ליה2,3. עם זאת, הדמיה ללא תוויות של מבני פני השטח במיקום זה בתאי שיער חיים אינה אפשרית בשל הגדלים הקטנים של סטריאוטיפיליה.
ללולאה היונקים יש שני סוגים של תאים חושיים שמיעתיים: תאי שיער פנימיים וחיצניים. בתאי השיער הפנימיים, סטריוציליה ארוכה ועבה יותר בהשוואה לאלו בתאי השיער החיצוניים4. השורה הראשונה והשנייה של סטריאוטיפיליה יש קוטר של 300-500 ננומטר בתאי שיער פנימיים עכבר או חולדה. בשל עקיפה של אור, הרזולוציה המרבית בר השגה עם מיקרוסקופיה אופטית ללא תווית היא כ 200 ננומטר. לפיכך, הדמיה של סטריאוטיפיליה בודדת בתוך השורות הראשונה והשנייה של חבילת תא השיער הפנימית קלה יחסית עם מיקרוסקופיה אופטית. לעומת זאת, סטריאוטיפיליה שורה קצרה יותר בתאי השיער הפנימיים וכל הסטריאוטיליה של תאי השיער החיצוניים יש קוטרים סביב 100-200 ננומטר ולא ניתן לדמיין עם מיקרוסקופיה אופטית5. למרות ההתקדמות האחרונה בהדמיה ברזולוציית-על, מגבלה בסיסית זו נמשכת בכל הדמיה אופטית ללא תוויות. כל הטכניקות הנוכחיות הזמינות מסחרית סופר רזולוציה דורשות סוג כלשהו של מולקולות פלואורסצנטיות6, אשר מגביל את היישומים שלהם. בנוסף למגבלות בשל הצורך במולקולות ספציפיות מתויגות פלואורסצנטיות, הוכח כי חשיפה להקרנת אור אינטנסיבית גורמת לנזק תאי ועשויה להשפיע על תהליכים תאיים, המהווה חיסרון גדול בחקר תאים חיים7.
הידע הנוכחי שלנו על הפרטים האולטרה-מבניים של חבילות סטריאציליה של תאי שיער הושג בעיקר בטכניקות מיקרוסקופיה אלקטרוניות (EM) שונות, כגון סריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים (SEM), מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM), שבר בהקפאה EM, ולאחרונה עם טכניקות תלת-ממד כגון חתך סדרתי עם קרן יונים ממוקדת או טומוגרפיה קריו-EM8,9,10,11,12,13, 14,15,16. למרבה הצער, כל טכניקות EM אלה דורשות כימי או cryofixation של המדגם. בהתאם לסולם הזמן של התופעות, דרישה זו הופכת את המחקר של התהליכים הדינמיים בקצות סטריאוטיפיליה לבלתי אפשרי או מאוד אינטנסיבי בעבודה.
נעשו מאמצים מוגבלים לדמיין חבילות שיער של תאי שיער חיים עם מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM)17,18. מכיוון ש-AFM פועלת בפתרונות פיזיולוגיים, היא יכולה, בתיאוריה, לדמיין שינויים דינמיים בחבילות הסטריאוטיליה של תאי שיער חיים לאורך זמן. הבעיה נעוצה בעקרונות של AFM ברזולוציה גבוהה, המרמזת על מגע פיזי מסוים בין הבדיקה AFM לבין המדגם, אפילו במצב "הקשה" הכי פחות מזיק19. כאשר הגשושית AFM נתקלת בסטריאוטיניום, היא בדרך כלל מתרסקת עליו, ופוגעת במבנה של חבילת השיער. כתוצאה מכך, טכניקה זו אינה מתאימה לדמיין חיים, או אפילו קבוע, תאי שיער חבילות17,18. הבעיה עשויה להיות הקלה חלקית באמצעות בדיקה AFM בצורת כדור גדול המטיל רק כוחות הידרודינמיים על פני השטח של המדגם20. עם זאת, למרות בדיקה כזו מתאימה באופן אידיאלי כדי לבדוק תכונות מכניות של המדגם21, הוא מספק רק רזולוציה תת מיקרומטר בעת הדמיה האיבר של Corti22 ועדיין חל על המדגם כוח שעשוי להיות משמעותי עבור חבילות סטריאוטיפיליה רגיש מאוד.
סריקת מיקרוסקופיית מוליכת יונים (SICM) היא גרסה של מיקרוסקופיית בדיקה סריקה המשתמשת בגשושית פיפטה מזכוכית מלאה בתמיסה מוליכת23. SICM מזהה את פני השטח כאשר הפיפטה מתקרבת לתא והזרם החשמלי דרך הפיפטה פוחת. מאז זה קורה הרבה לפני נגיעה בתא, SICM מתאים באופן אידיאלי עבור הדמיה ללא מגע של תאים חיים בפתרון פיזיולוגי24. הרזולוציה הטובה ביותר של SICM היא בסדר של ננומטר יחיד, המאפשר פתרון מתחמי חלבון בודדים בקרום הפלזמה של תא חי25. עם זאת, בדומה לטכניקות בדיקה סריקה אחרות, SICM מסוגל לדמיין רק משטחים שטוחים יחסית. התגברנו על מגבלה זו על ידי המצאת מיקרוסקופ מוליכת יון בדיקה מקפץ (HPICM)26, שבו הננו-צינור מתקרב לדגימה בכל נקודת הדמיה(איור 1A). באמצעות HPICM, הצלחנו לדמיין חבילות סטריאוסיליה בתאי שיער שמיעתיים חיים ברזולוציה ננומטרית27.
יתרון בסיסי נוסף של טכניקה זו הוא כי HPICM הוא לא רק כלי הדמיה. בניגוד לטכניקות בדיקה סריקה אחרות, הבדיקה HPICM / SICM היא אלקטרודה הנמצאת בשימוש נרחב בפיזיולוגיה של תאים להקלטות חשמליות ואספקה מקומית של גירויים שונים. פעילות ערוץ יון אינה מפריעה בדרך כלל להדמיית HPICM, מכיוון שהזרם הכולל באמצעות הבדיקה HPICM הוא מספר סדרי גודל גדולים יותר מהזרם החוץ-תאי שנוצר על-ידי ערוצי היון הגדולים ביותר25. עם זאת, HPICM מאפשר מיקום מדויק של nanopipette מעל מבנה של עניין והקלטת מהדק תיקון בערוץ יחיד לאחר מכן ממבנה זה28. כך השגנו את ההקלטות הראשוניות הראשונות של פעילות ערוץ יחיד בקצות סטריוציליה של תא השיער החיצוני29. ראוי להזכיר כי אפילו זרם גדול דרך nanopipette לא יכול לייצר שינויים משמעותיים של הפוטנציאל על פני קרום הפלזמה בשל דלף חשמלי עצום של המדיום החוץ תאי. עם זאת, ערוצי יונים בודדים יכולים להיות מופעלים באופן מכני על ידי זרימת נוזל דרך nanopipette30 או כימית על ידי יישום מקומי של אגוניסט31.
ב-HPICM, התמונה נוצרת כאשר ננו-אפיפט ניגש ברצף לדגימה בשלב מסוים, נסוג ואז נע בכיוון רוחבי כדי לחזור על הגישה (איור 1A). מגבר מהדק תיקון מחיל כל הזמן מתח על חוט AgCl בפיפטה (איור 1B) כדי ליצור זרם של ~ 1 nA בתמיסת האמבטיה. הערך של זרם זה כאשר הפיפטה רחוקה מפני השטח של התא נקבע כזרם ייחוס(אניחוזר, איור 1C). לאחר מכן, הפיפטה נעה בציר Z כדי להתקרב לדגימה עד שהזרם יופחת בסכום שהוגדר מראש על-ידי המשתמש (setpoint), בדרך כלל 0.2%-1% מהנציג של I (איור 1C, מעקב עליון). לאחר מכן המערכת שומרת ערך Z ברגע זה כגובה המדגם, יחד עם קואורדינטות X ו- Y של נקודת הדמיה זו. לאחר מכן, הפיפטה נסוגה מפני השטח(איור 1C,מעקב תחתון) במהירות שהוגדרה על ידי המשתמש, בדרך כלל 700-900 ננומטר/ms. לאחר הנסיגה, הפיפטה (או, במקרה שלנו, המדגם - ראה איור 1B) מועבר לרוחב לנקודת ההדמיה הבאה, מתקבל ערך זרם ייחוס חדש, והפפטה שוב מתקרבת לדגימה, חוזרת על התהליך. תנועת X-Y של הפיפטה עדיפה במערך מיקרוסקופ זקוף המשמש בדרך כלל להקלטות של זרמי המכנוטרנסדוקציה של תאי השיער. בהגדרה זו, הבדיקה HPICM מתקרבת לחבילות תאי השיער לא מלמעלה אלא בזווית32. עם זאת, הרזולוציה הטובה ביותר של הדמיית HPICM מושגת במערך מיקרוסקופ הפוך (איור 1A,B),שבו התנועה של המדגם בכיווני X-Y היא דה-מצמיד מ Z-תנועה של nanopipette, ובכך ביטול חפצים מכניים פוטנציאליים.
באמצעות HPICM, השגנו תמונות טופוגרפיות של חבילות סטריאוטיפיליה פנימיות וחתריות של עכבר וחולדה, ואפילו דמיינו את הקשרים בין הסטריאוטיפיליה בקוטר של כ -5 ננומטר26,27. ההצלחה של הדמיית חבילת תאי שיער בטכניקה זו מסתמכת על מספר גורמים. ראשית, הרעש (השונות) של זרם הננו-צינור צריך להיות קטן ככל האפשר כדי לאפשר את נקודת הקבע הנמוכה ביותר האפשרית עבור הדמיית HPICM. נקודת קבע נמוכה מאפשרת לגשושית HPICM "לחוש" משטח סטריוציליה במרחק גדול יותר ובכל זווית לגישת הגשושית, ובאופן מפתיע, משפרת את רזולוציית X-Y של הדמיית HPICM (ראה דיון). שנית, יש להקטין את התנודות והסחף במערכת לפחות מ -10 ננומטר, שכן הם תורמים ישירות לחפצי ההדמיה. לבסוף, למרות שגשושית HPICM ושלב הדגימה מועברות בצירי Z ו- X-Y על ידי מפעילי פיזו מכוילים הנשלטים על ידי משוב שיש להם דיוק של ננומטר יחיד או טוב יותר, הקוטר של קצה הננופיט קובע את התפשטות הזרם (נפח חישה) ומכאן הרזולוציה (איור 1A). לכן, לפני הדמיית תאי שיער חיים, חשוב למשוך את פיפטות נאותה, להגיע לרזולוציה הרצויה עם דגימות כיול, ולהשיג רעש נמוך במערכת ההקלטה.
במשך כמה עשורים לפחות, טכניקת SICM לא הייתה זמינה מסחרית והיא מתפתחת על ידי מעבדות מעטות בלבד בעולם עם המעבדה המובילה של פרופ 'קורצ'ב במכללה הקיסרית (בריטניה). לאחרונה, מספר מערכות SICM הפכו לזמינות מסחרית (ראה טבלת חומרים), כולן מבוססות על עקרונות HPICM המקוריים. עם זאת, חבילות סטריאציליה הדמיה בתאי השיער דורשת מספר שינויים מותאמים אישית כי הם מאתגרים מבחינה טכנית (או אפילו בלתי אפשרי) במערכות סגורות "מוכן ללכת". לכן, יש צורך בשילוב רכיבים מסוימים. מכיוון שהגדרת HPICM מייצגת אסדת מהדק תיקון עם דרישות רטט וסחף מחמירות יותר ותנועה מונעת פיזו של גשושית HPICM והמדגם (איור 1D), שילוב זה קל יחסית לכל חוקר, הבקיא בהידוק תיקונים. עם זאת, מדען ללא רקע מתאים בהחלט צריך קצת הכשרה אלקטרופיזיולוגיה ראשונה. למרות האתגרים שנותרו כגון הגדלת מהירות ההדמיה (ראה דיון), הצלחנו לדמיין חבילות סטריאציליה בתאי שיער חיים ברזולוציה ננומטרית מבלי לפגוע בהם.
מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט לביצוע הדמיה מוצלחת של HPICM של חבילות תאי שיער שמיעתיים חיים בחולדה צעירה לאחר הולדות או בגולשי שבלול עכברים צעירים באמצעות המערכת המותאמת אישית שלנו. הרכיבים המשולבים מפורטים בטבלת החומרים. המאמר מתאר גם בעיות נפוצות שניתן להיתקל בהן וכיצד לפתור אותן.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Analog oscilloscope</td>
			<td>B&#38;K Precision</td>
			<td>2160C</td>
			<td>Analog oscilloscope for real-time monitoring of nanopipette current and Z-axis approach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM calibration standards</td>
			<td>TED PELLA Inc</td>
			<td>HS-100MG; HS-20MG</td>
			<td>These 100 and 20 nm calibration standards are used to test the performance of HPICM system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop vibration Isolator</td>
			<td>AMETEK/TMC</td>
			<td>Everstill K-400</td>
			<td>Active vibration isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>Borosilicate glass capillaries for the nanopipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>To be added to the bath solution to adjust osmolarity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>National Instruments Corporation</td>
			<td>PCI-6221</td>
			<td>Multi-channel input/output digitizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast analog Proportional-Integral-Derivative (PID) control for Z movement</td>
			<td>Standford Research Systems</td>
			<td>SIM900, SIM960, SIM980</td>
			<td>Instrumentation modules integrated in an external PID controller for Z movement. It requires a fast response that is usually not implemented in commercial piezo amplifiers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>AMETEK/TMC</td>
			<td>Type II</td>
			<td>Required to shield electromagnetic interference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td>Used as the dish for the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td>Extracellular (bath) solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrumentation amplifier</td>
			<td>Brownlee Precision</td>
			<td>Model 440</td>
			<td>Instrumentation amplifier provides required offsets, filtering, and secondary magnification or attenuation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-based micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2000/G</td>
			<td>Micropipette puller to fabricate the nanopipettes. Laser is needed for sharp quartz pipettes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lebovitz&#39;s L-15, without phenol red</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td>Extracellular (bath) solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>PatchStar</td>
			<td>Used for &#34;course&#34; positioning of the Z piezo actuator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td>Inverted optical microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td>The patch clamp amplifier measures the current through the nanopipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo amplifier (XY axes)</td>
			<td>Physik Instrumente (PI)</td>
			<td>E-500.00, E-505.00, E-509.C2A</td>
			<td>Amplification and PID control for XY piezo translation stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo amplifier (Z axis)</td>
			<td>Piezosystem jena</td>
			<td>ENT 400 &#38; 800</td>
			<td>Custom amplifier consisting of ENT 400 power supply and two ENT 800 amplifiers in parallel to achieve max current of 1.6 nA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Coverslips</td>
			<td>TED PELLA Inc</td>
			<td>26028</td>
			<td>Used in the fabrication of the chambers for the tissue&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SICM controller &#38; software*</td>
			<td>Ionscope, UK (ionscope.com)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom controller based on SBC6711 digital signal processing board from Innovative Integration Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer (Sylgard)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Used to attach the flexible glass fibers to the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon glue</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>734</td>
			<td>Used to glue the different parts of the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten rod</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>717500</td>
			<td>Used for holding the dental floss strands in the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY piezo nanopositioner</td>
			<td>Physik Instrumente (PI)</td>
			<td>P-733.2DD</td>
			<td>XY translation stage with capacitive sensors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z piezo nanopositioner</td>
			<td>Piezosystem jena</td>
			<td>RA 12/24 SG</td>
			<td>Ring piezoactuator with a strain gage sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">*Ionscope does not sell separate SICM controllers anymore. There are few other commercial systems:&#160; NX12-Bio and NX10 SICM,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Park Systems, Korea and SICM modules from ICAPPIC Limited, UK (icappic.com). All these systems are based on the original&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">HPICM principles. However, imaging stereocilia bundles in the hair cells requires several custom modifications that are technically&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">challenging (or even impossible) in the closed &#8220;ready-to-go&#8221; systems such as Ionscope or NX12-Bio/NX10. Currently, there is only one&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">modular system (ICAPPIC) that has the flexibility to suit any SICM/HPICM experiment but requires some component integration.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereocilia bundle imaging with nanoscale resolution in live mammalian auditory hair cells

תאי שיער באוזן הפנימית מזהים תזוזות המושרות בצליל ומעבירים גירויים אלה לאותות חשמליים בחבילת שיער המורכבת מסטריאוציליה המסודרת בשורות של גובה הולך וגדל. כאשר סטריאוטיפיליה מסויטה, הם מושכים על קצה חוץ-תאי זעיר (~ 5 ננומטר) קישורי סטריאוציליה מחוברים, אשר מעבירים כוחות לערוצי transduction mechanosensitive. למרות mechanotransduction נחקר בתאי שיער חיים במשך עשרות שנים, הפרטים האולטרה-מבניים החשובים מבחינה תפקודית של מכונות mechanotransduction בקצה סטריאוטיפיליה (כגון דינמיקה קישור קצה או שיפוץ סטריוציליה תלויות טרנסדוקציה) עדיין ניתן ללמוד רק בתאים מתים עם מיקרוסקופיה אלקטרונית. תיאורטית, לטכניקות סריקה של בדיקה, כגון מיקרוסקופיית כוח אטומי, יש מספיק רזולוציה כדי לדמיין את פני השטח של סטריאוטיפיליה. עם זאת, ללא תלות במצב הדמיה, אפילו המגע הקל ביותר של גשושית מיקרוסקופיה כוח אטומי עם חבילת סטריאוטיפיליה בדרך כלל פוגע בצרור. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור מיקרוסקופיית מוליכת יונים בדיקה מקפץ (HPICM) הדמיה של תאי שיער שמיעתי מכרסמים חיים. טכניקת בדיקה זו ללא מגע סריקה מאפשרת הדמיה של זמן לשגות של פני השטח של תאים חיים עם טופוגרפיה מורכבת, כמו תאי שיער, עם רזולוציה של ננומטר יחיד ומבלי ליצור מגע פיזי עם המדגם. HPICM משתמש בזרם חשמלי העובר דרך ננו-צינור הזכוכית כדי לזהות את פני התא בקרבתו לפיפטה, בעוד שמערכת פיזואלקטרית הממוקמת בתלת-ממד סורקת את פני השטח ומייצרת את תמונתו. עם HPICM, הצלחנו לדמיין חבילות סטריאוטיפיליה ואת הקישורים המחברים סטריוציליה בתאי שיער שמיעתיים חיים במשך מספר שעות ללא נזק מורגש. אנו צופים כי השימוש ב- HPICM יאפשר חקירה ישירה של שינויים אולטרה-מבניים בסטריאוטיפיליה של תאי שיער חיים להבנה טובה יותר של תפקודם.

הפרוטוקול המוצג במאמר זה יכול לשמש כדי לדמיין כל תאים חיים עם טופוגרפיה מורכבת. בעקבות צעדים אלה, אנו משיגים באופן שגרתי תמונות של חבילות תאי שיער שמיעתיים של חולדות חיות(איור 6B,D). למרות רזולוציית X-Y נמוכה יותר בהשוואה לתמונות SEM, תמונות HPICM שלנו יכולות לפתור בהצלחה...

Watch this Scientific Journal Video about Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells at JoVE.com

Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells

כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור מיקרוסקופיית מוליכת היונים של בדיקה מקפיצה (HPICM), טכניקת בדיקה סריקה ללא מגע המאפשרת הדמיה ננומטרית של חבילות סטריאציליה בתאי שיער שמיעתיים חיים.

הדמיית חבילת סטריאוסיליה ברזולוציה ננומטרית בתאי שיער שמיעתיים של יונקים חיים

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia ...

מעשי זה יכול לעזור לנו ללמוד שינויים דינמיים של הרכיבים המבניים ננו של מכונות טרנסדוקציה חשמלית מכנית על פני השטח של חבילות סטריאציליה תא השיער. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הדמיה לשגות זמן של פני השטח של תאים חיים עם טופוגרפיה מורכבת ברזולוציה ננומטר יחיד, ומבלי ליצור מגע פיזי עם המדגם. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת כמעט על כל תא חי.בעבר התאמנו את פני השטח של קווי תאי אפיתל ריאות נגועים בווירוסים, תאי שריר, בחיידקי התמונה שלי בקרוב. בדוק את הננו-אפיפטים בתחילת כל מפגש הדמיה. לאחר ייצור ננו-צינור, בדוק אם קיימות בועות, והרכיב את הננופיט על מחזיק המיקרוסקופ של יון הגשושית.בארבעה מיליליטר של פתרון אמבטיה לתא ולהניח את התא על בימת HPICM. הציגו את האלקטרודה הקרקעית לתמיסת האמבטיה וודאו שהמתח המופעל על הפיפטה דרך מגבר המהדק הוא אפס. לאחר הצבת המניפולטור המיקרו במיקום האנכי, הזז את הפיפטה ב- Z עד שהוא נוגע בנוזל והגדיר את מגבר היסט לאפס, לפני הוספת פלוס 100 מילבולט כדי לבדוק את זרם הפיפטה.השתמש בדבק סיליקון כדי לחבר את תקן הכיול AFM לתא ולכסות את המדגם בארבעה מיליליטר של HBSS. השתמש בסרט דו-צדדי כדי לאבטח את התא לשלב X Y של הגדרת HPICM, וטען ננו-צינור חדש על המחזיק כפי שהודגם. לאחר בדיקת התנגדות nanopipette וקוטר, להגדיר את הזרם למגבר ננו אחד.השתמש במניפולציה של מהדק תיקון גס כדי למקם את הננו-צינור בערך מעל מרכז תקן הכיול ולהגדיל את הנקודה שנקבעה תוך ניטור האות מהחיישן של מפעיל Z piezo על אוסצילוסקופ בזמן אמת. לאחר יצירת מחזור גישת Z יציבה שחוזרת על עצמה, להקטין את הנקודה להגדיר לערך רק מעל נקודת חוסר היציבות ולהזיז את pipette למטה במהירות של כחמישה מיקרון לשנייה, עד שהוא מגיע המדגם. הרמה התחתונה של אות מיקום Z בזמן אמת תגדל, מה שמצביע על כך שהננו-פיפט נסוג עקב חישת משטח המדגם.בשל הרכבה לא אחידה על תקן AFM, הנקודה הגבוהה ביותר של תחום העניין עשויה להיות לא ידועה. לכן, להגדיר את המשרעת של נסיגה pipette לפחות 200 עד 500 ננומטר. דואג לא לחרוג מהגבול העליון של תנועת מפעיל Z piezo, להתחיל הדמיה ברזולוציה נמוכה.לאחר שזוהתה הנקודה הגבוהה ביותר של המדגם באזור ההדמיה, הפחיתו את משרעת הדילוג וחזרו בה מהצינור כ-200 מיקרון לאורך ציר Z כדי למנוע התנגשות לא רצויה עם המדגם לפני העברתה למיקום X Y חדש. כאשר אזור העניין אותר, התחל הדמיה ברזולוציה גבוהה יותר. להדמיית תאי שיער שמיעתיים, אבטחו היטב איבר מבודד טרי של קורטי לתא באמצעות חוט דנטלי, או פיפטות זכוכית גמישות.השתמש בסרט דו-צדדי כדי לאבטח את התא היטב לשלב הפיזו X Y ולהעמיס ננו-צינור חדש על המחזיק כפי שהודגם. לאחר בדיקת עמידות nanopipette, להשתמש תיקון מהדק מיקרו מניפולטור כדי למקם את nanopipette מעל אזור תא השיער תוך התבוננות האיבר של צמח Corti X במיקרוסקופ הפוך. הקלט, אות המיקום הנוכחי בזמן אמת ו- Z באוסקילוסקופ כדי לבדוק אם המערכת יציבה עם נקודה מוגדרת של 0.5%6 או נמוכה יותר, ולקבוע את נקודת הסט האופטימלית ולגשת למדגם כפי שהודגם.בצע הדמיה ברזולוציה נמוכה של המדגם כפי שהודגם באמצעות משרעת הופ של לפחות שישה עד שמונה מיקרון. אם הננו-צינור צריך לעבור למיקום X Y חדש, בטל את הפיפטה כ-500 ננומטרים כדי למנוע התנגשות עם תכונות גבוהות בתוך הרקמה וחזור על הדמיית HPICM ברזולוציה נמוכה עד לאזור העניין שבו ממוקמים תאי השיער. לאחר מכן צלם את אזור העניין ברזולוציה גבוהה יותר ב- 15 דקות או פחות.ניתן להשתמש בפרוטוקול HPICM כדי לדמיין כל תא חי עם טופוגרפיה מורכבת, כגון חבילות תאי שיער שמיעתיים של חולדות חיות. למרות הדגמת רזולוציית X Y נמוכה יותר בהשוואה לסריקת תמונות מיקרוסקופיות אלקטרונים, תמונות HPICM יכולות לפתור בהצלחה את השורות השונות של סטריאוטיפיליה. הצורה של קצות סטריאוטיליה ואפילו חמשת ננומטר קטן קישורים המחברים את סטריאוטיפיליה הסמוכה.בהתחשב באופי ללא מגע של הדמיית HPICM, הדמיה רציפה של אותה חבילת תאי שיער יכולה להתבצע במשך מספר שעות מבלי לפגוע בלכידות החבילה. שים לב כי עם נקודת קבוצה נמוכה מאוד, המערכת עשויה לפרש תנודות קטנות בזרם כמפגש עם משטח התא, מה שמוביל לרעש נקודה לבנה בתמונה. באופן דומה, משרעת הופ גדולה עשויה להגביר את התהודה לרוחב של הפיפטה, וכתוצאה מכך גם ייצור של פיקסלים רועשים.לעומת זאת, אם משרעת הופ היא קטנה מדי, או נקודת הקבע גבוהה מדי, nanopipette עלול להתנגש עם המדגם וכתוצאה מכך חפצים הדמיה או נזק צרור שיער. הדבר החשוב ביותר לזכור בעת ניסיון הליך זה הוא לבלות פחות מ 15 דקות לכל חבילת תא שיער בעת עבודה עם תאים חיים. לאחר קבלת תמונה של חבילת השיער, ניתן לנסות להשיג הקלטות ערוץ יחיד ממיקומים ספציפיים על פני השטח של סטריאוטיפיליה כדי לענות על שאלות על תכונות ערוץ mechanotransduction.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Live-הדמיה של טרנסלוקציה של PKC Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושי

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

זמן לשגות הדמיה חיה של Related Clonally ובתאים עצבית של פיתוח דג הזברה forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

ברזולוציה גבוהה תהודה מגנטית פונקציונלית שיטות המוח התיכון האדם

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

ברזולוציה גבוהה הדמיה חיה של התנהגות התא ב Neuroepithelium פיתוח

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

הקלטות קלאמפ תיקון בתאי שיער באוזן פנימיים מבודדות מדג הזברה

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

הדמיה תפקודית של השמיעתי Cortex בחתולים בוגרים באמצעות גבוהה שדה fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

הדמיה ברזולוציה סופר של שלפוחית ​​צפופות ליבות עצבית

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

ברזולוציה גבוהה<em&gt; In vivo</em&gt; פרוטוקול פילוח ידני לאדם בהיפוקמפוס תת תחומים באמצעות הדמיה בתהודה מגנטית 3T

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

גירוי optogenetic של עצב השמיעה

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...