Name: stereocilia bundle imaging with nanoscale resolution in live mammalian auditory hair cells
Uploaded: 2021-01-21T14:00:00
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हम परियोजना के सभी चरणों में दीर्घकालिक समर्थन और सलाह के लिए प्रो यूरी कोरचेव (इंपीरियल कॉलेज, यूके) को धन्यवाद देते हैं। हम सॉफ्टवेयर विकास के साथ उनकी मदद के लिए डीआरएस पावेल नोवाक और एंड्रयू शेवचुक (इंपीरियल कॉलेज, यूके) के साथ-साथ ओलेग बेलोव (नेशनल रिसर्च सेंटर फॉर ऑडियोलॉजी, रूस) को भी धन्यवाद देते हैं । इस अध्ययन को एनआईडीसीडी/एनआईएच (R01 DC008861 और R01 DC014658 से G.I.F.) द्वारा समर्थित किया गया था ।

यह अध्ययन राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों की प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड में सिफारिशों के अनुसार किया गया था । सभी पशु प्रक्रियाओं को संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा क?...

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	<li>Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+inner+hair+cell+mechanotransducer+channels+using+high-speed+calcium+imaging.">Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging.</a> Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).</li><li>Effertz, T., Becker, L., Peng, A. W., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositol-4,5-bisphosphate+regulates+auditory+hair-cell+mechanotransduction-channel+pore+properties+and+fast+adaptation.">Phosphoinositol-4,5-bisphosphate regulates auditory hair-cell mechanotransduction-channel pore properties and fast adaptation.</a> The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (48), 11632-11646 (2017).</li><li>Peng, A. W., Gnanasambandam, R., Sachs, F., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+independent+modulation+of+auditory+hair+cell+mechanotransduction+channel+open+probability+implicates+a+role+for+the+lipid+bilayer.">Adaptation independent modulation of auditory hair cell mechanotransduction channel open probability implicates a role for the lipid bilayer.</a> The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (10), 2945-2956 (2016).</li><li>Engstr&#246;m, H., Engstr&#246;m, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+hairs+on+cochlear+sensory+cells.">Structure of the hairs on cochlear sensory cells.</a> Hearing research. 1 (1), 49-66 (1978).</li><li>Conchello, J. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+microscopy.">Optical sectioning microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 920-931 (2005).</li><li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy.">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li><li>W&#228;ldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy.">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348 (2015).</li><li>Pickles, J. O., Comis, S. D., Osborne, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-links+between+stereocilia+in+the+guinea+pig+organ+of+Corti,+and+their+possible+relation+to+sensory+transduction.">Cross-links between stereocilia in the guinea pig organ of Corti, and their possible relation to sensory transduction.</a> Hearing Research. 15 (2), 103-112 (1984).</li><li>Furness, D. N., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-links+between+stereocilia+in+the+guinea+pig+cochlea.">Cross-links between stereocilia in the guinea pig cochlea.</a> Hearing Research. 18 (2), 177-188 (1985).</li><li>Jacobs, R. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+correlates+of+mechanoelectrical+transduction+in+hair+cells+of+the+bullfrog&#8217;s+internal+ear.">Ultrastructural correlates of mechanoelectrical transduction in hair cells of the bullfrog&#8217;s internal ear.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 547-561 (1990).</li><li>Goodyear, R. J., Marcotti, W., Kros, C. J., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+properties+of+stereociliary+link+types+in+hair+cells+of+the+mouse+cochlea.">Development and properties of stereociliary link types in hair cells of the mouse cochlea.</a> The Journal of Comparative Neurology. 485 (1), 75-85 (2005).</li><li>Kachar, B., Parakkal, M., Kurc, M., Zhao, Y., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+structure+of+hair-cell+tip+links.">High-resolution structure of hair-cell tip links.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 13336-13341 (2000).</li><li>V&#233;lez-Ortega, A. C., Freeman, M. J., Indzhykulian, A. A., Grossheim, J. M., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+current+is+essential+for+stability+of+the+transducing+stereocilia+in+mammalian+auditory+hair+cells.">Mechanotransduction current is essential for stability of the transducing stereocilia in mammalian auditory hair cells.</a> eLife. 6, 1-22 (2017).</li><li>Ivanchenko, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+scanning+electron+microscopy+of+anti-PKHD1L1+immuno-gold+labeled+mouse+hair+cell+stereocilia+bundles.">Serial scanning electron microscopy of anti-PKHD1L1 immuno-gold labeled mouse hair cell stereocilia bundles.</a> Scientific Data. 7 (1), 182 (2020).</li><li>Hadi, S., Alexander, A. J., V&#233;lez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-XVa+controls+both+staircase+architecture+and+diameter+gradation+of+stereocilia+rows+in+the+auditory+hair+cell+bundles.">Myosin-XVa controls both staircase architecture and diameter gradation of stereocilia rows in the auditory hair cell bundles.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology JARO. 21 (2), 121-135 (2020).</li><li>Metlagel, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryo-tomography+of+vestibular+hair-cell+stereocilia.">Electron cryo-tomography of vestibular hair-cell stereocilia.</a> Journal of Structural Biology. 206 (2), 149-155 (2019).</li><li>Langer, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+of+individual+stereocilia+of+living+cochlear+hair+cells+by+atomic+force+microscopy.">Mechanical stimulation of individual stereocilia of living cochlear hair cells by atomic force microscopy.</a> Ultramicroscopy. 82 (1-4), 269-278 (2000).</li><li>Dufr&#234;ne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+nanomicrobiology+using+atomic+force+microscopy.">Towards nanomicrobiology using atomic force microscopy.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (9), 674-680 (2008).</li><li>Putman, C. A., van der Werf, K. O., de Grooth, B. G., van Hulst, N. F., Greve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelasticity+of+living+cells+allows+high+resolution+imaging+by+tapping+mode+atomic+force+microscopy.">Viscoelasticity of living cells allows high resolution imaging by tapping mode atomic force microscopy.</a> Biophysical journal. 67 (4), 1749-1753 (1994).</li><li>Gavara, N., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncontact+microrheology+at+acoustic+frequencies+using+frequency-modulated+atomic+force+microscopy.">Noncontact microrheology at acoustic frequencies using frequency-modulated atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 7 (8), 650-654 (2010).</li><li>Cartagena-Rivera, A. X., Van Itallie, C. M., Anderson, J. M., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+surface+supracellular+mechanical+properties+in+polarized+epithelium+using+noninvasive+acoustic+force+spectroscopy.">Apical surface supracellular mechanical properties in polarized epithelium using noninvasive acoustic force spectroscopy.</a> Nature Communications. 8 (1), 1030 (2017).</li><li>Katsuno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRIOBP-5+sculpts+stereocilia+rootlets+and+stiffens+supporting+cells+enabling+hearing.">TRIOBP-5 sculpts stereocilia rootlets and stiffens supporting cells enabling hearing.</a> JCI Insight. 4 (12), (2019).</li><li>Hansma, P. K., Drake, B., Marti, O., Gould, S. A., Prater, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scanning+ion-conductance+microscope.">The scanning ion-conductance microscope.</a> Science. 243 (4891), 641-643 (1989).</li><li>Korchev, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+scanning+ion-conductance+microscope+for+imaging+of+living+cells.">Specialized scanning ion-conductance microscope for imaging of living cells.</a> Journal of Microscopy. 188 (Pt 1), 17-23 (1997).</li><li>Shevchuk, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+proteins+in+membranes+of+living+cells+by+high-resolution+scanning+ion+conductance+microscopy.">Imaging proteins in membranes of living cells by high-resolution scanning ion conductance microscopy.</a> Angewandte Chemie (International ed in English. 45 (14), 2212-2216 (2006).</li><li>Novak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+live-cell+imaging+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy.">Nanoscale live-cell imaging using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Nature Methods. 6 (4), 279-281 (2009).</li><li>V&#233;lez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+live+cochlear+stereocilia+at+a+nanoscale+resolution+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy.">Visualization of live cochlear stereocilia at a nanoscale resolution using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1427, 203-221 (2016).</li><li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+scanning+patch-clamp:+new+insights+into+cell+function.">High-resolution scanning patch-clamp: new insights into cell function.</a> FASEB Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (7), 748-750 (2002).</li><li>Frolenkov, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+recordings+from+the+apical+surface+of+outer+hair+cells+with+a+scanning+ion+conductance+probe.">Single-channel recordings from the apical surface of outer hair cells with a scanning ion conductance probe.</a> Association for Research in Otolaryngology. Abs. 444, (2004).</li><li>S&#225;nchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncontact+measurement+of+the+local+mechanical+properties+of+living+cells+using+pressure+applied+via+a+pipette.">Noncontact measurement of the local mechanical properties of living cells using pressure applied via a pipette.</a> Biophysical Journal. 95 (6), 3017-3027 (2008).</li><li>Korchev, Y. E., Negulyaev, Y. A., Edwards, C. R., Vodyanoy, I., Lab, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+localization+of+single+active+ion+channels+on+the+surface+of+a+living+cell.">Functional localization of single active ion channels on the surface of a living cell.</a> Nature Cell Biology. 2 (9), 616-619 (2000).</li><li>Shevchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angular+approach+scanning+ion+conductance+microscopy.">Angular approach scanning ion conductance microscopy.</a> Biophysical Journal. 110 (10), 2252-2265 (2016).</li><li>Furness, D. N., Katori, Y., Nirmal Kumar, B., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dimensions+and+structural+attachments+of+tip+links+in+mammalian+cochlear+hair+cells+and+the+effects+of+exposure+to+different+levels+of+extracellular+calcium.">The dimensions and structural attachments of tip links in mammalian cochlear hair cells and the effects of exposure to different levels of extracellular calcium.</a> Neuroscience. 154 (1), 10-21 (2008).</li></ol>

सफल एचपीआईसीएम छवियों को प्राप्त करने के लिए, उपयोगकर्ताओं को कम शोर और कम कंपन प्रणाली स्थापित करने और उपयुक्त पिपेट का निर्माण करने की आवश्यकता है। हम दृढ़ता से किसी भी लाइव सेल इमेजिंग करने के प्रय?...

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Analog oscilloscope</td>
			<td>B&#38;K Precision</td>
			<td>2160C</td>
			<td>Analog oscilloscope for real-time monitoring of nanopipette current and Z-axis approach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM calibration standards</td>
			<td>TED PELLA Inc</td>
			<td>HS-100MG; HS-20MG</td>
			<td>These 100 and 20 nm calibration standards are used to test the performance of HPICM system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop vibration Isolator</td>
			<td>AMETEK/TMC</td>
			<td>Everstill K-400</td>
			<td>Active vibration isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>Borosilicate glass capillaries for the nanopipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>To be added to the bath solution to adjust osmolarity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>National Instruments Corporation</td>
			<td>PCI-6221</td>
			<td>Multi-channel input/output digitizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast analog Proportional-Integral-Derivative (PID) control for Z movement</td>
			<td>Standford Research Systems</td>
			<td>SIM900, SIM960, SIM980</td>
			<td>Instrumentation modules integrated in an external PID controller for Z movement. It requires a fast response that is usually not implemented in commercial piezo amplifiers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>AMETEK/TMC</td>
			<td>Type II</td>
			<td>Required to shield electromagnetic interference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td>Used as the dish for the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td>Extracellular (bath) solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrumentation amplifier</td>
			<td>Brownlee Precision</td>
			<td>Model 440</td>
			<td>Instrumentation amplifier provides required offsets, filtering, and secondary magnification or attenuation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-based micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2000/G</td>
			<td>Micropipette puller to fabricate the nanopipettes. Laser is needed for sharp quartz pipettes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lebovitz&#39;s L-15, without phenol red</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td>Extracellular (bath) solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>PatchStar</td>
			<td>Used for &#34;course&#34; positioning of the Z piezo actuator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td>Inverted optical microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td>The patch clamp amplifier measures the current through the nanopipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo amplifier (XY axes)</td>
			<td>Physik Instrumente (PI)</td>
			<td>E-500.00, E-505.00, E-509.C2A</td>
			<td>Amplification and PID control for XY piezo translation stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo amplifier (Z axis)</td>
			<td>Piezosystem jena</td>
			<td>ENT 400 &#38; 800</td>
			<td>Custom amplifier consisting of ENT 400 power supply and two ENT 800 amplifiers in parallel to achieve max current of 1.6 nA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Coverslips</td>
			<td>TED PELLA Inc</td>
			<td>26028</td>
			<td>Used in the fabrication of the chambers for the tissue&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SICM controller &#38; software*</td>
			<td>Ionscope, UK (ionscope.com)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom controller based on SBC6711 digital signal processing board from Innovative Integration Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer (Sylgard)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Used to attach the flexible glass fibers to the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon glue</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>734</td>
			<td>Used to glue the different parts of the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten rod</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>717500</td>
			<td>Used for holding the dental floss strands in the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY piezo nanopositioner</td>
			<td>Physik Instrumente (PI)</td>
			<td>P-733.2DD</td>
			<td>XY translation stage with capacitive sensors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z piezo nanopositioner</td>
			<td>Piezosystem jena</td>
			<td>RA 12/24 SG</td>
			<td>Ring piezoactuator with a strain gage sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">*Ionscope does not sell separate SICM controllers anymore. There are few other commercial systems:&#160; NX12-Bio and NX10 SICM,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Park Systems, Korea and SICM modules from ICAPPIC Limited, UK (icappic.com). All these systems are based on the original&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">HPICM principles. However, imaging stereocilia bundles in the hair cells requires several custom modifications that are technically&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">challenging (or even impossible) in the closed &#8220;ready-to-go&#8221; systems such as Ionscope or NX12-Bio/NX10. Currently, there is only one&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">modular system (ICAPPIC) that has the flexibility to suit any SICM/HPICM experiment but requires some component integration.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereocilia bundle imaging with nanoscale resolution in live mammalian auditory hair cells

इनर इयर हेयर सेल्स ध्वनि-प्रेरित विस्थापन का पता लगाते हैं और इन उत्तेजनाओं को बालों के बंडल में विद्युत संकेतों में स्थानांतरित करते हैं जिसमें स्टीरियोसिलिया होता है जो बढ़ती ऊंचाई की पंक्तियों में व्यवस्थित होते हैं। जब स्टीरियोसिलिया को विक्षेपित किया जाता है, तो वे छोटे (~ 5 एनएम व्यास में) एक्स्ट्रासेलुलर टिप लिंक पर स्टरेसिलिया को जोड़ने के लिए मिलते हैं, जो मशीनोसेटिव ट्रांसडक्शन चैनलों को बलों को व्यक्त करते हैं। यद्यपि दशकों से जीवित बाल कोशिकाओं में मेकानोट्रांसडक्शन का अध्ययन किया गया है, लेकिन स्टीरियोसिलिया (जैसे टिप लिंक गतिशीलता या ट्रांसडक्शन-निर्भर स्टीरियोसिलिया रीमॉडलिंग) के सुझावों पर मेकानोट्रांसडक्शन मशीनरी के कार्यात्मक रूप से महत्वपूर्ण अल्ट्रास्ट्रक्चरल विवरण का अध्ययन अभी भी केवल इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ मृत कोशिकाओं में किया जा सकता है। सैद्धांतिक रूप से, स्कैनिंग जांच तकनीकों, जैसे परमाणु बल माइक्रोस्कोपी, स्टीरियोसिलिया की सतह की कल्पना करने के लिए पर्याप्त संकल्प है । हालांकि, इमेजिंग मोड से स्वतंत्र, यहां तक कि स्टीरियोसिलिया बंडल के साथ परमाणु बल माइक्रोस्कोपी जांच का जरा सा संपर्क आमतौर पर बंडल को नुकसान पहुंचाता है। यहां हम लाइव कृंतक श्रवण बाल कोशिकाओं की हॉपिंग प्रोब आयन कंडक्शन माइक्रोस्कोपी (एचपीआईसीएम) इमेजिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह गैर-संपर्क स्कैनिंग जांच तकनीक एक जटिल स्थलाकृति के साथ जीवित कोशिकाओं की सतह की समय चूक इमेजिंग की अनुमति देती है, जैसे बाल कोशिकाएं, एकल नैनोमीटर संकल्प के साथ और नमूने के साथ शारीरिक संपर्क बनाए बिना। HPICM पिपेट के करीब आसपास सेल की सतह का पता लगाने के लिए ग्लास नैनोपिपेट से गुजरने वाले विद्युत प्रवाह का उपयोग करता है, जबकि एक 3डी-पोजिशनिंग पीजोइलेक्ट्रिक सिस्टम सतह को स्कैन करता है और इसकी छवि उत्पन्न करता है। HPICM के साथ, हम स्टीरियोसिलिया बंडलों और लिंक को ध्यान देने योग्य क्षति के बिना कई घंटों के लिए लाइव श्रवण बाल कोशिकाओं में स्टीरियोसिलिया को जोड़ने के लिए छवि करने में सक्षम थे। हम आशा करते हैं कि एचपीआईसीएम का उपयोग उनके कार्य की बेहतर समझ के लिए जीवित बाल कोशिकाओं के स्टीरियोसिलिया में अल्ट्रास्ट्रक्चरल परिवर्तनों की सीधी खोज की अनुमति देगा।

इस पेपर में प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग जटिल स्थलाकृति के साथ किसी भी जीवित कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है। इन चरणों के बाद, हम नियमित रूप से लाइव चूहा श्रवण हेयर सेल बंडलों(च?...

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Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells

यहां हम Hopping प्रोब आयन कंडक्टेंस माइक्रोस्कोपी (HPICM), एक गैर संपर्क स्कैनिंग जांच तकनीक है कि लाइव श्रवण बाल कोशिकाओं में स्टीरियोसिलिया बंडलों के नैनोस्केल इमेजिंग की अनुमति देता है के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं ।

लाइव स्तनधारी श्रवण बाल कोशिकाओं में नैनोस्केल संकल्प के साथ स्टीरियोसिलिया बंडल इमेजिंग

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia ...

यह व्यावहारिक हमें बाल सेल स्टीरियोसिलिया बंडलों की सतह पर यांत्रिक विद्युत ट्रांसडक्शन मशीनरी के नैनो संरचनात्मक घटकों के गतिशील परिवर्तनों का अध्ययन करने में मदद कर सकता है। इस तकनीक का मुख्य लाभ एकल नैनोमीटर रिज़ॉल्यूशन पर जटिल स्थलाकृति के साथ जीवित कोशिकाओं की सतह का समय-अंतराल इमेजिंग है, और नमूने के साथ शारीरिक संपर्क किए बिना। इस तकनीक को लगभग किसी भी जीवित सेल पर लागू किया जा सकता है।हमने पहले मेरी छवि बैक्टीरिया जल्द ही वायरस, मांसपेशियों की कोशिकाओं से संक्रमित फेफड़ों के उपकला सेल लाइनों की सतह का मिलान किया था। प्रत्येक इमेजिंग सत्र की शुरुआत में नैनोपिपेट्स का परीक्षण करें। एक नैनोपिपेट बनाने के बाद, बुलबुले के लिए जाँच करें, यदि मौजूद हैं तो किसी भी बुलबुले को हटा दें, और होपिंग जांच आयन चालकता माइक्रोस्कोप पिपेट धारक पर नैनोपिपेट को माउंट करें।कक्ष के लिए स्नान समाधान के चार milliliters पर और HPICM चरण पर कक्ष जगह. स्नान समाधान के लिए जमीन इलेक्ट्रोड का परिचय दें और सुनिश्चित करें कि पैच क्लैंप एम्पलीफायर के माध्यम से पिपेट पर लागू किया जा रहा वोल्टेज शून्य है। ऊर्ध्वाधर स्थिति में माइक्रो मैनिपुलेटर रखने के बाद, पिपेट को जेड में तब तक ले जाएं जब तक कि यह तरल को नहीं छूता और एम्पलीफायर ऑफसेट को शून्य पर सेट करता है, पिपेट वर्तमान की जांच करने के लिए प्लस 100 मिलीवोल्ट जोड़ने से पहले।कक्ष के लिए AFM अंशांकन मानक संलग्न करने के लिए सिलिकॉन गोंद का उपयोग करें और HBSS के चार milliliters के साथ नमूने को कवर। HPICM सेटअप के X Y चरण के लिए कक्ष को सुरक्षित करने के लिए डबल-साइडेड टेप का उपयोग करें, और प्रदर्शित के रूप में धारक पर एक नया नैनोपिपेट लोड करें। नैनोपिपेट प्रतिरोध और व्यास का परीक्षण करने के बाद, वर्तमान को एक नैनो amp पर सेट करें।अंशांकन मानक के केंद्र के ऊपर नैनोपिपेट को लगभग ऊपर रखने के लिए एक मोटे पैच क्लैंप मैनिपुलेटर का उपयोग करें और वास्तविक समय में एक ऑसिलोस्कोप पर जेड पीजो एक्ट्यूएटर के सेंसर से सिग्नल की निगरानी करते हुए सेट बिंदु को बढ़ाएं। एक स्थिर दोहराने योग्य जेड दृष्टिकोण चक्र स्थापित करने के बाद, अस्थिरता के बिंदु के ठीक ऊपर मूल्य के लिए सेट बिंदु को कम करें और पिपेट को लगभग पांच माइक्रोन प्रति सेकंड की गति से नीचे ले जाएं, जब तक कि यह नमूने तक नहीं पहुंच जाता। वास्तविक समय जेड पोजिशनिंग सिग्नल का निचला स्तर बढ़ जाएगा, यह दर्शाता है कि नमूना सतह को सेंस करने के कारण नैनोपिपेट को वापस ले लिया गया है।एएफएम मानक पर असमान बढ़ते के कारण, ब्याज के क्षेत्र का उच्चतम बिंदु अज्ञात हो सकता है। इसलिए, पिपेट रिट्रेक्शन के आयाम को कम से कम 200 से 500 नैनोमीटर पर सेट करें। ध्यान रखना जेड piezo actuator आंदोलन की ऊपरी सीमा से अधिक नहीं है, कम संकल्प पर इमेजिंग शुरू करते हैं.एक बार इमेजिंग क्षेत्र में नमूने के उच्चतम बिंदु की पहचान हो जाने के बाद, हॉप आयाम को कम करें और जेड अक्ष के साथ लगभग 200 माइक्रोन पिपेट को वापस ले लें ताकि इसे एक नए एक्स वाई स्थान पर ले जाने से पहले नमूने के साथ किसी भी अवांछित टकराव को रोका जा सके। जब ब्याज का क्षेत्र स्थित हो गया है, तो उच्च रिज़ॉल्यूशन पर इमेजिंग शुरू करें। श्रवण बाल सेल इमेजिंग के लिए, दृढ़ता से या तो दंत फ्लॉस, या लचीले ग्लास पिपेट्स का उपयोग करके एक कक्ष में कोर्टी के एक ताजा अलग अंग को सुरक्षित करें।X Y piezo चरण के लिए कक्ष को दृढ़ता से सुरक्षित करने के लिए डबल-साइडेड टेप का उपयोग करें और प्रदर्शित के रूप में धारक पर एक नया नैनोपिपेट लोड करें। नैनोपिपेट प्रतिरोध की जांच करने के बाद, एक उल्टे माइक्रोस्कोप में कोर्टी एक्स संयंत्र के अंग को देखते हुए बालों की कोशिका क्षेत्र पर नैनोपिपेट की स्थिति के लिए पैच क्लैंप माइक्रो मैनिपुलेटर का उपयोग करें। रिकॉर्ड, वास्तविक समय वर्तमान और Z स्थिति संकेत oscilloscope पर जांच करने के लिए कि क्या सिस्टम 0.5% 6 या कम के एक सेट बिंदु के साथ स्थिर है, और इष्टतम सेट बिंदु निर्धारित करें और नमूना के रूप में प्रदर्शन के रूप में दृष्टिकोण.नमूने के कम रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग का प्रदर्शन करें जैसा कि कम से कम छह से आठ माइक्रोन के हॉप आयाम का उपयोग करके प्रदर्शित किया गया है। यदि नैनोपिपेट को एक नए एक्स वाई स्थान पर ले जाने की आवश्यकता है, तो ऊतक के भीतर किसी भी लंबी विशेषताओं के साथ टकराव से बचने के लिए लगभग 500 नैनोमीटर पिपेट को वापस ले लें और कम रिज़ॉल्यूशन HPICM इमेजिंग को तब तक दोहराएं जब तक कि ब्याज का क्षेत्र न हो जहां बाल कोशिकाएं स्थित हैं। फिर 15 मिनट या उससे कम समय में उच्च रिज़ॉल्यूशन पर ब्याज के क्षेत्र की छवि बनाएं।HPICM प्रोटोकॉल का उपयोग एक जटिल स्थलाकृति के साथ किसी भी जीवित कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि लाइव चूहे श्रवण बाल सेल बंडल। स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों की तुलना में कम एक्स वाई रिज़ॉल्यूशन का प्रदर्शन करने के बावजूद, HPICM छवियां स्टीरियोसिलिया की विभिन्न पंक्तियों को सफलतापूर्वक हल कर सकती हैं। स्टीरियोसिलिया युक्तियों का आकार और यहां तक कि आसन्न स्टीरियोसिलिया को जोड़ने वाले छोटे पांच नैनोमीटर लिंक भी।HPICM इमेजिंग की गैर-संपर्क प्रकृति को देखते हुए, एक ही बाल सेल बंडल के निरंतर समय-अंतराल इमेजिंग को बंडल एकजुटता को नुकसान पहुंचाए बिना कई घंटों तक प्रदर्शन किया जा सकता है। ध्यान दें कि बहुत कम सेट बिंदु के साथ, सिस्टम वर्तमान में छोटे उतार-चढ़ाव की व्याख्या सेल सतह का सामना करने के रूप में कर सकता है, जिससे छवि में सफेद डॉट शोर होता है। इसी तरह, बड़े हॉप आयाम पिपेट के पार्श्व अनुनाद को बढ़ा सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप शोर पिक्सेल का उत्पादन भी होता है।इसके विपरीत, यदि हॉप आयाम बहुत छोटा है, या सेटपॉइंट बहुत अधिक है, तो नैनोपिपेट इमेजिंग कलाकृतियों या बाल बंडल क्षति के परिणामस्वरूप नमूने से टकरा सकता है। इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय याद रखने के लिए सबसे महत्वपूर्ण बात यह है कि जीवित कोशिकाओं के साथ काम करते समय प्रति बाल सेल बंडल में 15 मिनट से कम समय बिताएं। बाल बंडल की एक छवि प्राप्त करने के बाद, कोई भी मेचानोट्रांसडक्शन चैनल गुणों के बारे में सवालों के जवाब देने के लिए स्टीरियोसिलिया की सतह पर विशिष्ट स्थानों से एकल चैनल रिकॉर्डिंग प्राप्त करने का प्रयास कर सकता है।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Sf9 कक्ष में और Aplysia संवेदी न्यूरॉन्स में PKC स्थानान्तरण के लाइव इमेजिंग

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

समय चूक विकास Zebrafish अग्रमस्तिष्क में Clonally संबंधित तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं की लाइव इमेजिंग

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

संवेदी अंग अग्रदूत साबित कोशिकाओं के बरकरार में लाइव सेल इमेजिंग ड्रोसोफिला Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

उच्च संकल्प कार्यात्मक मानव मध्यमस्तिष्क के लिए चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग तरीके

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

उच्च संकल्प विकास Neuroepithelium में सेल व्यवहार का लाइव इमेजिंग

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Zebrafish भीतरी कान के बालों की कोशिकाओं में पैच दबाना रिकॉर्डिंग पृथक से

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

उच्च क्षेत्र fMRI का उपयोग वयस्क बिल्लियों में श्रवण प्रांतस्था के कार्यात्मक इमेजिंग

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Neuronal घने कोर vesicles के सुपर संकल्प इमेजिंग

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

उच्च संकल्प<em&gt; Vivo</em&gt; 3T चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग का उपयोग मानव हिप्पोकैम्पस उपक्षेत्रों के लिए मैनुअल विभाजन प्रोटोकॉल

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

श्रवण तंत्रिका की optogenetic उत्तेजना

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...