Name: stereocilia bundle imaging with nanoscale resolution in live mammalian auditory hair cells
Uploaded: 2021-01-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells at JoVE.com

프로젝트의 모든 단계에서 장기적인 지원과 조언을 해주신 유리 코르체프 교수(영국 임페리얼 칼리지)에게 감사드립니다. 또한 파벨 노박 박사와 앤드류 셰브추크 박사(영국 임페리얼 칼리지)와 올렉 벨로프(러시아 국립청각연구센터)에게 소프트웨어 개발에 도움을 준 것에 대해 감사드립니다. 이 연구는 NIDCD/NIH(R01 DC008861 및 R01 DC014658에서 G.I.F.까지)에 의해 지원되었습니다.

연구 결과는 건강의 국가 학회의 실험실 동물의 배려 그리고 사용을 위한 지침에 있는 권고에 따라 수행되었습니다. 모든 동물 절차는 켄터키 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다 (프로토콜 00903M2005).
1. 나노 피펫제조 및 테스트
<ol><li>마이크로피펫 풀러에 프로그램을 만들어 약 50-70 nm의 내부 팁 직경에 해당하는 200MΩ에서 400 MΩ ?...

<ol>
	<li>Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+inner+hair+cell+mechanotransducer+channels+using+high-speed+calcium+imaging.">Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging.</a> Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).</li><li>Effertz, T., Becker, L., Peng, A. W., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositol-4,5-bisphosphate+regulates+auditory+hair-cell+mechanotransduction-channel+pore+properties+and+fast+adaptation.">Phosphoinositol-4,5-bisphosphate regulates auditory hair-cell mechanotransduction-channel pore properties and fast adaptation.</a> The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (48), 11632-11646 (2017).</li><li>Peng, A. W., Gnanasambandam, R., Sachs, F., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+independent+modulation+of+auditory+hair+cell+mechanotransduction+channel+open+probability+implicates+a+role+for+the+lipid+bilayer.">Adaptation independent modulation of auditory hair cell mechanotransduction channel open probability implicates a role for the lipid bilayer.</a> The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (10), 2945-2956 (2016).</li><li>Engstr&#246;m, H., Engstr&#246;m, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+hairs+on+cochlear+sensory+cells.">Structure of the hairs on cochlear sensory cells.</a> Hearing research. 1 (1), 49-66 (1978).</li><li>Conchello, J. A., Lichtman, J. 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M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy.">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li><li>W&#228;ldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy.">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348 (2015).</li><li>Pickles, J. O., Comis, S. D., Osborne, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-links+between+stereocilia+in+the+guinea+pig+organ+of+Corti,+and+their+possible+relation+to+sensory+transduction.">Cross-links between stereocilia in the guinea pig organ of Corti, and their possible relation to sensory transduction.</a> Hearing Research. 15 (2), 103-112 (1984).</li><li>Furness, D. N., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-links+between+stereocilia+in+the+guinea+pig+cochlea.">Cross-links between stereocilia in the guinea pig cochlea.</a> Hearing Research. 18 (2), 177-188 (1985).</li><li>Jacobs, R. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+correlates+of+mechanoelectrical+transduction+in+hair+cells+of+the+bullfrog&#8217;s+internal+ear.">Ultrastructural correlates of mechanoelectrical transduction in hair cells of the bullfrog&#8217;s internal ear.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 547-561 (1990).</li><li>Goodyear, R. J., Marcotti, W., Kros, C. J., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+properties+of+stereociliary+link+types+in+hair+cells+of+the+mouse+cochlea.">Development and properties of stereociliary link types in hair cells of the mouse cochlea.</a> The Journal of Comparative Neurology. 485 (1), 75-85 (2005).</li><li>Kachar, B., Parakkal, M., Kurc, M., Zhao, Y., Gillespie, P. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+scanning+electron+microscopy+of+anti-PKHD1L1+immuno-gold+labeled+mouse+hair+cell+stereocilia+bundles.">Serial scanning electron microscopy of anti-PKHD1L1 immuno-gold labeled mouse hair cell stereocilia bundles.</a> Scientific Data. 7 (1), 182 (2020).</li><li>Hadi, S., Alexander, A. J., V&#233;lez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-XVa+controls+both+staircase+architecture+and+diameter+gradation+of+stereocilia+rows+in+the+auditory+hair+cell+bundles.">Myosin-XVa controls both staircase architecture and diameter gradation of stereocilia rows in the auditory hair cell bundles.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology JARO. 21 (2), 121-135 (2020).</li><li>Metlagel, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryo-tomography+of+vestibular+hair-cell+stereocilia.">Electron cryo-tomography of vestibular hair-cell stereocilia.</a> Journal of Structural Biology. 206 (2), 149-155 (2019).</li><li>Langer, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+of+individual+stereocilia+of+living+cochlear+hair+cells+by+atomic+force+microscopy.">Mechanical stimulation of individual stereocilia of living cochlear hair cells by atomic force microscopy.</a> Ultramicroscopy. 82 (1-4), 269-278 (2000).</li><li>Dufr&#234;ne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+nanomicrobiology+using+atomic+force+microscopy.">Towards nanomicrobiology using atomic force microscopy.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (9), 674-680 (2008).</li><li>Putman, C. A., van der Werf, K. O., de Grooth, B. G., van Hulst, N. F., Greve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelasticity+of+living+cells+allows+high+resolution+imaging+by+tapping+mode+atomic+force+microscopy.">Viscoelasticity of living cells allows high resolution imaging by tapping mode atomic force microscopy.</a> Biophysical journal. 67 (4), 1749-1753 (1994).</li><li>Gavara, N., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncontact+microrheology+at+acoustic+frequencies+using+frequency-modulated+atomic+force+microscopy.">Noncontact microrheology at acoustic frequencies using frequency-modulated atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 7 (8), 650-654 (2010).</li><li>Cartagena-Rivera, A. X., Van Itallie, C. M., Anderson, J. M., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+surface+supracellular+mechanical+properties+in+polarized+epithelium+using+noninvasive+acoustic+force+spectroscopy.">Apical surface supracellular mechanical properties in polarized epithelium using noninvasive acoustic force spectroscopy.</a> Nature Communications. 8 (1), 1030 (2017).</li><li>Katsuno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRIOBP-5+sculpts+stereocilia+rootlets+and+stiffens+supporting+cells+enabling+hearing.">TRIOBP-5 sculpts stereocilia rootlets and stiffens supporting cells enabling hearing.</a> JCI Insight. 4 (12), (2019).</li><li>Hansma, P. K., Drake, B., Marti, O., Gould, S. A., Prater, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scanning+ion-conductance+microscope.">The scanning ion-conductance microscope.</a> Science. 243 (4891), 641-643 (1989).</li><li>Korchev, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+scanning+ion-conductance+microscope+for+imaging+of+living+cells.">Specialized scanning ion-conductance microscope for imaging of living cells.</a> Journal of Microscopy. 188 (Pt 1), 17-23 (1997).</li><li>Shevchuk, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+proteins+in+membranes+of+living+cells+by+high-resolution+scanning+ion+conductance+microscopy.">Imaging proteins in membranes of living cells by high-resolution scanning ion conductance microscopy.</a> Angewandte Chemie (International ed in English. 45 (14), 2212-2216 (2006).</li><li>Novak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+live-cell+imaging+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy.">Nanoscale live-cell imaging using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Nature Methods. 6 (4), 279-281 (2009).</li><li>V&#233;lez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+live+cochlear+stereocilia+at+a+nanoscale+resolution+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy.">Visualization of live cochlear stereocilia at a nanoscale resolution using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1427, 203-221 (2016).</li><li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+scanning+patch-clamp:+new+insights+into+cell+function.">High-resolution scanning patch-clamp: new insights into cell function.</a> FASEB Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (7), 748-750 (2002).</li><li>Frolenkov, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+recordings+from+the+apical+surface+of+outer+hair+cells+with+a+scanning+ion+conductance+probe.">Single-channel recordings from the apical surface of outer hair cells with a scanning ion conductance probe.</a> Association for Research in Otolaryngology. Abs. 444, (2004).</li><li>S&#225;nchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncontact+measurement+of+the+local+mechanical+properties+of+living+cells+using+pressure+applied+via+a+pipette.">Noncontact measurement of the local mechanical properties of living cells using pressure applied via a pipette.</a> Biophysical Journal. 95 (6), 3017-3027 (2008).</li><li>Korchev, Y. E., Negulyaev, Y. A., Edwards, C. R., Vodyanoy, I., Lab, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+localization+of+single+active+ion+channels+on+the+surface+of+a+living+cell.">Functional localization of single active ion channels on the surface of a living cell.</a> Nature Cell Biology. 2 (9), 616-619 (2000).</li><li>Shevchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angular+approach+scanning+ion+conductance+microscopy.">Angular approach scanning ion conductance microscopy.</a> Biophysical Journal. 110 (10), 2252-2265 (2016).</li><li>Furness, D. N., Katori, Y., Nirmal Kumar, B., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dimensions+and+structural+attachments+of+tip+links+in+mammalian+cochlear+hair+cells+and+the+effects+of+exposure+to+different+levels+of+extracellular+calcium.">The dimensions and structural attachments of tip links in mammalian cochlear hair cells and the effects of exposure to different levels of extracellular calcium.</a> Neuroscience. 154 (1), 10-21 (2008).</li></ol>

성공적인 HPICM 이미지를 얻으려면 사용자는 낮은 소음과 낮은 진동 시스템을 구축하고 적절한 파이펫을 제조해야합니다. 우리는 강력하게 어떤 라이브 세포 이미징을 수행하기 전에 시스템의 안정성을 테스트하기 위해 AFM 교정 표준의 사용을 권장합니다. 시스템의 해상도가 테스트되면 사용자는 라이브 셀 이미징을 시도하기 전에 이미징 설정에 익숙해지기 위해 Corti 샘플의 고정 기관을 이미징?...

청각 모발 세포내 의 스테레오실리아가 광학 현미경 검사법에 의해 시각화되고 패치 클램프 실험에서 살아있는 세포에서 편향될 정도로 크다는 사실에도 불구하고 팁 링크와 같은 트랜스듀션 기계의 필수 구조 성분은 죽은 세포에서전자 현미경으로만 이미지화될 수 있다. 포유류 청각 모발 세포에서, 트랜스듀션 기계는 팁 링크의 하부 에 위치하고, 즉, 짧은 행 스테레오실리아1의 끝에서 스테레오실리아2의끝에서 신호를 통해 국소적으로조절된다 2,3. 그러나, 살아있는 머리 세포에 있는 이 위치에 있는 표면 구조물의 레이블 없는 화상 진찰은 입체증의 작은 크기 때문에 가능하지 않습니다.
포유류 달팽이관에는 두 가지 유형의 청각 감각 세포가 있습니다: 내부 및 외부 모발 세포. 내부 모발 세포에서, 스테레오실리아는 외발성 세포4에비해 더 길고 두껍다. 스테레오실리아의 첫 번째 및 두 번째 행은 마우스 또는 쥐 내부 모발 세포에서 300-500 nm의 직경을 갖는다. 빛의 회절로 인해 라벨이 없는 광학 현미경으로 달성할 수 있는 최대 해상도는 약 200nm입니다. 따라서, 내부 헤어 셀 번들의 제1 및 두 번째 행 내에서 개별 입체의 시각화는 광학 현미경으로 비교적 쉽습니다. 대조적으로, 내부 모발 세포및 외부 모발 세포의 모든 스테레오실리아의 짧은 행 스테레오실리는 직경이 100-200 nm이며 광학 현미경5로시각화할 수 없다. 최근 초분해능 이미징의 진전에도 불구하고, 이러한 근본적인 한계는 광학 라벨없는 이미징에서 지속됩니다. 현재 시판되는 모든 슈퍼 분해능 기술은 일종의 형광 분자6이필요하며, 이는 응용 프로그램을 제한합니다. 특정 형광 태그 분자에 대한 필요성에 의한 제한 외에도, 강렬한 빛 조사에 노출세포 손상을 유도하고 세포 과정에 영향을 미칠 수 있는 것으로 나타났으며, 이는 살아있는 세포를 연구할 때 큰 단점이다7.
모발 세포 입체 번들의 초구조적 세부 사항에 대한 현재의 지식은 주로 전자 현미경 검사법(SEM), 전염 전자 현미경 검사법(TEM), 동결 골절 EM 과 같은 다양한 전자 현미경 검사법(EM) 기술로 주로 수득되었으며, 최근에는 이온 빔 또는 냉동-EM 단층 촬영8,9,10, 10, 10, 10, 10, 10,10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 12, 10, 10, 10, 12, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10, 10,12 14,15,16. 불행히도, 이러한 모든 EM 기술은 시료의 화학적 또는 극저온을 필요로 합니다. 현상의 시간 규모에 따라,이 요구 사항은 불가능하거나 매우 노동 집약적 인 스테레오실리의 끝에서 동적 프로세스의 연구를합니다.
원자력 현미경검사(AFM)17,18을가진 살아있는 모발 세포의 모발 번들을 이미지하기 위한 제한된 노력이 이루어지고 있다. AFM은 생리적 용액에서 작동하기 때문에 이론적으로 시간이 지남에 따라 살아있는 모발 세포의 스테레오실리아 번들에 동적 변화를 시각화 할 수 있습니다. 문제는 AFM 프로브와 샘플 사이의 특정 물리적 접촉을 의미하는 고해상도 AFM의 원칙에 있습니다, 심지어 가장 손상 "도청"모드(19). AFM 프로브가 스테레오실륨을 마주하면 일반적으로 충돌하여 머리카락 번들의 구조를 손상시니다. 그 결과, 이 기술은 라이브, 또는 고정된 모발 세포 번들17,18을시각화하는 데 적합하지 않다. 상기 문제점은시료(20)의표면에 유체역학력만을 부과하는 대형 볼 모양의 AFM 프로브를 이용하여 부분적으로 완화될 수 있다. 그러나, 이러한 프로브가샘플(21)의기계적 특성을 테스트하는 데 이상적으로 적합하지만,Corti(22)의 장기를 이미징할 때 서브 마이크로미터 해상도만 제공하며 여전히 고감도 스테레오실리아 번들에 대해 상당한 힘을 샘플에 적용한다.
스캐닝 이온 전도성 현미경검사(SICM)는 전도성용액(23)으로채워진 유리 파이펫 프로브를 사용하는 스캔 프로브 현미경 검사법의 버전이다. SICM은 파이펫이 전지와 파이펫을 통해 전류에 접근할 때 표면을 감지합니다. 이것은 세포를 접촉하기 전에 잘 일어나기 때문에, SICM은 생리적용액(24)에서살아있는 세포의 비접촉 화상 진찰에 이상적입니다. SICM의 가장 좋은 해상도는 살아있는세포(25)의혈장 막에서 개별 단백질 복합체를 해결할 수 있는 단일 나노미터의 순서에 있다. 그러나 다른 스캐닝 프로브 기술과 마찬가지로 SICM은 비교적 평평한 표면만 이미지할 수 있습니다. 우리는 나노 파이펫이 각 이미징 지점에서 샘플에 접근하는 호핑 프로브 이온 전도성 현미경 (HPICM)(26)를발명하여 이러한 한계를 극복(도 1A). HPICM을 사용하여 나노 스케일 해상도27을사용하여 살아있는 청각 모발 세포에서 입체 번들을 이미지 할 수 있었습니다.
이 기술의 또 다른 근본적인 장점은 HPICM이 이미징 도구일 뿐만 아니라는 것입니다. 다른 스캐닝 프로브 기술과는 달리, HPICM/SICM 프로브는 다양한 자극의 전기 기록 및 국소 전달을 위해 세포 생리학에 널리 사용되는 전극이다. 이온 채널 활동은 일반적으로 HPICM 프로브를 통해 전체 전류가 가장 큰 이온채널(25)에의해 생성된 세포외 전류보다 여러 배 더 큰 크기이기 때문에 HPICM 이미징을 방해하지 않는다. 그러나, HPICM은 이구조(28)로부터관심 구조와 후속 단일 채널 패치 클램프 레코딩을 통해 나노피펫의 정확한 포지셔닝을 허용한다. 이것은 우리가 외발 모발 세포스테레오실리아(29)의끝에서 단일 채널 활동의 첫 번째 예비 기록을 획득한 방법입니다. 나노 피펫을 통해 큰 전류조차도 세포 외 배지의 거대한 전기 션트로 인해 플라즈마 멤브레인 전반에 걸쳐 잠재력의 중요한 변화를 생성 할 수 없다는 것을 언급 할 가치가 있다. 그러나, 개별 이온 채널은 나노피펫(30)을 통해 액체의 흐름에 의해 기계적으로 활성화될 수 있거나, 또는작용제(31)의국소 적용에 의해 화학적으로 활성화될 수 있다.
HPICM에서, 상기 이미지는 나노피펫이 한 지점에서 시료에 순차적으로 접근할 때 생성되고, 후퇴한 다음, 측면 방향으로 이동하여접근법(도 1A)을반복한다. 패치 클램프 증폭기는 파이펫(도1B)의AgCl 와이어에 전압을 지속적으로 적용하여 목욕 용액에서 ~1nA의 전류를 생성한다. 피펫이 셀의 표면에서 떨어져 있을 때 이 전류의 값은 참조 전류로 결정된다(I참조, 도 1C). 이어서, 파이펫은 Z 축에서 이동하여 전류가 사용자에 의해 미리 정의된 양(setpoint)에 의해 감소될 때까지 샘플에 접근한다( 보통 0.2%-1%의 I심판(도 1C,상단 추적). 그런 다음 이 이미징 점의 X 및 Y 좌표와 함께 이 시점에서 Z 값을 샘플높이로 저장합니다. 이어서, 파이펫은 사용자가 정의한 속도로표면(도 1C,하부 추적)에서 멀리 후퇴하며, 보통 700-900 nm/ms. 후퇴 후, 파이펫(또는, 당사의 경우, 샘플-도 1B참조)는 다음 이미징 지점으로 측면으로 이동되고, 새로운 기준 전류 값이 얻어지고, 파이펫이 다시 한 번 샘플에 접근하여 과정을 반복한다. 파이펫의 X-Y 운동은 전형적으로 모발 세포 메카노트랜스유도 전류의 기록에 사용되는 직립 현미경 설정에서 선호된다. 이 설정에서 HPICM 프로브는 상단이 아니라 각도32에서헤어 셀 번들에 접근합니다. 그러나, HPICM 이미징의 최상의 해상도는 반전된 현미경설정(도 1A,B)에서달성되며, 여기서 X-Y 방향으로 샘플의 움직임이 나노피펫의 Z-이동으로부터 분리되어 잠재적인 기계적 유물을 제거한다.
HPICM을 사용하여 마우스와 쥐 내부 및 외발 모발 세포 스테레오실리아 번들의 지형 영상을 입수하고, 지름26,27에서약 5nm인 스테레오실리사이의 링크를 시각화하였다. 이 기술로 모발 세포 번들 이미징의 성공은 여러 가지 요인에 의존합니다. 첫째, 나노피펫 전류의 노이즈(분산)는 HPICM 이미징에 대해 가능한 가장 낮은 설정점을 허용하기 위해 가능한 한 작아야 한다. 낮은 설정점을 사용하면 HPICM 프로브가 더 먼 거리와 프로브 접근법에 대한 모든 각도에서 스테레오시리아 표면을 "감지"할 수 있으며 놀랍게도 HPICM 이미징의 X-Y 해상도를 향상시킵니다(토론 참조). 둘째, 이미징 유물에 직접 기여하기 때문에 시스템의 진동과 드리프트를 10nm 미만으로 감소시켜야 합니다. 마지막으로, HPICM 프로브와 시편 스테이지가 단일 나노미터 이하의 정확도를 갖는 보정된 피드백 제어 압압 액추에이터에 의해 Z 및 X-Y 축으로 이동하더라도 나노피펫 팁의 직경은 전류(감지 부피)의 확산을 결정하고 따라서해상도(그림 1A). 따라서, 살아있는 헤어 세포를 이미징하기 전에, 적절한 파이펫을 당기고, 교정 샘플로 원하는 해상도에 도달하고, 기록 시스템에서 낮은 잡음을 달성하는 것이 중요합니다.
적어도 수십 년 동안, SICM 기술은 상용화되지 않았으며 영국 제국 대학의 Korchev 교수의 선도적 인 실험실과 함께 세계에서 몇 실험실만 개발하고 있습니다. 최근에는 여러 SICM 시스템이 상용화되었습니다(재료 표참조), 이 모든 시스템은 원래 HPICM 원칙을 기반으로 합니다. 그러나, 헤어 셀에서 이미징 스테레오실리아 번들 은 폐쇄된 "즉시 이동" 시스템에서 기술적으로 도전적이거나 불가능한 몇 가지 사용자 지정 수정이 필요합니다. 따라서 일부 구성 요소 통합이 필요합니다. HPICM 설정은 보다 엄격한 진동 및 드리프트 요구 사항과 HPICM 프로브및샘플(그림 1D)의압조 구동 이동을 갖춘 패치 클램프 리그를 나타내기 때문에 패치 클램핑에 능숙한 모든 연구원에게 이러한 통합이 비교적 쉽습니다. 그러나 적절한 배경이없는 과학자는 전기 생리학에 대한 교육이 먼저 필요합니다. 이미징 속도 증가와 같은 남은 과제에도 불구하고(토론참조), 우리는 나노 스케일 해상도로 살아있는 모발 세포에서 스테레오실리아 번들을 손상시키지 않고 이미지화할 수 있었습니다.
이 논문은 우리의 사용자 정의 시스템을 사용하여 젊은 산후 쥐 또는 마우스 달팽이관 이출에 있는 살아있는 청각 머리 세포 번들의 성공적인 HPICM 화상 진찰을 능력을 발휘하기 위하여 상세한 프로토콜을 제시합니다. 통합 된 구성 요소는 재료표에나열됩니다. 이 논문은 또한 발생할 수 있는 일반적인 문제와 문제를 해결하는 방법에 대해서도 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Analog oscilloscope</td>
			<td>B&#38;K Precision</td>
			<td>2160C</td>
			<td>Analog oscilloscope for real-time monitoring of nanopipette current and Z-axis approach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM calibration standards</td>
			<td>TED PELLA Inc</td>
			<td>HS-100MG; HS-20MG</td>
			<td>These 100 and 20 nm calibration standards are used to test the performance of HPICM system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop vibration Isolator</td>
			<td>AMETEK/TMC</td>
			<td>Everstill K-400</td>
			<td>Active vibration isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>Borosilicate glass capillaries for the nanopipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>To be added to the bath solution to adjust osmolarity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>National Instruments Corporation</td>
			<td>PCI-6221</td>
			<td>Multi-channel input/output digitizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast analog Proportional-Integral-Derivative (PID) control for Z movement</td>
			<td>Standford Research Systems</td>
			<td>SIM900, SIM960, SIM980</td>
			<td>Instrumentation modules integrated in an external PID controller for Z movement. It requires a fast response that is usually not implemented in commercial piezo amplifiers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>AMETEK/TMC</td>
			<td>Type II</td>
			<td>Required to shield electromagnetic interference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td>Used as the dish for the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td>Extracellular (bath) solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrumentation amplifier</td>
			<td>Brownlee Precision</td>
			<td>Model 440</td>
			<td>Instrumentation amplifier provides required offsets, filtering, and secondary magnification or attenuation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-based micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2000/G</td>
			<td>Micropipette puller to fabricate the nanopipettes. Laser is needed for sharp quartz pipettes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lebovitz&#39;s L-15, without phenol red</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td>Extracellular (bath) solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>PatchStar</td>
			<td>Used for &#34;course&#34; positioning of the Z piezo actuator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td>Inverted optical microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td>The patch clamp amplifier measures the current through the nanopipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo amplifier (XY axes)</td>
			<td>Physik Instrumente (PI)</td>
			<td>E-500.00, E-505.00, E-509.C2A</td>
			<td>Amplification and PID control for XY piezo translation stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo amplifier (Z axis)</td>
			<td>Piezosystem jena</td>
			<td>ENT 400 &#38; 800</td>
			<td>Custom amplifier consisting of ENT 400 power supply and two ENT 800 amplifiers in parallel to achieve max current of 1.6 nA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Coverslips</td>
			<td>TED PELLA Inc</td>
			<td>26028</td>
			<td>Used in the fabrication of the chambers for the tissue&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SICM controller &#38; software*</td>
			<td>Ionscope, UK (ionscope.com)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom controller based on SBC6711 digital signal processing board from Innovative Integration Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer (Sylgard)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Used to attach the flexible glass fibers to the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon glue</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>734</td>
			<td>Used to glue the different parts of the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten rod</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>717500</td>
			<td>Used for holding the dental floss strands in the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY piezo nanopositioner</td>
			<td>Physik Instrumente (PI)</td>
			<td>P-733.2DD</td>
			<td>XY translation stage with capacitive sensors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z piezo nanopositioner</td>
			<td>Piezosystem jena</td>
			<td>RA 12/24 SG</td>
			<td>Ring piezoactuator with a strain gage sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">*Ionscope does not sell separate SICM controllers anymore. There are few other commercial systems:&#160; NX12-Bio and NX10 SICM,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Park Systems, Korea and SICM modules from ICAPPIC Limited, UK (icappic.com). All these systems are based on the original&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">HPICM principles. However, imaging stereocilia bundles in the hair cells requires several custom modifications that are technically&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">challenging (or even impossible) in the closed &#8220;ready-to-go&#8221; systems such as Ionscope or NX12-Bio/NX10. Currently, there is only one&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">modular system (ICAPPIC) that has the flexibility to suit any SICM/HPICM experiment but requires some component integration.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereocilia bundle imaging with nanoscale resolution in live mammalian auditory hair cells

내이 헤어 셀은 소리 유발 변위를 감지하고 높이가 증가하는 행으로 배열되는 스테레오실리아로 구성된 헤어 번들에서 이러한 자극을 전기 신호로 변환합니다. 스테레오실리아가 편향되면 작은(직경5nm)에 예인선이 교차하는 스테레오시리아를 연결하여 메카노감과감성 트랜스듀션 채널에 힘을 전달합니다. 메카노트랜스덕션은 수십 년 동안 살아있는 모발 세포에서 연구되었지만, 스테레오실리아 의 끝에서 메카노트랜스덕션 기계의 기능적으로 중요한 초구조적 세부 사항(예: 팁 링크 역학 또는 트랜스듀션 의존성 입체 리모델링)은 여전히 전자 현미경 검사를 받은 죽은 세포에서만 연구될 수 있다. 이론적으로, 원자력 현미경 검사법과 같은 스캐닝 프로브 기술은 스테레오실리아의 표면을 시각화하기에 충분한 해상도를 갖습니다. 그러나, 이미징 모드와는 별개로, 스테레오실리와 함께 원자력 현미경 프로브의 사소한 접촉조차도 일반적으로 번들을 손상시합니다. 여기서 우리는 살아있는 설치류 청각 모발 세포의 호핑 프로브 이온 전도성 현미경 검사법 (HPICM) 화상 진찰에 대한 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 비접촉 스캐닝 프로브 기술은 모발 세포와 같은 복잡한 지형을 가진 살아있는 세포의 표면의 시간 경과 이미징을 단일 나노미터 해상도로 샘플과 물리적접촉을 하지 않고도 할 수 있습니다. HPICM은 유리 나노피펫을 통과하는 전류를 사용하여 파이펫 가까이에서 셀 표면을 감지하고 3D 포지셔닝 압전 시스템은 표면을 스캔하고 이미지를 생성합니다. HPICM을 사용하면 눈에 띄는 손상없이 몇 시간 동안 살아있는 청각 헤어 셀에서 스테레오실리아를 상호 연결하는 스테레오실리와 연결 된 링크를 이미지 할 수있었습니다. 우리는 HPICM의 사용이 그들의 기능을 더 잘 이해하기 위해 살아있는 머리 세포의 스테레오실리에 있는 초구조적인 변경의 직접적인 탐구를 허용할 것으로 예상합니다.

이 논문에 제시된 프로토콜은 복잡한 지형을 가진 살아있는 세포를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 단계에 따라, 우리는 일상적으로 살아있는 쥐 청각 머리 세포 번들의 이미지를 얻을 수 있습니다(그림 6B,D). SEM 이미지와 비교할 때 X-Y 해상도가 낮음에도 불구하고, 우리의 HPICM 이미지는 입체화의 다른 행, 스테레오실리아 팁의 모양, 심지어 인접한 ?...

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Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells

여기서 우리는 호핑 프로브 이온 전도 현미경 검사법 (HPICM)에 대한 프로토콜을 제시, 라이브 청각 헤어 셀에서 스테레오실리의 나노 스케일 이미징을 허용하는 비 접촉 스캐닝 프로브 기술.

살아있는 포유류 청각 머리 세포에 있는 나노 규모 해상도를 가진 스테레오실리모들 화상 진찰

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia ...

이 실용적인 우리가 헤어 셀 스테레오실리의 표면에 기계 전기 변환 기계의 나노 구조 구성 요소의 동적 변화를 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 나노미터 해상도에서 복잡한 지형을 가진 살아있는 세포의 표면의 시간 경과 이미징이며 시료와 물리적 접촉을하지 않고. 이 기술은 거의 모든 살아있는 세포에 적용될 수 있습니다.우리는 이전에 바이러스에 감염된 폐 상피 세포주 표면을 일치, 근육 세포, 곧 내 이미지 박테리아에서. 각 이미징 세션의 시작 부분에서 나노 피펫을 테스트합니다. 나노피펫을 제작한 후, 거품을 확인하고, 거품을 제거하고, 나노피펫을 호핑 프로브 에 장착하여 이온 전도도 현미경 피펫 홀더에 장착한다.챔버에 목욕 용액의 4 밀리리터에서 HPICM 단계에 챔버를 배치합니다. 접지 전극을 목욕 용액에 도입하고 패치 클램프 증폭기를 통해 파이펫에 적용되는 전압이 0인지 확인합니다. 마이크로 조작기를 수직 위치에 놓은 후 액체에 닿을 때까지 Z의 파이펫을 이동하고 증폭기를 0으로 설정한 후 100밀리볼트를 추가하여 파이펫 전류를 확인합니다.실리콘 접착제를 사용하여 AFM 교정 표준을 챔버에 부착하고 4 밀리리터의 HBSS로 샘플을 덮습니다. 양면 테이프를 사용하여 HPICM 설정의 X Y 단계에 챔버를 고정하고 입증된 대로 새 나노피펫을 홀더에 로드합니다. 나노피펫 저항성 및 직경을 테스트한 후 전류를 1나노 앰프로 설정합니다.거친 패치 클램프 조작기를 사용하여 나노파이펫을 교정 표준의 중앙 위에 위치시키고 세트점을 늘리면서 Z 압전액액터의 센서로부터 실시간으로 신호를 모니터링한다. 안정적인 반복 가능한 Z 접근 주기를 설정한 후, 세트점을 불안정 지점 바로 바로 위에 있는 값으로 줄이고 피펫을 초당 약 5미크론의 속도로 아래로 이동하여 시료에 도달할 때까지 한다. 실시간 Z 위치 신호의 바닥 수준이 증가하여 샘플 표면을 감지하여 나노피펫이 철회되었음을 나타냅니다.AFM 표준에 고르지 않은 장착으로 인해 관심 영역의 가장 높은 지점은 알 수 없습니다. 따라서 파이펫 후퇴의 진폭을 적어도 200 내지 500 나노미터로 설정한다. Z 압압 액추에이터 운동의 상한을 초과하지 않도록주의, 낮은 해상도에서 이미징을 시작합니다.이미징 영역에서 샘플의 가장 높은 지점이 확인되면, 새로운 X Y 위치로 이동하기 전에 샘플과의 원치 않는 충돌을 방지하기 위해 Z 축을 따라 약 200 미크론홉 진폭을 감소시키고 파이펫을 철회한다. 관심 영역이 위치했을 때 더 높은 해상도로 이미징을 시작합니다. 청각 헤어 셀 이미징의 경우 치과 치실 또는 유연한 유리 파이펫을 사용하여 코르티의 갓 분리 된 장기를 챔버에 단단히 고정하십시오.양면 테이프를 사용하여 X Y 압전 스테이지에 챔버를 단단히 고정하고 입증된 대로 새로운 나노피펫을 홀더에 로드합니다. 나노피펫 저항성을 확인한 후, 패치 클램프 마이크로 조작기를 사용하여 코티 X 식물의 장기를 반전된 현미경으로 관찰하면서 모발 세포 부위 위에 나노피펫을 배치한다. 기록, 오실로스코프상의 실시간 전류 및 Z 위치 신호는 시스템이 0.5%6or 이하의 세트 포인트로 안정적인지 확인하고, 입증된 바와 같이 최적의 설정점을 결정하고 시료에 접근한다.적어도 6~8미크론의 홉 진폭을 사용하여 입증된 바와 같이 시료의 저해상도 이미징을 수행한다. 나노 피펫이 새로운 X Y 위치로 이동해야하는 경우, 조직 내의 키가 큰 특징과의 충돌을 피하기 위해 약 500 나노미터의 파이펫을 철회하고 모발 세포가 있는 관심 영역까지 저해상도 HPICM 이미징을 반복하십시오. 그런 다음 관심 영역을 15분 이내에 더 높은 해상도로 이미지화합니다.HPICM 프로토콜은 살아있는 쥐 청각 머리 세포 번들과 같은 복잡한 지형을 가진 모든 살아있는 세포를 시각화하는 데 사용될 수 있습니다. HPICM 이미지는 전자 현미경 이미지를 스캔하는 것에 비해 X Y 해상도가 낮지만 다양한 입체 계열을 성공적으로 해결할 수 있습니다. 스테레오실리아 팁의 모양과 인접한 스테레오실리아를 연결하는 작은 5 나노미터 링크.HPICM 이미징의 비접촉 특성을 감안할 때, 동일한 모발 세포 번들의 연속 타임랩스 이미징은 번들 응집력을 손상시키지 않고 몇 시간 동안 수행될 수 있다. 설정점이 매우 낮을 수록 시스템은 전류의 작은 변동을 셀 표면을 발생시키는 것으로 해석하여 이미지에서 백색 도트 노이즈로 이어질 수 있습니다. 마찬가지로, 큰 홉 진폭은 파이펫의 측면 공명을 증가시킬 수 있으며, 이로 인해 시끄러운 픽셀이 생성될 수도 있습니다.대조적으로, 홉 진폭이 너무 작거나 설정점이 너무 높으면 나노피펫이 샘플과 충돌하여 이미징 아티팩트 또는 모발 번들 손상이 발생할 수 있습니다. 이 절차를 시도할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 살아있는 세포로 작업할 때 모발 세포 번들 당 15분 미만을 지출하는 것입니다. 헤어 번들의 이미지를 얻은 후, 하나는 메카노 트랜스듀션 채널 속성에 대한 질문에 대답하기 위해 스테레오실리아의 표면에 특정 위치에서 단일 채널 녹음을 얻으려고 시도 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Sf9 세포에서 Aplysia 감각 뉴런에서 PKC Translocation의 라이브 영상

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

연구

신경과학

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

개발 Zebrafish Forebrain에 Clonally 관련 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

손상의 감각 오르간 전구체 세포 라이브 셀 이미징 Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

인간 Midbrain위한 고해상도 기능성 자기 공명 영상 방법

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

개발 Neuroepithelium의 세포 문제의 고해상도 라이브 영상

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

귀에 세포의 패치 클램프 녹음 절연 Zebrafish에서

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

하이 필드의 fMRI를 사용하여 성인 고양이의 청각 피질의 기능적 이미징

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

신경 밀도 코어 소체의 수퍼 - 해상도 이미징

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

높은 해상도<em&gt; 생체</em&gt; 3T 자기 공명 영상을 이용하여 인간의 해마 서브 필드에 대한 수동 분할 프로토콜

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

청각 신경의 자극 Optogenetic

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...