Name: stereocilia bundle imaging with nanoscale resolution in live mammalian auditory hair cells
Uploaded: 2021-01-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells at JoVE.com

Vi takker prof. Yuri Korchev (Imperial College, UK) for langsiktig støtte og råd gjennom alle stadier av prosjektet. Vi takker også Drs. Pavel Novak og Andrew Shevchuk (Imperial College, UK) samt Oleg Belov (National Research Centre for Audiology, Russland) for deres hjelp med programvareutvikling. Studien ble støttet av NIDCD/NIH (R01 DC008861 og R01 DC014658 til G.I.F.).

Studien ble utført i samsvar med anbefalingene i Veiledningen for pleie og bruk av laboratoriedyr ved National Institutes of Health. Alle dyreprosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Kentucky (protokoll 00903M2005).
1. Produksjon og testing av nanopipetter
<ol><li>Lag et program i mikropipettetrekkeren for å oppnå pipetter med motstand mellom 200 og 400 MΩ, som tilsvarer indre spissdiametre på ca. 50-70 nm. Paramet...

<ol>
	<li>Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+inner+hair+cell+mechanotransducer+channels+using+high-speed+calcium+imaging.">Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging.</a> Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).</li><li>Effertz, T., Becker, L., Peng, A. W., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositol-4,5-bisphosphate+regulates+auditory+hair-cell+mechanotransduction-channel+pore+properties+and+fast+adaptation.">Phosphoinositol-4,5-bisphosphate regulates auditory hair-cell mechanotransduction-channel pore properties and fast adaptation.</a> The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (48), 11632-11646 (2017).</li><li>Peng, A. W., Gnanasambandam, R., Sachs, F., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+independent+modulation+of+auditory+hair+cell+mechanotransduction+channel+open+probability+implicates+a+role+for+the+lipid+bilayer.">Adaptation independent modulation of auditory hair cell mechanotransduction channel open probability implicates a role for the lipid bilayer.</a> The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (10), 2945-2956 (2016).</li><li>Engstr&#246;m, H., Engstr&#246;m, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+hairs+on+cochlear+sensory+cells.">Structure of the hairs on cochlear sensory cells.</a> Hearing research. 1 (1), 49-66 (1978).</li><li>Conchello, J. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+microscopy.">Optical sectioning microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 920-931 (2005).</li><li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy.">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li><li>W&#228;ldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy.">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348 (2015).</li><li>Pickles, J. O., Comis, S. D., Osborne, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-links+between+stereocilia+in+the+guinea+pig+organ+of+Corti,+and+their+possible+relation+to+sensory+transduction.">Cross-links between stereocilia in the guinea pig organ of Corti, and their possible relation to sensory transduction.</a> Hearing Research. 15 (2), 103-112 (1984).</li><li>Furness, D. N., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-links+between+stereocilia+in+the+guinea+pig+cochlea.">Cross-links between stereocilia in the guinea pig cochlea.</a> Hearing Research. 18 (2), 177-188 (1985).</li><li>Jacobs, R. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+correlates+of+mechanoelectrical+transduction+in+hair+cells+of+the+bullfrog&#8217;s+internal+ear.">Ultrastructural correlates of mechanoelectrical transduction in hair cells of the bullfrog&#8217;s internal ear.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 547-561 (1990).</li><li>Goodyear, R. J., Marcotti, W., Kros, C. J., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+properties+of+stereociliary+link+types+in+hair+cells+of+the+mouse+cochlea.">Development and properties of stereociliary link types in hair cells of the mouse cochlea.</a> The Journal of Comparative Neurology. 485 (1), 75-85 (2005).</li><li>Kachar, B., Parakkal, M., Kurc, M., Zhao, Y., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+structure+of+hair-cell+tip+links.">High-resolution structure of hair-cell tip links.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 13336-13341 (2000).</li><li>V&#233;lez-Ortega, A. C., Freeman, M. J., Indzhykulian, A. A., Grossheim, J. M., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+current+is+essential+for+stability+of+the+transducing+stereocilia+in+mammalian+auditory+hair+cells.">Mechanotransduction current is essential for stability of the transducing stereocilia in mammalian auditory hair cells.</a> eLife. 6, 1-22 (2017).</li><li>Ivanchenko, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+scanning+electron+microscopy+of+anti-PKHD1L1+immuno-gold+labeled+mouse+hair+cell+stereocilia+bundles.">Serial scanning electron microscopy of anti-PKHD1L1 immuno-gold labeled mouse hair cell stereocilia bundles.</a> Scientific Data. 7 (1), 182 (2020).</li><li>Hadi, S., Alexander, A. J., V&#233;lez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-XVa+controls+both+staircase+architecture+and+diameter+gradation+of+stereocilia+rows+in+the+auditory+hair+cell+bundles.">Myosin-XVa controls both staircase architecture and diameter gradation of stereocilia rows in the auditory hair cell bundles.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology JARO. 21 (2), 121-135 (2020).</li><li>Metlagel, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryo-tomography+of+vestibular+hair-cell+stereocilia.">Electron cryo-tomography of vestibular hair-cell stereocilia.</a> Journal of Structural Biology. 206 (2), 149-155 (2019).</li><li>Langer, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+of+individual+stereocilia+of+living+cochlear+hair+cells+by+atomic+force+microscopy.">Mechanical stimulation of individual stereocilia of living cochlear hair cells by atomic force microscopy.</a> Ultramicroscopy. 82 (1-4), 269-278 (2000).</li><li>Dufr&#234;ne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+nanomicrobiology+using+atomic+force+microscopy.">Towards nanomicrobiology using atomic force microscopy.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (9), 674-680 (2008).</li><li>Putman, C. A., van der Werf, K. O., de Grooth, B. G., van Hulst, N. F., Greve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelasticity+of+living+cells+allows+high+resolution+imaging+by+tapping+mode+atomic+force+microscopy.">Viscoelasticity of living cells allows high resolution imaging by tapping mode atomic force microscopy.</a> Biophysical journal. 67 (4), 1749-1753 (1994).</li><li>Gavara, N., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncontact+microrheology+at+acoustic+frequencies+using+frequency-modulated+atomic+force+microscopy.">Noncontact microrheology at acoustic frequencies using frequency-modulated atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 7 (8), 650-654 (2010).</li><li>Cartagena-Rivera, A. X., Van Itallie, C. M., Anderson, J. M., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+surface+supracellular+mechanical+properties+in+polarized+epithelium+using+noninvasive+acoustic+force+spectroscopy.">Apical surface supracellular mechanical properties in polarized epithelium using noninvasive acoustic force spectroscopy.</a> Nature Communications. 8 (1), 1030 (2017).</li><li>Katsuno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRIOBP-5+sculpts+stereocilia+rootlets+and+stiffens+supporting+cells+enabling+hearing.">TRIOBP-5 sculpts stereocilia rootlets and stiffens supporting cells enabling hearing.</a> JCI Insight. 4 (12), (2019).</li><li>Hansma, P. K., Drake, B., Marti, O., Gould, S. A., Prater, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scanning+ion-conductance+microscope.">The scanning ion-conductance microscope.</a> Science. 243 (4891), 641-643 (1989).</li><li>Korchev, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+scanning+ion-conductance+microscope+for+imaging+of+living+cells.">Specialized scanning ion-conductance microscope for imaging of living cells.</a> Journal of Microscopy. 188 (Pt 1), 17-23 (1997).</li><li>Shevchuk, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+proteins+in+membranes+of+living+cells+by+high-resolution+scanning+ion+conductance+microscopy.">Imaging proteins in membranes of living cells by high-resolution scanning ion conductance microscopy.</a> Angewandte Chemie (International ed in English. 45 (14), 2212-2216 (2006).</li><li>Novak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+live-cell+imaging+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy.">Nanoscale live-cell imaging using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Nature Methods. 6 (4), 279-281 (2009).</li><li>V&#233;lez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+live+cochlear+stereocilia+at+a+nanoscale+resolution+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy.">Visualization of live cochlear stereocilia at a nanoscale resolution using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1427, 203-221 (2016).</li><li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+scanning+patch-clamp:+new+insights+into+cell+function.">High-resolution scanning patch-clamp: new insights into cell function.</a> FASEB Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (7), 748-750 (2002).</li><li>Frolenkov, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+recordings+from+the+apical+surface+of+outer+hair+cells+with+a+scanning+ion+conductance+probe.">Single-channel recordings from the apical surface of outer hair cells with a scanning ion conductance probe.</a> Association for Research in Otolaryngology. Abs. 444, (2004).</li><li>S&#225;nchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncontact+measurement+of+the+local+mechanical+properties+of+living+cells+using+pressure+applied+via+a+pipette.">Noncontact measurement of the local mechanical properties of living cells using pressure applied via a pipette.</a> Biophysical Journal. 95 (6), 3017-3027 (2008).</li><li>Korchev, Y. E., Negulyaev, Y. A., Edwards, C. R., Vodyanoy, I., Lab, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+localization+of+single+active+ion+channels+on+the+surface+of+a+living+cell.">Functional localization of single active ion channels on the surface of a living cell.</a> Nature Cell Biology. 2 (9), 616-619 (2000).</li><li>Shevchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angular+approach+scanning+ion+conductance+microscopy.">Angular approach scanning ion conductance microscopy.</a> Biophysical Journal. 110 (10), 2252-2265 (2016).</li><li>Furness, D. N., Katori, Y., Nirmal Kumar, B., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dimensions+and+structural+attachments+of+tip+links+in+mammalian+cochlear+hair+cells+and+the+effects+of+exposure+to+different+levels+of+extracellular+calcium.">The dimensions and structural attachments of tip links in mammalian cochlear hair cells and the effects of exposure to different levels of extracellular calcium.</a> Neuroscience. 154 (1), 10-21 (2008).</li></ol>

For å oppnå vellykkede HPICM-bilder må brukerne etablere et lavt støy- og lavt vibrasjonssystem og produsere passende pipetter. Vi anbefaler på det sterkeste bruk av AFM-kalibreringsstandarder for å teste stabiliteten til systemet før du prøver å utføre live celleavbildning. Når oppløsningen av systemet er testet, kan brukerne vurdere å avbilde fast organ av Corti-prøver for å bli kjent med bildeinnstillingene før de prøver å se på levende celleavbildning.
Det optimale sette...

Til tross for at stereociliabunter i de hørbare hårcellene er store nok til å visualiseres ved optisk mikroskopi og avbøyes i levende celler i et patchklemmeeksperiment, kan de essensielle strukturelle komponentene i transduksjonsmaskineriet som spisskoblinger bare avbildes med elektronmikroskopien i døde celler. I pattedyrets auditive hårceller er transduksjonsmaskineriet plassert i de nedre endene av spisskoblingene, det vil si ved spissene på den kortere raden stereocilia1 og regulert lokalt gjennom signalering på spissene til stereocilia2,3. Likevel er etikettfri bildebehandling av overflatestrukturene på dette stedet i levende hårceller ikke mulig på grunn av de små størrelsene på stereocilia.
Pattedyret cochlea har to typer auditive sensoriske celler: indre og ytre hårceller. I de indre hårcellene er stereocilia lengre og tykkere sammenlignet med de i de ytre hårcellene4. Den første og andre raden av stereocilia har en diameter på 300-500 nm i mus eller rotte indre hårceller. På grunn av lysets diffraksjon er maksimal oppløsning oppnåelig med en etikettfri optisk mikroskopi ca. 200 nm. Derfor er visualisering av individuelle stereocilia innen første og andre rad i den indre hårcellebunten relativt enkel med optisk mikroskopi. I motsetning har stereocilia med kortere rad i de indre hårcellene og alle stereocilia i de ytre hårcellene diametre rundt 100-200 nm og kan ikke visualiseres med optisk mikroskopi5. Til tross for den siste tidens fremgang innen avbildning med superoppløsning, vedvarer denne grunnleggende begrensningen i alle optiske etikettfrie bilder. Alle nåværende kommersielt tilgjengelige superoppløsningsteknikker krever en slags fluorescerendemolekyler 6, noe som begrenser deres applikasjoner. I tillegg til begrensninger på grunn av behovet for spesifikke fluorescerende merkede molekyler, har eksponering for intens lysbestråling vist seg å indusere cellulær skade og kan påvirke cellulære prosesser, noe som er en stor ulempe når du studerer levende celler7.
Vår nåværende kunnskap om de ultrastrukturelle detaljene i hårcelle stereocilia bunter har blitt oppnådd for det meste med ulike elektronmikroskopi (EM) teknikker, for eksempel skanning elektronmikroskopi (SEM), overføring elektronmikroskopi (TEM), frysefraktur EM, og nylig med 3D-teknikker som seriell seksjonering med fokusert ionstråle eller kryo-EM tomografi8,9,10,11,12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 , 12 ,12, 14,15,16. Dessverre krever alle disse EM-teknikkene kjemisk eller kryofixation av prøven. Avhengig av tidsskalaen til fenomenene, gjør dette kravet en studie av de dynamiske prosessene på spissen av stereocilia enten umulig eller veldig arbeidsintensiv.
Det er gjort begrenset innsats for å avbilde hårbunter av levende hårceller med atomkraftmikroskopi (AFM)17,18. Siden AFM opererer i fysiologiske løsninger, kan det i teorien visualisere dynamiske endringer i stereociliabuntene av levende hårceller over tid. Problemet ligger i prinsippene for høyoppløselig AFM, noe som innebærer viss fysisk kontakt mellom AFM-sonden og prøven, selv i den minst skadelige "tapping"-modusen 19. Når AFM-sonden møter et stereocilium, krasjer den vanligvis mot den og skader strukturen til hårbunten. Som et resultat er denne teknikken ikke egnet for visualisering av levende, eller til og med faste, hårceller bunter17,18. Problemet kan delvis lindres ved å bruke en stor ballformet AFM-sonde som bare pålegger hydrodynamiske krefter til overflaten avprøven 20. Men selv om en slik sonde er ideelt egnet til å teste mekaniske egenskaper tilprøven 21, gir den bare en submikrometeroppløsning når du forestiller deg organet til Corti22 og gjelder fortsatt prøven en kraft som kan være betydelig for de svært følsomme stereociliabuntene.
Skanning av ionledningsmikroskopi (SICM) er en versjon av skanningssondemikroskopi som bruker en glasspipetteprobe fylt med en ledende løsning23. SICM oppdager overflaten når pipetten nærmer seg cellen og den elektriske strømmen gjennom pipetten minker. Siden dette skjer i god tid før du berører cellen, er SICM ideell for ikke-kontaktavbildning av levende celler i fysiologisk løsning24. Den beste oppløsningen av SICM er i rekkefølge av enkle nanometer, noe som gjør det mulig å løse individuelle proteinkomplekser ved plasmamembranen til en levende celle25. Men i likhet med andre skannesondeteknikker, kan SICM bare avbilde relativt flate overflater. Vi overvant denne begrensningen ved å oppfinne mikroskop for hoppingssondeledningsmikroskop (HPICM)26, der nanopipetten nærmer seg prøven ved hvert bildepunkt (figur 1A). Ved hjelp av HPICM kunne vi avbilde stereociliabunter i levende auditive hårceller med nanoskalaoppløsning27.
En annen grunnleggende fordel med denne teknikken er at HPICM ikke bare er et bildeverktøy. I motsetning til andre skannesondeteknikker er HPICM/SICM-sonden en elektrode som er mye brukt i cellefysiologi for elektriske opptak og lokal levering av ulike stimuli. Ionkanalaktivitet forstyrrer vanligvis ikke HPICM-avbildning, fordi den totale strømmen gjennom HPICM-sonden er flere størrelsesordener større enn den ekstracellulære strømmen som genereres av de største ionkanalene25. HPICM tillater imidlertid presis posisjonering av nanopipetten over en struktur av interesse og påfølgende enkanals patch-clamp-opptak fra denne strukturen28. Slik fikk vi de første foreløpige opptakene av enkanalsaktivitet på spissene til den ytre hårcellen stereocilia29. Det er verdt å nevne at selv en stor strøm gjennom nanopipetten ikke kan produsere betydelige endringer av potensialet over plasmamembranen på grunn av enorm elektrisk shunt av det ekstracellulære mediet. Imidlertid kan individuelle ionkanaler aktiveres mekanisk ved flyt av væske gjennom nanopipetten30 eller kjemisk ved lokal påføring av en agonist31.
I HPICM genereres bildet når en nanopipette nærmer seg prøven sekvensielt på et tidspunkt, trekker seg tilbake og deretter beveger seg i sideretningen for å gjenta tilnærmingen (Figur 1A). En patchklemmeforsterker bruker hele tiden spenning på en AgCl-ledning i pipetten (figur 1B) for å generere en strøm på ~ 1 nA i badeløsningen. Verdien av denne strømmen når pipetten er borte fra overflaten av cellen, bestemmes som en referansestrøm (Iref, Figur 1C). Deretter beveger pipetten seg i Z-aksen for å nærme seg prøven til strømmen reduseres med en mengde som er forhåndsdefinert av brukeren (setpoint), vanligvis 0,2%-1% av Iref (Figur 1C, toppsporing). Systemet lagrer deretter Z-verdien for øyeblikket som høyden på prøven, sammen med X- og Y-koordinater for dette bildepunktet. Deretter trekkes pipetten bort fra overflaten (Figur 1C, bunnspor) med en hastighet definert av brukeren, vanligvis 700-900 nm/ms. Etter tilbaketrekning flyttes pipetten (eller i vårt tilfelle prøven - se figur 1B) sidelengs til neste bildepunkt, en ny referansestrømverdi oppnås, og pipetten nærmer seg igjen prøven, og gjentar prosessen. X-Y-bevegelsen til pipetten foretrekkes i et oppreist mikroskopoppsett som vanligvis brukes til opptak av hårcellemekanotransduksjonsstrømmene. I denne innstillingen nærmer HPICM-sonden seg hårcellebuntene ikke fra toppen, men i en vinkel32. Den beste oppløsningen av HPICM-avbildning oppnås imidlertid i et invertert mikroskopoppsett (Figur 1A,B), der bevegelsen av prøven i X-Y-retninger kobles fra Z-bevegelsen til nanopipetten, og dermed eliminerer potensielle mekaniske gjenstander.
Ved hjelp av HPICM fikk vi topografiske bilder av mus og rotte indre og ytre hårcelle stereocilia bunter, og til og med visualisert koblingene mellom stereocilia som er ca 5 nm i diameter26,27. Suksessen til hårcellebuntavbildning med denne teknikken er avhengig av flere faktorer. For det første bør støyen (variansen) til nanopipettestrømmen være så liten som mulig for å tillate lavest mulig settpunkt for HPICM-avbildning. Et lavt settpunkt gjør det mulig for HPICM-sonde å "føle" stereocilia-overflate i større avstand og i alle vinkler mot probetilnærmingen, og forbedrer overraskende X-Y-oppløsningen til HPICM-avbildning (se Diskusjon). For det andre bør vibrasjonene og driften i systemet reduseres til mindre enn 10 nm, siden de bidrar direkte til bildeartefaktene. Til slutt, selv om HPICM-sonden og prøvetrinnet flyttes i Z- og X-Y-akser av de kalibrerte feedback-kontrollerte piezo-aktuatorene som har en nøyaktighet på et enkelt nanometer eller bedre, bestemmer diameteren på nanopipettespissen spredningen av strømmen (sensorvolum) og dermed oppløsningen (Figur 1A). Derfor, før du forestiller levende hårceller, er det viktig å trekke de tilstrekkelige pipettene, nå ønsket oppløsning med kalibreringsprøver og oppnå lav støy i opptakssystemet.
I minst et par tiår har SICM-teknikken ikke vært kommersielt tilgjengelig, og den har utviklet seg av bare få laboratorier i verden med det ledende laboratoriet til Prof. Korchev i Imperial College (UK). Nylig ble flere SICM-systemer kommersielt tilgjengelige (se Tabell over materialer), som alle er basert på de opprinnelige HPICM-prinsippene. Imidlertid krever avbildning av stereociliabunter i hårcellene flere tilpassede modifikasjoner som er teknisk utfordrende (eller til og med umulige) i de lukkede "klare" systemene. Derfor er det nødvendig med litt komponentintegrasjon. Siden HPICM-oppsettet representerer en patchklemmerigg med strengere vibrasjons- og driftkrav og en piezodrevet bevegelse av HPICM-sonden og prøven (figur 1D), er denne integrasjonen relativt enkel for enhver forsker, som er dyktig i patchklemming. Imidlertid vil en forsker uten riktig bakgrunn definitivt trenge litt trening i elektrofysiologi først. Til tross for gjenværende utfordringer som å øke hastigheten på avbildning (se Diskusjon), har vi vært i stand til å bilde stereocilia bunter i levende hårceller med nanoskala oppløsning uten å skade dem.
Dette dokumentet presenterer en detaljert protokoll for å utføre vellykket HPICM-avbildning av levende auditive hårcellebunter i unge postnatal rotte- eller muskochleaut utviser ved hjelp av vårt tilpassede system. De integrerte komponentene er oppført i Materialliste. Avisen beskriver også vanlige problemer som kan oppstå, og hvordan du feilsøker dem.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Analog oscilloscope</td>
			<td>B&#38;K Precision</td>
			<td>2160C</td>
			<td>Analog oscilloscope for real-time monitoring of nanopipette current and Z-axis approach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM calibration standards</td>
			<td>TED PELLA Inc</td>
			<td>HS-100MG; HS-20MG</td>
			<td>These 100 and 20 nm calibration standards are used to test the performance of HPICM system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop vibration Isolator</td>
			<td>AMETEK/TMC</td>
			<td>Everstill K-400</td>
			<td>Active vibration isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>Borosilicate glass capillaries for the nanopipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>To be added to the bath solution to adjust osmolarity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>National Instruments Corporation</td>
			<td>PCI-6221</td>
			<td>Multi-channel input/output digitizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast analog Proportional-Integral-Derivative (PID) control for Z movement</td>
			<td>Standford Research Systems</td>
			<td>SIM900, SIM960, SIM980</td>
			<td>Instrumentation modules integrated in an external PID controller for Z movement. It requires a fast response that is usually not implemented in commercial piezo amplifiers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>AMETEK/TMC</td>
			<td>Type II</td>
			<td>Required to shield electromagnetic interference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td>Used as the dish for the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td>Extracellular (bath) solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrumentation amplifier</td>
			<td>Brownlee Precision</td>
			<td>Model 440</td>
			<td>Instrumentation amplifier provides required offsets, filtering, and secondary magnification or attenuation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-based micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2000/G</td>
			<td>Micropipette puller to fabricate the nanopipettes. Laser is needed for sharp quartz pipettes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lebovitz&#39;s L-15, without phenol red</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td>Extracellular (bath) solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>PatchStar</td>
			<td>Used for &#34;course&#34; positioning of the Z piezo actuator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td>Inverted optical microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td>The patch clamp amplifier measures the current through the nanopipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo amplifier (XY axes)</td>
			<td>Physik Instrumente (PI)</td>
			<td>E-500.00, E-505.00, E-509.C2A</td>
			<td>Amplification and PID control for XY piezo translation stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo amplifier (Z axis)</td>
			<td>Piezosystem jena</td>
			<td>ENT 400 &#38; 800</td>
			<td>Custom amplifier consisting of ENT 400 power supply and two ENT 800 amplifiers in parallel to achieve max current of 1.6 nA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Coverslips</td>
			<td>TED PELLA Inc</td>
			<td>26028</td>
			<td>Used in the fabrication of the chambers for the tissue&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SICM controller &#38; software*</td>
			<td>Ionscope, UK (ionscope.com)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom controller based on SBC6711 digital signal processing board from Innovative Integration Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer (Sylgard)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Used to attach the flexible glass fibers to the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon glue</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>734</td>
			<td>Used to glue the different parts of the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten rod</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>717500</td>
			<td>Used for holding the dental floss strands in the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY piezo nanopositioner</td>
			<td>Physik Instrumente (PI)</td>
			<td>P-733.2DD</td>
			<td>XY translation stage with capacitive sensors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z piezo nanopositioner</td>
			<td>Piezosystem jena</td>
			<td>RA 12/24 SG</td>
			<td>Ring piezoactuator with a strain gage sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">*Ionscope does not sell separate SICM controllers anymore. There are few other commercial systems:&#160; NX12-Bio and NX10 SICM,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Park Systems, Korea and SICM modules from ICAPPIC Limited, UK (icappic.com). All these systems are based on the original&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">HPICM principles. However, imaging stereocilia bundles in the hair cells requires several custom modifications that are technically&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">challenging (or even impossible) in the closed &#8220;ready-to-go&#8221; systems such as Ionscope or NX12-Bio/NX10. Currently, there is only one&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">modular system (ICAPPIC) that has the flexibility to suit any SICM/HPICM experiment but requires some component integration.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereocilia bundle imaging with nanoscale resolution in live mammalian auditory hair cells

Indre ørehårceller oppdager lydinduserte forskyvninger og transduserer disse stimuliene til elektriske signaler i en hårbunt som består av stereocilia som er ordnet i rader med økende høyde. Når stereocilia er avbøyd, sleper de på små (~ 5 nm i diameter) ekstracellulære spisskoblinger som kobler sammen stereocilia, som formidler krefter til de mekanosensitive transduksjonskanalene. Selv om mekanaltransduksjon har blitt studert i levende hårceller i flere tiår, kan de funksjonelt viktige ultrastrukturelle detaljene i mekanotransduksjonsmaskineriet på spissene av stereocilia (for eksempel spisskoblingsdynamikk eller transduksjonsavhengig stereocilia-ombygging) fortsatt bare studeres i døde celler med elektronmikroskopi. Teoretisk sett har skannesondeteknikker, for eksempel atomkraftmikroskopi, nok oppløsning til å visualisere overflaten av stereocilia. Men uavhengig av bildemodus skader selv den minste kontakten til atomkraftmikroskopisonden med stereociliabunten vanligvis bunten. Her presenterer vi en detaljert protokoll for hopping sonde ion ledningsmikroskopi (HPICM) avbildning av levende gnagere auditive hårceller. Denne ikke-kontakt skanning sonde teknikken tillater tidsforløp bildebehandling av overflaten av levende celler med en kompleks topografi, som hårceller, med enkelt nanometer oppløsning og uten å gjøre fysisk kontakt med prøven. HPICM bruker en elektrisk strøm som passerer gjennom glass nanopipetten for å oppdage celleoverflaten i nærheten av pipetten, mens et 3D-posisjonerende piezoelektrisk system skanner overflaten og genererer bildet. Med HPICM kunne vi avbilde stereociliabunter og koblingene som knytter stereocilia sammen i levende auditive hårceller i flere timer uten merkbar skade. Vi forventer at bruken av HPICM vil tillate direkte utforskning av ultrastrukturelle endringer i stereocilia av levende hårceller for bedre forståelse av deres funksjon.

Protokollen som presenteres i dette dokumentet, kan brukes til å visualisere alle levende celler med kompleks topografi. Ved å følge disse trinnene får vi rutinemessig bilder av levende rotte auditive hårcellebunter (Figur 6B,D). Til tross for lavere X-Y-oppløsning sammenlignet med SEM-bilder, kan HPICM-bildene våre løse de forskjellige radene med stereocilia, formen på stereociliaspissene og til og med de små koblingene (~ 5 nm i diameter) som forbinder tilstøten...

Watch this Scientific Journal Video about Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells at JoVE.com

Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells

Her presenterer vi en protokoll for Hopping Probe Ion Conductance Microscopy (HPICM), en ikke-kontakt skanning sonde teknikk som tillater nanoskala bildebehandling av stereocilia bunter i levende auditive hårceller.

Stereocilia Bundle Imaging med nanoskala oppløsning i levende pattedyr auditive hårceller

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia ...

Denne praktiske kan hjelpe oss med å studere dynamiske endringer av nanostrukturelle komponenter i det mekaniske elektriske transduksjonsmaskineriet på overflaten av hårcellestereociliabuntene. Den største fordelen med denne teknikken er tidsforløpavbildningen av overflaten av levende celler med kompleks topografi ved enkel nanometeroppløsning, og uten å få fysisk kontakt med prøven. Denne teknikken kan brukes på nesten hvilken som helst levende celle.Vi har tidligere matchet overflaten av lunge epitelcellelinjer infisert med virus, muskelceller, i My Image Bacteria Soon. Test nanopipettene i begynnelsen av hver bildeøkt. Etter å ha produsert en nanopipette, se etter bobler, fjern eventuelle bobler hvis de er til stede, og monter nanopipetten på pipetteholderen for hoppingssondeledningsmikroskop.Ved fire milliliter badeløsning til kammeret og plasser kammeret på HPICM-scenen. Introduser jordelektroden til badeløsningen og sørg for at spenningen som påføres pipetten gjennom patchklemmeforsterkeren er null. Etter å ha plassert mikromanipulatoren i vertikal stilling, flytt pipetten i Z til den berører væsken og sett forsterkerforskyvningen til null, før du legger til pluss 100 millivolt for å sjekke pipettestrømmen.Bruk silisiumlim til å feste AFM-kalibreringsstandarden til kammeret og dekk prøven med fire milliliter HBSS. Bruk dobbeltsidig tape for å feste kammeret til X Y-trinnet i HPICM-oppsettet, og last en ny nanopipette på holderen som vist. Etter å ha testet nanopipettemotstanden og diameteren, sett strømmen til en nanoforsterker.Bruk en grov patch clamp manipulator for å plassere nanopipetten omtrent over midten av kalibreringsstandarden og øke settpunktet mens du overvåker signalet fra sensoren til Z piezo-aktuatoren på et oscilloskop i sanntid. Etter å ha etablert en stabil repeterbar Z-tilnærmingssyklus, reduserer du det innstilte punktet til verdien like over ustabilitetspunktet og flytter pipetten ned med en hastighet på omtrent fem mikron per sekund, til den når prøven. Det nederste nivået på sanntids Z-posisjoneringssignalet vil øke, noe som indikerer at nanopipetten trekkes tilbake på grunn av registrering av prøveoverflaten.På grunn av ujevn montering på AFM-standarden kan det høyeste punktet i interesseområdet være ukjent. Sett derfor amplituden til pipettetrekket til minst 200 til 500 nanometer. Pass på at du ikke overskrider den øvre grensen for Z piezo-aktuatorbevegelsen, begynn å se på bildet med lav oppløsning.Når det høyeste punktet i prøven i bildeområdet er identifisert, reduserer du humleamplituden og trekker pipetten tilbake ca. 200 mikron langs Z-aksen for å forhindre uønsket kollisjon med prøven før du flytter den til et nytt X Y-sted. Når interesseområdet er lokalisert, begynner du å forestille deg med en høyere oppløsning. For auditiv hårcelleavbildning, sikre fast et nyisolert organ av Corti til et kammer ved hjelp av enten tanntråd eller fleksible glasspipetter.Bruk dobbeltsidig tape for å feste kammeret godt til X Y piezo-scenen og last en ny nanopipette på holderen som vist. Etter å ha sjekket nanopipettemotstanden, bruk patchklemmekkromanipulatoren til å plassere nanopipetten over hårcelleområdet mens du observerer organet til Corti X-anlegget i et invertert mikroskop. Registrer, sanntidsstrøm- og Z-posisjoneringssignalet på oscilloskopet for å sjekke om systemet er stabilt med et settpunkt på 0,5%6eller lavere, og bestem det optimale settpunktet og nærme seg prøven som vist.Utfør bildebehandling med lav oppløsning av prøven som vist ved hjelp av en humleamplitude på minst seks til åtte mikron. Hvis nanopipetten må flyttes til et nytt X Y-sted, trekker du pipetten tilbake ca. 500 nanometer for å unngå kollisjon med høye funksjoner i vevet og gjenta HPICM-bildet med lav oppløsning til interesseområdet der hårcellene er plassert. Deretter kan du se for deg interesseområdet med en høyere oppløsning på 15 minutter eller mindre.HPICM-protokollen kan brukes til å visualisere alle levende celler med en kompleks topografi, for eksempel levende rotte auditive hårcellebunter. Til tross for å demonstrere en lavere X Y-oppløsning sammenlignet med skanning av elektronmikroskopibilder, kan HPICM-bilder løse de forskjellige radene i stereocilia. Formen på stereociliaspissene og til og med de små fem nanometerkoblingene som forbinder det tilstøtende stereociliaet.Gitt den ikke-kontaktiske karakteren av HPICM-avbildning, kan kontinuerlig tidsforløpavbildning av samme hårcellebunt utføres i flere timer uten å skade buntens sammenheng. Vær oppmerksom på at systemet med et svært lavt settpunkt kan tolke små svingninger i strømmen som å møte celleoverflaten, noe som fører til hvit punktstøy i bildet. På samme måte kan store humleamplituder øke pipettens laterale resonans, noe som også resulterer i produksjon av støyende piksler.Derimot, hvis hop amplitude er for liten, eller settet er for høyt, nanopipetten kan kollidere med prøven som resulterer i bildeartefakter eller hårbunt skade. Det viktigste å huske når du prøver denne prosedyren er å bruke mindre enn 15 minutter per hårcellebunt når du arbeider med levende celler. Etter å ha fått et bilde av hårbunten, kunne man forsøke å få enkeltkanalopptak fra bestemte steder på overflaten av stereocilia for å svare på spørsmål om mekanalegenskaper.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Høyoppløselige funksjonell magnetisk resonans imaging metoder for Human midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Høy oppløsning Live-Imaging of Cell Behavior i utviklingsland Neuroepithelium

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch Clamp Recordings i Indre ørehår celler isolert fra sebrafisk

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Funksjonell Imaging av auditive cortex hos voksne katter ved hjelp av høy-feltet fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Super-oppløsning Imaging nevrale Dense-core Blemmer

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

Høy oppløsning<em&gt; I Vivo</em&gt; Manuell Segmentering Protokoll for menneskelig hippocampus subfields Bruke 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Optogenetic Stimulering av hørselsnerven

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...