Name: stereocilia bundle imaging with nanoscale resolution in live mammalian auditory hair cells
Uploaded: 2021-01-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells at JoVE.com

Agradecemos ao Prof. Yuri Korchev (Imperial College, Reino Unido) pelo apoio e aconselhamento a longo prazo em todas as etapas do projeto. Agradecemos também aos Drs. Pavel Novak e Andrew Shevchuk (Imperial College, Reino Unido), bem como ao Oleg Belov (National Research Centre for Audiology, Rússia) por sua ajuda no desenvolvimento de software. O estudo foi apoiado pelo NIDCD/NIH (R01 DC008861 e R01 DC014658 a G.I.F.).

O estudo foi realizado de acordo com as recomendações do Guia de Cuidado e Uso de Animais laboratoriais dos Institutos Nacionais de Saúde. Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade de Kentucky (protocolo 00903M2005).
1. Fabricação e teste dos nanopipettos
<ol><li>Crie um programa no puxador de micropipette para obter pipetas com uma resistência entre 200 e 400 MΩ, que corresponde a di...

<ol>
	<li>Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+inner+hair+cell+mechanotransducer+channels+using+high-speed+calcium+imaging.">Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging.</a> Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).</li><li>Effertz, T., Becker, L., Peng, A. W., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositol-4,5-bisphosphate+regulates+auditory+hair-cell+mechanotransduction-channel+pore+properties+and+fast+adaptation.">Phosphoinositol-4,5-bisphosphate regulates auditory hair-cell mechanotransduction-channel pore properties and fast adaptation.</a> The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (48), 11632-11646 (2017).</li><li>Peng, A. W., Gnanasambandam, R., Sachs, F., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+independent+modulation+of+auditory+hair+cell+mechanotransduction+channel+open+probability+implicates+a+role+for+the+lipid+bilayer.">Adaptation independent modulation of auditory hair cell mechanotransduction channel open probability implicates a role for the lipid bilayer.</a> The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (10), 2945-2956 (2016).</li><li>Engstr&#246;m, H., Engstr&#246;m, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+hairs+on+cochlear+sensory+cells.">Structure of the hairs on cochlear sensory cells.</a> Hearing research. 1 (1), 49-66 (1978).</li><li>Conchello, J. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+microscopy.">Optical sectioning microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 920-931 (2005).</li><li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy.">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li><li>W&#228;ldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy.">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348 (2015).</li><li>Pickles, J. O., Comis, S. D., Osborne, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-links+between+stereocilia+in+the+guinea+pig+organ+of+Corti,+and+their+possible+relation+to+sensory+transduction.">Cross-links between stereocilia in the guinea pig organ of Corti, and their possible relation to sensory transduction.</a> Hearing Research. 15 (2), 103-112 (1984).</li><li>Furness, D. N., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-links+between+stereocilia+in+the+guinea+pig+cochlea.">Cross-links between stereocilia in the guinea pig cochlea.</a> Hearing Research. 18 (2), 177-188 (1985).</li><li>Jacobs, R. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+correlates+of+mechanoelectrical+transduction+in+hair+cells+of+the+bullfrog&#8217;s+internal+ear.">Ultrastructural correlates of mechanoelectrical transduction in hair cells of the bullfrog&#8217;s internal ear.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 547-561 (1990).</li><li>Goodyear, R. J., Marcotti, W., Kros, C. J., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+properties+of+stereociliary+link+types+in+hair+cells+of+the+mouse+cochlea.">Development and properties of stereociliary link types in hair cells of the mouse cochlea.</a> The Journal of Comparative Neurology. 485 (1), 75-85 (2005).</li><li>Kachar, B., Parakkal, M., Kurc, M., Zhao, Y., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+structure+of+hair-cell+tip+links.">High-resolution structure of hair-cell tip links.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 13336-13341 (2000).</li><li>V&#233;lez-Ortega, A. C., Freeman, M. J., Indzhykulian, A. A., Grossheim, J. M., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+current+is+essential+for+stability+of+the+transducing+stereocilia+in+mammalian+auditory+hair+cells.">Mechanotransduction current is essential for stability of the transducing stereocilia in mammalian auditory hair cells.</a> eLife. 6, 1-22 (2017).</li><li>Ivanchenko, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+scanning+electron+microscopy+of+anti-PKHD1L1+immuno-gold+labeled+mouse+hair+cell+stereocilia+bundles.">Serial scanning electron microscopy of anti-PKHD1L1 immuno-gold labeled mouse hair cell stereocilia bundles.</a> Scientific Data. 7 (1), 182 (2020).</li><li>Hadi, S., Alexander, A. J., V&#233;lez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-XVa+controls+both+staircase+architecture+and+diameter+gradation+of+stereocilia+rows+in+the+auditory+hair+cell+bundles.">Myosin-XVa controls both staircase architecture and diameter gradation of stereocilia rows in the auditory hair cell bundles.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology JARO. 21 (2), 121-135 (2020).</li><li>Metlagel, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryo-tomography+of+vestibular+hair-cell+stereocilia.">Electron cryo-tomography of vestibular hair-cell stereocilia.</a> Journal of Structural Biology. 206 (2), 149-155 (2019).</li><li>Langer, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+of+individual+stereocilia+of+living+cochlear+hair+cells+by+atomic+force+microscopy.">Mechanical stimulation of individual stereocilia of living cochlear hair cells by atomic force microscopy.</a> Ultramicroscopy. 82 (1-4), 269-278 (2000).</li><li>Dufr&#234;ne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+nanomicrobiology+using+atomic+force+microscopy.">Towards nanomicrobiology using atomic force microscopy.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (9), 674-680 (2008).</li><li>Putman, C. A., van der Werf, K. O., de Grooth, B. G., van Hulst, N. F., Greve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelasticity+of+living+cells+allows+high+resolution+imaging+by+tapping+mode+atomic+force+microscopy.">Viscoelasticity of living cells allows high resolution imaging by tapping mode atomic force microscopy.</a> Biophysical journal. 67 (4), 1749-1753 (1994).</li><li>Gavara, N., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncontact+microrheology+at+acoustic+frequencies+using+frequency-modulated+atomic+force+microscopy.">Noncontact microrheology at acoustic frequencies using frequency-modulated atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 7 (8), 650-654 (2010).</li><li>Cartagena-Rivera, A. X., Van Itallie, C. M., Anderson, J. M., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+surface+supracellular+mechanical+properties+in+polarized+epithelium+using+noninvasive+acoustic+force+spectroscopy.">Apical surface supracellular mechanical properties in polarized epithelium using noninvasive acoustic force spectroscopy.</a> Nature Communications. 8 (1), 1030 (2017).</li><li>Katsuno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRIOBP-5+sculpts+stereocilia+rootlets+and+stiffens+supporting+cells+enabling+hearing.">TRIOBP-5 sculpts stereocilia rootlets and stiffens supporting cells enabling hearing.</a> JCI Insight. 4 (12), (2019).</li><li>Hansma, P. K., Drake, B., Marti, O., Gould, S. A., Prater, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scanning+ion-conductance+microscope.">The scanning ion-conductance microscope.</a> Science. 243 (4891), 641-643 (1989).</li><li>Korchev, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+scanning+ion-conductance+microscope+for+imaging+of+living+cells.">Specialized scanning ion-conductance microscope for imaging of living cells.</a> Journal of Microscopy. 188 (Pt 1), 17-23 (1997).</li><li>Shevchuk, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+proteins+in+membranes+of+living+cells+by+high-resolution+scanning+ion+conductance+microscopy.">Imaging proteins in membranes of living cells by high-resolution scanning ion conductance microscopy.</a> Angewandte Chemie (International ed in English. 45 (14), 2212-2216 (2006).</li><li>Novak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+live-cell+imaging+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy.">Nanoscale live-cell imaging using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Nature Methods. 6 (4), 279-281 (2009).</li><li>V&#233;lez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+live+cochlear+stereocilia+at+a+nanoscale+resolution+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy.">Visualization of live cochlear stereocilia at a nanoscale resolution using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1427, 203-221 (2016).</li><li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+scanning+patch-clamp:+new+insights+into+cell+function.">High-resolution scanning patch-clamp: new insights into cell function.</a> FASEB Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (7), 748-750 (2002).</li><li>Frolenkov, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+recordings+from+the+apical+surface+of+outer+hair+cells+with+a+scanning+ion+conductance+probe.">Single-channel recordings from the apical surface of outer hair cells with a scanning ion conductance probe.</a> Association for Research in Otolaryngology. Abs. 444, (2004).</li><li>S&#225;nchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncontact+measurement+of+the+local+mechanical+properties+of+living+cells+using+pressure+applied+via+a+pipette.">Noncontact measurement of the local mechanical properties of living cells using pressure applied via a pipette.</a> Biophysical Journal. 95 (6), 3017-3027 (2008).</li><li>Korchev, Y. E., Negulyaev, Y. A., Edwards, C. R., Vodyanoy, I., Lab, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+localization+of+single+active+ion+channels+on+the+surface+of+a+living+cell.">Functional localization of single active ion channels on the surface of a living cell.</a> Nature Cell Biology. 2 (9), 616-619 (2000).</li><li>Shevchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angular+approach+scanning+ion+conductance+microscopy.">Angular approach scanning ion conductance microscopy.</a> Biophysical Journal. 110 (10), 2252-2265 (2016).</li><li>Furness, D. N., Katori, Y., Nirmal Kumar, B., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dimensions+and+structural+attachments+of+tip+links+in+mammalian+cochlear+hair+cells+and+the+effects+of+exposure+to+different+levels+of+extracellular+calcium.">The dimensions and structural attachments of tip links in mammalian cochlear hair cells and the effects of exposure to different levels of extracellular calcium.</a> Neuroscience. 154 (1), 10-21 (2008).</li></ol>

Para obter imagens HPICM bem-sucedidas, os usuários precisam estabelecer um sistema de baixa ruído e baixa vibração e fabricar pipetas apropriadas. Recomendamos fortemente o uso de padrões de calibração AFM para testar a estabilidade do sistema antes de tentar realizar qualquer imagem de célula viva. Uma vez que a resolução do sistema é testada, os usuários podem considerar o órgão fixo de imagem das amostras de Corti para se familiarizar com as configurações de imagem antes de tentar qualquer imagem de c...

Apesar do fato de que os feixes de estereocilia nas células ciliadas auditivas são grandes o suficiente para serem visualizados por microscopia óptica e desviados em células vivas em um experimento de grampo de remendo, os componentes estruturais essenciais da máquina de transdução, como as ligações de ponta, poderiam ser visualizados apenas com a microscopia eletrônica em células mortas. Nas células ciliadas auditivas dos mamíferos, o maquinário de transdução está localizado nas extremidades inferiores das pontas, ou seja, nas pontas da linha mais curta esterecilia1 e regulado localmente através da sinalização nas pontas da estereócilia2,3. No entanto, imagens livres de rótulos das estruturas superficiais neste local em células ciliadas vivas não são possíveis devido aos pequenos tamanhos de estereócilia.
A cóclea dos mamíferos tem dois tipos de células sensoriais auditivas: células ciliares internas e externas. Nas células ciliadas internas, estereócilias são mais longas e grossas em comparação com as das células ciliadas externas4. A primeira e segunda fileira de estereócilia têm um diâmetro de 300-500 nm em células ciliadas internas de rato ou rato. Devido à difração da luz, a resolução máxima alcançável com uma microscopia óptica sem rótulos é de aproximadamente 200 nm. Assim, a visualização de estereócilias individuais dentro da primeira e segunda fileiras do feixe de células ciliadas internas é relativamente fácil com microscopia óptica. Em contraste, estereócilias de linha mais curtas nas células ciliadas internas e todos os estereocilias das células ciliadas externas têm diâmetros em torno de 100-200 nm e não podem ser visualizados com microscopia óptica5. Apesar dos recentes progressos em imagens de super resolução, essa limitação fundamental persiste em qualquer imagem óptica livre de rótulos. Todas as técnicas de super-resolução disponíveis comercialmente atuais requerem algum tipo de moléculas fluorescentes6,o que limita suas aplicações. Além das limitações devido à necessidade de moléculas marcadas fluorescentes específicas, a exposição à intensa irradiação de luz tem sido demonstrada para induzir danos celulares e pode influenciar os processos celulares, o que é uma grande desvantagem ao estudar células vivas7.
Nosso conhecimento atual dos detalhes ultraestruturais dos feixes de esterecicia de células ciliares tem sido obtido principalmente com várias técnicas de microscopia eletrônica (EM), como microscopia eletrônica de varredura (SEM), microscopia eletrônica de transmissão (TEM), em11 , fratura congelante, e recentemente com técnicas 3D como seção serial com feixe de íons focado ou tomografia crio-EM8,9,10, 11,12, 13,13 ,13, 14,15,16. Infelizmente, todas essas técnicas EM requerem química ou criofixação da amostra. Dependendo da escala de tempo dos fenômenos, essa exigência torna impossível ou muito trabalhoso um estudo dos processos dinâmicos nas pontas da estereócilia, seja impossível ou muito trabalhoso.
Esforços limitados foram feitos para a imagem de feixes de cabelo de células ciliar vivas com microscopia de força atômica (AFM)17,18. Uma vez que a AFM opera em soluções fisiológicas, poderia, em teoria, visualizar mudanças dinâmicas nos feixes de estereócilia de células ciliadas vivas ao longo do tempo. O problema está nos princípios da AFM de alta resolução, o que implica certo contato físico entre a sonda AFM e a amostra, mesmo no modo menos prejudicial de "tocar"19. Quando a sonda AFM encontra um estereócil, geralmente se depara com ele, danificando a estrutura do feixe de cabelo. Como resultado, essa técnica não é adequada para visualizar células ciliar vivas, ou mesmo fixas, feixes de célulasciliares 17,18. O problema pode ser parcialmente aliviado usando uma grande sonda AFM em forma de bola que impõe apenas forças hidrodinâmicas à superfície da amostra20. No entanto, embora tal sonda seja idealmente adequada para testar propriedades mecânicas da amostra21,ela fornece apenas uma resolução de sub micrômetro ao fotografar o órgão de Corti22 e ainda se aplica à amostra uma força que pode ser substancial para os feixes de estereócilia altamente sensíveis.
A microscopia de condução de íons de varredura (SICM) é uma versão da microscopia da sonda de varredura que usa uma sonda pipeta de vidro preenchida com uma solução condutora23. O SICM detecta a superfície quando a pipeta se aproxima da célula e a corrente elétrica através da pipeta diminui. Uma vez que isso está acontecendo bem antes de tocar a célula, o SICM é ideal para imagens não contato de células vivas na solução fisiológica24. A melhor resolução do SICM está na ordem dos nanômetros únicos, o que permite resolver complexos proteicos individuais na membrana plasmática de uma célula viva25. No entanto, semelhante a outras técnicas de sonda de digitalização, o SICM é capaz de imagem apenas superfícies relativamente planas. Superamos essa limitação inventando microscópio de condução de íons de ânhão de ânion de guinada (HPICM)26, no qual a nanopipette se aproxima da amostra em cada ponto de imagem(Figura 1A). Usando hpicm, conseguimos imaginar feixes de estereocilia em células ciliadas auditivas vivas com resolução nanoescala27.
Outra vantagem fundamental dessa técnica é que o HPICM não é apenas uma ferramenta de imagem. Em contraste com outras técnicas de sonda de varredura, a sonda HPICM/SICM é um eletrodo amplamente utilizado na fisiologia celular para gravações elétricas e entrega local de vários estímulos. A atividade do canal de íons geralmente não interfere com a imagem HPICM, porque a corrente total através da sonda HPICM é várias ordens de magnitude maior do que a corrente extracelular gerada pelos maiores canais deíons 25. No entanto, o HPICM permite um posicionamento preciso da nanopipette sobre uma estrutura de interesse e posterior gravação de grampo de remendo de um canal único a partir desta estrutura28. Foi assim que obtivemos as primeiras gravações preliminares de atividade de canal único nas pontas da estereócilia da célula ciliada29. Vale ressaltar que mesmo uma grande corrente através da nanopipette não pode produzir mudanças significativas do potencial através da membrana plasmática devido ao enorme desvio elétrico do meio extracelular. No entanto, canais de íons individuais podem ser ativados mecanicamente pelo fluxo de líquido através da nanopipette30 ou quimicamente por aplicação local de um agonista31.
No HPICM, a imagem é gerada quando uma nanopipette sequencialmente se aproxima da amostra em um ponto, se retrai e, em seguida, se move na direção lateral para repetir a abordagem(Figura 1A). Um amplificador de remendo aplica constantemente tensão a um fio AgCl na pipeta (Figura 1B) para gerar uma corrente de ~1 nA na solução de banho. O valor dessa corrente quando a pipeta está longe da superfície da célula é determinado como uma corrente de referência (Iref, Figura 1C). Em seguida, a pipeta se move no eixo Z para se aproximar da amostra até que a corrente seja reduzida por uma quantidade predefinida pelo usuário (setpoint), geralmente 0,2%-1% do Iref (Figura 1C, traço superior). O sistema então economiza valor Z neste momento como a altura da amostra, juntamente com coordenadas X e Y deste ponto de imagem. Em seguida, a pipeta é retraída para longe da superfície(Figura 1C, traço inferior) a uma velocidade definida pelo usuário, geralmente 700-900 nm/ms. Após a retração, a pipeta (ou, no nosso caso, a amostra - ver Figura 1B) é movida lateralmente para o próximo ponto de imagem, um novo valor atual de referência é obtido, e a pipeta se aproxima mais uma vez da amostra, repetindo o processo. O movimento X-Y da pipeta é preferido em uma configuração de microscópio vertical que é normalmente usada para gravações das correntes de mecanotransdução das células ciliares. Nesta configuração, a sonda HPICM se aproxima dos feixes de células ciliares não do topo, mas de um ângulo32. No entanto, a melhor resolução da imagem HPICM é alcançada em uma configuração de microscópio invertido (Figura 1A,B), onde o movimento da amostra nas direções X-Y é desacoplado do movimento Z da nanopipette, eliminando assim potenciais artefatos mecânicos.
Usando hpicm, obtivemos imagens topográficas de feixes de esterecilia de células ciliadas internas e externas de ratos, e até visualizamos as ligações entre os estereocilias que têm cerca de 5 nm de diâmetro26,27. O sucesso da imagem do feixe de células ciliares com essa técnica conta com vários fatores. Primeiro, o ruído (variância) da corrente de nanopipette deve ser o menor possível para permitir o menor ponto de configuração possível para imagens HPICM. Um ponto de setpoint baixo permite que a sonda HPICM "sinta" a superfície estereócilia a uma distância maior e em qualquer ângulo para a abordagem da sonda e, surpreendentemente, melhora a resolução X-Y da imagem HPICM (ver Discussão). Em segundo lugar, as vibrações e derivas no sistema devem ser reduzidas para menos de 10 nm, uma vez que contribuem diretamente para os artefatos de imagem. Finalmente, mesmo que a sonda HPICM e o estágio da amostra sejam movidos em eixos Z e X-Y pelos atuadores piezo controlados por feedback calibrado que têm uma precisão de um único nanômetro ou melhor, o diâmetro da ponta de nanopipette determina a propagação da corrente (volume de sensoriamento) e, portanto, a resolução(Figura 1A). Portanto, antes de imaginar células ciliar vivas, é vital puxar as pipetas adequadas, alcançar a resolução desejada com amostras de calibração e obter baixo ruído no sistema de gravação.
Há pelo menos algumas décadas, a técnica sicm não está disponível comercialmente e vem sendo desenvolvida por poucos laboratórios no mundo com o laboratório líder do Prof. Korchev no Imperial College (Reino Unido). Recentemente, vários sistemas SICM tornaram-se comercialmente disponíveis (ver Tabela de Materiais), todos baseados nos princípios originais do HPICM. No entanto, os feixes de esterecilia de imagem nas células ciliadas exigem várias modificações personalizadas que são tecnicamente desafiadoras (ou até mesmo impossíveis) nos sistemas fechados "prontos para ir". Portanto, é necessária alguma integração de componentes. Uma vez que a configuração HPICM representa uma plataforma de fixação com requisitos mais rigorosos de vibração e deriva e um movimento piezo-driven da sonda HPICM e da amostra (Figura 1D), essa integração é relativamente fácil para qualquer pesquisador, que é proficiente em fixação de patches. No entanto, um cientista sem experiência adequada definitivamente precisaria de algum treinamento em eletrofisiologia primeiro. Apesar dos desafios restantes, como o aumento da velocidade da imagem (ver Discussão),temos sido capazes de imaginar feixes de esterecilia em células ciliadas vivas com resolução de nanoescala sem danificá-las.
Este artigo apresenta um protocolo detalhado para realizar imagens hpicm bem sucedidas dos pacotes de células capilares auditivas ao vivo em jovens explants cocleares pós-natal ou rato usando nosso sistema personalizado. Os componentes integrados estão listados na Tabela de Materiais. O artigo também descreve problemas comuns que podem ser encontrados e como solucioná-los.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Analog oscilloscope</td>
			<td>B&#38;K Precision</td>
			<td>2160C</td>
			<td>Analog oscilloscope for real-time monitoring of nanopipette current and Z-axis approach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM calibration standards</td>
			<td>TED PELLA Inc</td>
			<td>HS-100MG; HS-20MG</td>
			<td>These 100 and 20 nm calibration standards are used to test the performance of HPICM system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop vibration Isolator</td>
			<td>AMETEK/TMC</td>
			<td>Everstill K-400</td>
			<td>Active vibration isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>Borosilicate glass capillaries for the nanopipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>To be added to the bath solution to adjust osmolarity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>National Instruments Corporation</td>
			<td>PCI-6221</td>
			<td>Multi-channel input/output digitizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast analog Proportional-Integral-Derivative (PID) control for Z movement</td>
			<td>Standford Research Systems</td>
			<td>SIM900, SIM960, SIM980</td>
			<td>Instrumentation modules integrated in an external PID controller for Z movement. It requires a fast response that is usually not implemented in commercial piezo amplifiers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>AMETEK/TMC</td>
			<td>Type II</td>
			<td>Required to shield electromagnetic interference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td>Used as the dish for the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td>Extracellular (bath) solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrumentation amplifier</td>
			<td>Brownlee Precision</td>
			<td>Model 440</td>
			<td>Instrumentation amplifier provides required offsets, filtering, and secondary magnification or attenuation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-based micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2000/G</td>
			<td>Micropipette puller to fabricate the nanopipettes. Laser is needed for sharp quartz pipettes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lebovitz&#39;s L-15, without phenol red</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td>Extracellular (bath) solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>PatchStar</td>
			<td>Used for &#34;course&#34; positioning of the Z piezo actuator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td>Inverted optical microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td>The patch clamp amplifier measures the current through the nanopipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo amplifier (XY axes)</td>
			<td>Physik Instrumente (PI)</td>
			<td>E-500.00, E-505.00, E-509.C2A</td>
			<td>Amplification and PID control for XY piezo translation stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo amplifier (Z axis)</td>
			<td>Piezosystem jena</td>
			<td>ENT 400 &#38; 800</td>
			<td>Custom amplifier consisting of ENT 400 power supply and two ENT 800 amplifiers in parallel to achieve max current of 1.6 nA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Coverslips</td>
			<td>TED PELLA Inc</td>
			<td>26028</td>
			<td>Used in the fabrication of the chambers for the tissue&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SICM controller &#38; software*</td>
			<td>Ionscope, UK (ionscope.com)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom controller based on SBC6711 digital signal processing board from Innovative Integration Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer (Sylgard)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Used to attach the flexible glass fibers to the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon glue</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>734</td>
			<td>Used to glue the different parts of the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten rod</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>717500</td>
			<td>Used for holding the dental floss strands in the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY piezo nanopositioner</td>
			<td>Physik Instrumente (PI)</td>
			<td>P-733.2DD</td>
			<td>XY translation stage with capacitive sensors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z piezo nanopositioner</td>
			<td>Piezosystem jena</td>
			<td>RA 12/24 SG</td>
			<td>Ring piezoactuator with a strain gage sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">*Ionscope does not sell separate SICM controllers anymore. There are few other commercial systems:&#160; NX12-Bio and NX10 SICM,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Park Systems, Korea and SICM modules from ICAPPIC Limited, UK (icappic.com). All these systems are based on the original&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">HPICM principles. However, imaging stereocilia bundles in the hair cells requires several custom modifications that are technically&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">challenging (or even impossible) in the closed &#8220;ready-to-go&#8221; systems such as Ionscope or NX12-Bio/NX10. Currently, there is only one&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">modular system (ICAPPIC) that has the flexibility to suit any SICM/HPICM experiment but requires some component integration.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereocilia bundle imaging with nanoscale resolution in live mammalian auditory hair cells

As células ciliadas internas detectam deslocamentos induzidos pelo som e transduzem esses estímulos em sinais elétricos em um feixe de cabelo que consiste em estereócilias que são dispostas em fileiras de altura crescente. Quando estereócilia é desviada, elas puxam em minúsculas (~5 nm de diâmetro) elos de ponta extracelular interligando esterecilia, que transmitem forças para os canais de transdução mecanosensíveis. Embora a mecanotransdução tenha sido estudada em células ciliadas vivas há décadas, os detalhes ultraestruturais funcionalmente importantes do maquinário de mecanotransdução nas pontas da estereocilia (como dinâmica de ligação de ponta ou remodelação de estereócilia dependente de transdução) ainda podem ser estudados apenas em células mortas com microscopia eletrônica. Teoricamente, técnicas de sonda de varredura, como microscopia de força atômica, têm resolução suficiente para visualizar a superfície da estereócilia. No entanto, independente do modo de imagem, mesmo o menor contato da sonda de microscopia de força atômica com o feixe de estereócilia geralmente danifica o feixe. Aqui apresentamos um protocolo detalhado para a microscopia de condução de íons de ânhão de ânion de salto (HPICM) de células ciliadas auditivas de roedores vivos. Esta técnica de sonda de varredura sem contato permite imagens de lapso de tempo da superfície de células vivas com uma topografia complexa, como células ciliar, com resolução de nanômetros únicos e sem fazer contato físico com a amostra. O HPICM usa uma corrente elétrica que passa através da nanopipette de vidro para detectar a superfície celular nas proximidades da pipeta, enquanto um sistema piezoelétrico de posicionamento 3D escaneia a superfície e gera sua imagem. Com o HPICM, conseguimos imaginar feixes de estereocilia e os links interligando esterecilia em células ciliadas auditivas ao vivo por várias horas sem danos perceptíveis. Prevemos que o uso do HPICM permitirá a exploração direta de mudanças ultraestruturais na estereócilia das células ciliadas vivas para melhor compreensão de sua função.

O protocolo apresentado neste artigo pode ser usado para visualizar qualquer célula viva com topografia complexa. Seguindo essas etapas, obtém rotineiramente imagens de feixes de células ciliar auditivas de ratos vivos(Figura 6B,D). Apesar de ter resolução X-Y mais baixa quando comparadas às imagens SEM, nossas imagens HPICM podem resolver com sucesso as diferentes linhas de estereócilia, a forma das pontas estereócilias e até mesmo as pequenas ligações (~5 nm de ...

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Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells

Aqui apresentamos um protocolo para a Microscopia de Condução de Íons da Sonda Hopping (HPICM), uma técnica de sonda de varredura sem contato que permite imagens nanoescala de feixes de estereócilia em células ciliadas auditivas vivas.

Imagem do pacote de esterecilia com resolução de nanoescala em células capilares auditivas de mamíferos vivos

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia ...

Este prático pode nos ajudar a estudar mudanças dinâmicas dos componentes nanoestrusivos do maquinário mecânico de transdução elétrica na superfície dos feixes de esterecilia da célula ciliar. A principal vantagem dessa técnica é a imagem de lapso de tempo da superfície das células vivas com topografia complexa em resolução de nanômetros simples, e sem fazer contato físico com a amostra. Esta técnica pode ser aplicada a quase qualquer célula viva.Anteriormente, combinamos com a superfície das linhas de células epiteliais pulmonares infectadas com vírus, células musculares, em My Image Bacteria Soon. Teste os nanopipettos no início de cada sessão de imagem. Depois de fabricar uma nanopipette, verifique se há bolhas, remova quaisquer bolhas se presentes e monte a nanopipette no suporte de pipeta de microscópio de condução da sonda de salto.Em quatro mililitros de solução de banho para a câmara e coloque a câmara no palco HPICM. Introduza o eletrodo moído à solução de banho e certifique-se de que a tensão que está sendo aplicada na pipeta através do amplificador de grampo de remendo é zero. Depois de colocar o micro manipulador na posição vertical, mova a pipeta em Z até que toque o líquido e ajuste o amplificador para zero, antes de adicionar mais 100 milvolts para verificar a corrente da pipeta.Use cola de silicone para anexar o padrão de calibração AFM à câmara e cubra a amostra com quatro mililitros de HBSS. Use fita dupla face para fixar a câmara ao estágio X Y da configuração HPICM e carregue uma nova nanopipette no suporte, conforme demonstrado. Depois de testar a resistência e o diâmetro da nanopipette, defina a corrente para um nano amp.Use um manipulador de grampos grosseiro para posicionar a nanopipette aproximadamente acima do centro do padrão de calibração e aumentar o ponto de ajuste enquanto monitora o sinal do sensor do atuador Z piezo em um osciloscópio em tempo real. Após estabelecer um ciclo de aproximação Z repetitivo estável, diminua o ponto de conjunto para o valor logo acima do ponto de instabilidade e mova a pipeta para baixo a uma velocidade de aproximadamente cinco mícrons por segundo, até chegar à amostra. O nível inferior do sinal de posicionamento Z em tempo real aumentará, indicando que a nanopipette é retirada devido à detecção da superfície da amostra.Devido à montagem desigual no padrão AFM, o ponto mais alto da área de interesse pode ser desconhecido. Por isso, coloque a amplitude da retração da pipeta em pelo menos 200 a 500 nanômetros. Tomando cuidado para não exceder o limite superior do movimento atuador Z piezo, comece a imagem em baixa resolução.Uma vez identificado o ponto mais alto da amostra na área de imagem, diminua a amplitude do lúpulo e retraia a pipeta cerca de 200 mícrons ao longo do eixo Z para evitar qualquer colisão indesejada com a amostra antes de movê-la para um novo local X Y. Quando a área de interesse estiver localizada, comece a fotografar em uma resolução mais elevada. Para imagens auditivas de células ciliares, proteja firmemente um órgão recém-isolado de Corti a uma câmara usando fio dental ou pipetas de vidro flexíveis.Use fita dupla face para fixar firmemente a câmara no estágio X Y piezo e carregar uma nova nanopipette no suporte, como demonstrado. Depois de verificar a resistência à nanopipette, use o micro manipulador de grampos para posicionar a nanopipette sobre a região da célula ciliada enquanto observa o órgão da planta Corti X em um microscópio invertido. Registre, o sinal de posicionamento atual e Z em tempo real no osciloscópio para verificar se o sistema está estável com um ponto de ajuste de 0,5%6 ou mais baixo, e determinar o ponto de ajuste ideal e aproximar-se da amostra como demonstrado.Realize imagens de baixa resolução da amostra como demonstrado usando uma amplitude de lúpulo de pelo menos seis a oito mícrons. Se a nanopipette precisar se mover para um novo local X Y, retraia a pipeta cerca de 500 nanômetros para evitar uma colisão com quaisquer características altas dentro do tecido e repetir a baixa resolução de imagem HPICM até a região de interesse onde as células ciliadas estão localizadas. Em seguida, imagem a região de interesse em uma resolução maior em 15 minutos ou menos.O protocolo HPICM pode ser usado para visualizar quaisquer células vivas com uma topografia complexa, como pacotes de células ciliros auditivas ao vivo. Apesar de demonstrar uma resolução X Y mais baixa em comparação com imagens de microscopia eletrônica, as imagens HPICM podem resolver com sucesso as diferentes linhas de estereócilia. A forma das pontas estereócilias e até mesmo as pequenas ligações de cinco nanômetros que conectam os estereócilias adjacentes.Dada a natureza não-contato da imagem HPICM, a imagem contínua de lapso de tempo do mesmo feixe de células ciliares pode ser realizada por várias horas sem danificar a coesão do feixe. Note que com um set point muito baixo, o sistema pode interpretar pequenas flutuações na corrente como encontrar a superfície celular, levando ao ruído de ponto branco na imagem. Da mesma forma, grandes amplitudes de lúpulo podem aumentar a ressonância lateral da pipeta, resultando também na produção de pixels barulhentos.Em contraste, se a amplitude do lúpulo for muito pequena, ou o setpoint for muito alto, a nanopipette pode colidir com a amostra resultando em artefatos de imagem ou danos no feixe de cabelo. A coisa mais importante a se lembrar ao tentar este procedimento é gastar menos de 15 minutos por feixe de células ciliar ao trabalhar com células vivas. Depois de obter uma imagem do feixe de cabelo, pode-se tentar obter gravações de canal único de locais específicos na superfície da estereócilia para responder perguntas sobre propriedades do canal de mecanotransdução.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Live-imagem de translocação da PKC em células Sf9 e em neurônios sensoriais Aplysia

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Neurociência

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Lapso de tempo de imagens ao vivo de relação clonal células progenitoras neurais no desenvolvimento Zebrafish Encéfalo anterior

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Em células vivas, imagens de células precursoras de órgãos sensoriais na Intact Drosophila As pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

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De alta resolução funcionais Métodos ressonância magnética para Midbrain Humanos

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

De alta resolução de imagem ao vivo de comportamento de células no desenvolvimento neuroepitélio

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

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