Name: stereocilia bundle imaging with nanoscale resolution in live mammalian auditory hair cells
Uploaded: 2021-01-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells at JoVE.com

Agradecemos al Prof. Yuri Korchev (Imperial College, Reino Unido) por el apoyo y asesoramiento a largo plazo en todas las etapas del proyecto. También agradecemos a los Dres. Pavel Novak y Andrew Shevchuk (Imperial College, Reino Unido), así como a Oleg Belov (Centro Nacional de Investigación de Audiología, Rusia) por su ayuda con el desarrollo de software. El estudio fue apoyado por NIDCD/NIH (R01 DC008861 y R01 DC014658 a G.I.F.).

El estudio se realizó de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Kentucky (protocolo 00903M2005).
1. Fabricación y prueba de las nanopipetas
<ol><li>Crear un programa en el extractor de micropipetas para obtener pipetas con una resistencia ent...

<ol>
	<li>Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+inner+hair+cell+mechanotransducer+channels+using+high-speed+calcium+imaging.">Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging.</a> Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).</li><li>Effertz, T., Becker, L., Peng, A. W., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositol-4,5-bisphosphate+regulates+auditory+hair-cell+mechanotransduction-channel+pore+properties+and+fast+adaptation.">Phosphoinositol-4,5-bisphosphate regulates auditory hair-cell mechanotransduction-channel pore properties and fast adaptation.</a> The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (48), 11632-11646 (2017).</li><li>Peng, A. W., Gnanasambandam, R., Sachs, F., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+independent+modulation+of+auditory+hair+cell+mechanotransduction+channel+open+probability+implicates+a+role+for+the+lipid+bilayer.">Adaptation independent modulation of auditory hair cell mechanotransduction channel open probability implicates a role for the lipid bilayer.</a> The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (10), 2945-2956 (2016).</li><li>Engstr&#246;m, H., Engstr&#246;m, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+hairs+on+cochlear+sensory+cells.">Structure of the hairs on cochlear sensory cells.</a> Hearing research. 1 (1), 49-66 (1978).</li><li>Conchello, J. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+microscopy.">Optical sectioning microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 920-931 (2005).</li><li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy.">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li><li>W&#228;ldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy.">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348 (2015).</li><li>Pickles, J. O., Comis, S. D., Osborne, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-links+between+stereocilia+in+the+guinea+pig+organ+of+Corti,+and+their+possible+relation+to+sensory+transduction.">Cross-links between stereocilia in the guinea pig organ of Corti, and their possible relation to sensory transduction.</a> Hearing Research. 15 (2), 103-112 (1984).</li><li>Furness, D. N., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-links+between+stereocilia+in+the+guinea+pig+cochlea.">Cross-links between stereocilia in the guinea pig cochlea.</a> Hearing Research. 18 (2), 177-188 (1985).</li><li>Jacobs, R. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+correlates+of+mechanoelectrical+transduction+in+hair+cells+of+the+bullfrog&#8217;s+internal+ear.">Ultrastructural correlates of mechanoelectrical transduction in hair cells of the bullfrog&#8217;s internal ear.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 547-561 (1990).</li><li>Goodyear, R. J., Marcotti, W., Kros, C. J., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+properties+of+stereociliary+link+types+in+hair+cells+of+the+mouse+cochlea.">Development and properties of stereociliary link types in hair cells of the mouse cochlea.</a> The Journal of Comparative Neurology. 485 (1), 75-85 (2005).</li><li>Kachar, B., Parakkal, M., Kurc, M., Zhao, Y., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+structure+of+hair-cell+tip+links.">High-resolution structure of hair-cell tip links.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 13336-13341 (2000).</li><li>V&#233;lez-Ortega, A. C., Freeman, M. J., Indzhykulian, A. A., Grossheim, J. M., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+current+is+essential+for+stability+of+the+transducing+stereocilia+in+mammalian+auditory+hair+cells.">Mechanotransduction current is essential for stability of the transducing stereocilia in mammalian auditory hair cells.</a> eLife. 6, 1-22 (2017).</li><li>Ivanchenko, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+scanning+electron+microscopy+of+anti-PKHD1L1+immuno-gold+labeled+mouse+hair+cell+stereocilia+bundles.">Serial scanning electron microscopy of anti-PKHD1L1 immuno-gold labeled mouse hair cell stereocilia bundles.</a> Scientific Data. 7 (1), 182 (2020).</li><li>Hadi, S., Alexander, A. J., V&#233;lez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-XVa+controls+both+staircase+architecture+and+diameter+gradation+of+stereocilia+rows+in+the+auditory+hair+cell+bundles.">Myosin-XVa controls both staircase architecture and diameter gradation of stereocilia rows in the auditory hair cell bundles.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology JARO. 21 (2), 121-135 (2020).</li><li>Metlagel, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryo-tomography+of+vestibular+hair-cell+stereocilia.">Electron cryo-tomography of vestibular hair-cell stereocilia.</a> Journal of Structural Biology. 206 (2), 149-155 (2019).</li><li>Langer, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+of+individual+stereocilia+of+living+cochlear+hair+cells+by+atomic+force+microscopy.">Mechanical stimulation of individual stereocilia of living cochlear hair cells by atomic force microscopy.</a> Ultramicroscopy. 82 (1-4), 269-278 (2000).</li><li>Dufr&#234;ne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+nanomicrobiology+using+atomic+force+microscopy.">Towards nanomicrobiology using atomic force microscopy.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (9), 674-680 (2008).</li><li>Putman, C. A., van der Werf, K. O., de Grooth, B. G., van Hulst, N. F., Greve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelasticity+of+living+cells+allows+high+resolution+imaging+by+tapping+mode+atomic+force+microscopy.">Viscoelasticity of living cells allows high resolution imaging by tapping mode atomic force microscopy.</a> Biophysical journal. 67 (4), 1749-1753 (1994).</li><li>Gavara, N., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncontact+microrheology+at+acoustic+frequencies+using+frequency-modulated+atomic+force+microscopy.">Noncontact microrheology at acoustic frequencies using frequency-modulated atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 7 (8), 650-654 (2010).</li><li>Cartagena-Rivera, A. X., Van Itallie, C. M., Anderson, J. M., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+surface+supracellular+mechanical+properties+in+polarized+epithelium+using+noninvasive+acoustic+force+spectroscopy.">Apical surface supracellular mechanical properties in polarized epithelium using noninvasive acoustic force spectroscopy.</a> Nature Communications. 8 (1), 1030 (2017).</li><li>Katsuno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRIOBP-5+sculpts+stereocilia+rootlets+and+stiffens+supporting+cells+enabling+hearing.">TRIOBP-5 sculpts stereocilia rootlets and stiffens supporting cells enabling hearing.</a> JCI Insight. 4 (12), (2019).</li><li>Hansma, P. K., Drake, B., Marti, O., Gould, S. A., Prater, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scanning+ion-conductance+microscope.">The scanning ion-conductance microscope.</a> Science. 243 (4891), 641-643 (1989).</li><li>Korchev, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+scanning+ion-conductance+microscope+for+imaging+of+living+cells.">Specialized scanning ion-conductance microscope for imaging of living cells.</a> Journal of Microscopy. 188 (Pt 1), 17-23 (1997).</li><li>Shevchuk, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+proteins+in+membranes+of+living+cells+by+high-resolution+scanning+ion+conductance+microscopy.">Imaging proteins in membranes of living cells by high-resolution scanning ion conductance microscopy.</a> Angewandte Chemie (International ed in English. 45 (14), 2212-2216 (2006).</li><li>Novak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+live-cell+imaging+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy.">Nanoscale live-cell imaging using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Nature Methods. 6 (4), 279-281 (2009).</li><li>V&#233;lez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+live+cochlear+stereocilia+at+a+nanoscale+resolution+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy.">Visualization of live cochlear stereocilia at a nanoscale resolution using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1427, 203-221 (2016).</li><li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+scanning+patch-clamp:+new+insights+into+cell+function.">High-resolution scanning patch-clamp: new insights into cell function.</a> FASEB Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (7), 748-750 (2002).</li><li>Frolenkov, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+recordings+from+the+apical+surface+of+outer+hair+cells+with+a+scanning+ion+conductance+probe.">Single-channel recordings from the apical surface of outer hair cells with a scanning ion conductance probe.</a> Association for Research in Otolaryngology. Abs. 444, (2004).</li><li>S&#225;nchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncontact+measurement+of+the+local+mechanical+properties+of+living+cells+using+pressure+applied+via+a+pipette.">Noncontact measurement of the local mechanical properties of living cells using pressure applied via a pipette.</a> Biophysical Journal. 95 (6), 3017-3027 (2008).</li><li>Korchev, Y. E., Negulyaev, Y. A., Edwards, C. R., Vodyanoy, I., Lab, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+localization+of+single+active+ion+channels+on+the+surface+of+a+living+cell.">Functional localization of single active ion channels on the surface of a living cell.</a> Nature Cell Biology. 2 (9), 616-619 (2000).</li><li>Shevchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angular+approach+scanning+ion+conductance+microscopy.">Angular approach scanning ion conductance microscopy.</a> Biophysical Journal. 110 (10), 2252-2265 (2016).</li><li>Furness, D. N., Katori, Y., Nirmal Kumar, B., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dimensions+and+structural+attachments+of+tip+links+in+mammalian+cochlear+hair+cells+and+the+effects+of+exposure+to+different+levels+of+extracellular+calcium.">The dimensions and structural attachments of tip links in mammalian cochlear hair cells and the effects of exposure to different levels of extracellular calcium.</a> Neuroscience. 154 (1), 10-21 (2008).</li></ol>

Para obtener imágenes HPICM exitosas, los usuarios deben establecer un sistema de bajo ruido y baja vibración y fabricar pipetas apropiadas. Recomendamos encarecidamente el uso de estándares de calibración AFM para probar la estabilidad del sistema antes de intentar realizar cualquier imagen de células vivas. Una vez que se prueba la resolución del sistema, los usuarios pueden considerar la posibilidad de obtener imágenes de muestras de órganos fijos de Corti para familiarizarse con la configuración de imágenes...

A pesar del hecho de que los haces de estereocilios en las células ciliadas auditivas son lo suficientemente grandes como para ser visualizados por microscopía óptica y desviados en células vivas en un experimento de pinza de parche, los componentes estructurales esenciales de la maquinaria de transducción, como los enlaces de punta, solo se pueden visualizar con la microscopía electrónica en células muertas. En las células ciliadas auditivas de mamíferos, la maquinaria de transducción se encuentra en los extremos inferiores de los enlaces de punta, es decir, en las puntas de los estereocilios de fila más corta1 y se regula localmente a través de la señalización en las puntas de los estereocilios2,3. Sin embargo, las imágenes sin etiquetas de las estructuras superficiales en esta ubicación en las células ciliadas vivas no son posibles debido a los pequeños tamaños de los estereocilios.
La cóclea de mamífero tiene dos tipos de células sensoriales auditivas: células ciliadas internas y externas. En las células ciliadas internas, los estereocilios son más largos y gruesos en comparación con los de las células ciliadas externas4. La primera y segunda fila de estereocilios tienen un diámetro de 300-500 nm en las células ciliadas internas de ratón o rata. Debido a la difracción de la luz, la resolución máxima alcanzable con una microscopía óptica sin etiqueta es de aproximadamente 200 nm. Por lo tanto, la visualización de estereocilios individuales dentro de la primera y segunda fila del haz interno de células ciliadas es relativamente fácil con la microscopía óptica. En contraste, los estereocilios de fila más cortos en las células ciliadas internas y todos los estereocilios de las células ciliadas externas tienen diámetros de alrededor de 100-200 nm y no se pueden visualizar con microscopía óptica5. A pesar del progreso reciente en imágenes de superresolución, esta limitación fundamental persiste en cualquier imagen óptica sin etiquetas. Todas las técnicas actuales de superresolución disponibles comercialmente requieren algún tipo de moléculas fluorescentes6,lo que limita sus aplicaciones. Además de las limitaciones debidas a la necesidad de moléculas específicas marcadas con fluorescencia, se ha demostrado que la exposición a la irradiación de luz intensa induce daño celular y podría influir en los procesos celulares, lo cual es una gran desventaja cuando se estudian células vivas7.
Nuestro conocimiento actual de los detalles ultraestructurales de los haces de estereocilios de células ciliadas se ha obtenido principalmente con diversas técnicas de microscopía electrónica (EM), como la microscopía electrónica de barrido (SEM), la microscopía electrónica de transmisión (TEM), la em de congelación-fractura, y recientemente con técnicas 3D como la sección en serie con haz de iones enfocado o la tomografía crio-EM8,9,10, 11,12,13, 14,15,16. Desafortunadamente, todas estas técnicas EM requieren la criofijación química o criofija de la muestra. Dependiendo de la escala de tiempo de los fenómenos, este requisito hace que un estudio de los procesos dinámicos en las puntas de los estereocilios sea imposible o muy laborioso.
Se han realizado esfuerzos limitados para obtener imágenes de haces de cabello de células ciliadas vivas con microscopía de fuerza atómica (AFM)17,18. Dado que la AFM opera en soluciones fisiológicas, podría, en teoría, visualizar cambios dinámicos en los haces de estereocilios de las células ciliadas vivas a lo largo del tiempo. El problema radica en los principios de la AFM de alta resolución, que implica cierto contacto físico entre la sonda AFM y la muestra, incluso en el modo de "tapping" menos dañino19. Cuando la sonda AFM se encuentra con un estereocilio, generalmente se estrella contra él, dañando la estructura del haz de cabello. Como resultado, esta técnica no es adecuada para visualizar paquetes de células ciliadas en vivo, o incluso fijos,17,18. El problema puede aliviarse parcialmente mediante el uso de una gran sonda AFM en forma de bola que impone solo fuerzas hidrodinámicas a la superficie de la muestra20. Sin embargo, a pesar de que dicha sonda es ideal para probar las propiedades mecánicas de la muestra21,proporciona solo una resolución submicrométrica cuando se obtienen imágenes del órgano de Corti22 y aún aplica a la muestra una fuerza que puede ser sustancial para los haces de estereocilios altamente sensibles.
La microscopía de conductancia iónica de barrido (SICM) es una versión de la microscopía de sonda de barrido que utiliza una sonda de pipeta de vidrio llena de una solución conductora23. SICM detecta la superficie cuando la pipeta se acerca a la celda y la corriente eléctrica a través de la pipeta disminuye. Dado que esto está sucediendo mucho antes de tocar la célula, el SICM es ideal para imágenes sin contacto de células vivas en solución fisiológica24. La mejor resolución de SICM es del orden de nanómetros individuales, lo que permite resolver complejos proteicos individuales en la membrana plasmática de una célula viva25. Sin embargo, al igual que otras técnicas de sonda de escaneo, SICM es capaz de obtener imágenes solo de superficies relativamente planas. Superamos esta limitación inventando el microscopio de conductancia iónica de sonda de salto (HPICM)26,en el que la nanopipeta se acerca a la muestra en cada punto de imagen(Figura 1A). Usando HPICM, pudimos obtener imágenes de haces de estereocilios en células ciliadas auditivas vivas con resolución a nanoescala27.
Otra ventaja fundamental de esta técnica es que HPICM no es solo una herramienta de imagen. A diferencia de otras técnicas de sonda de barrido, la sonda HPICM/SICM es un electrodo ampliamente utilizado en la fisiología celular para registros eléctricos y entrega local de diversos estímulos. La actividad del canal iónico no suele interferir con las imágenes HPICM, porque la corriente total a través de la sonda HPICM es varios órdenes de magnitud mayor que la corriente extracelular generada por los canales iónicos más grandes25. Sin embargo, HPICM permite el posicionamiento preciso de la nanopipeta sobre una estructura de interés y el posterior registro de patch-clamp de un solo canal a partir de esta estructura28. Es así como obtuvimos las primeras grabaciones preliminares de la actividad de un solo canal en las puntas de los estereocilios de células ciliadas externas29. Vale la pena mencionar que incluso una gran corriente a través de la nanopipeta no puede producir cambios significativos del potencial a través de la membrana plasmática debido a la enorme derivación eléctrica del medio extracelular. Sin embargo, los canales iónicos individuales pueden activarse mecánicamente por flujo de líquido a través de la nanopipeta30 o químicamente por aplicación local de un agonista31.
En HPICM, la imagen se genera cuando una nanopipeta se acerca secuencialmente a la muestra en un punto, se retrae y luego se mueve en dirección lateral para repetir el enfoque(Figura 1A). Un amplificador de abrazadera de parche aplica constantemente voltaje a un cable AgCl en la pipeta(Figura 1B)para generar una corriente de ~ 1 nA en la solución de baño. El valor de esta corriente cuando la pipeta está lejos de la superficie de la celda se determina como una corriente de referencia (Iref, Figura 1C). Luego, la pipeta se mueve en el eje Z para acercarse a la muestra hasta que la corriente se reduce en una cantidad predefinida por el usuario (punto de consigna), generalmente 0.2% -1% de la referencia I (Figura 1C,traza superior). A continuación, el sistema guarda el valor Z en este momento como la altura de la muestra, junto con las coordenadas X e Y de este punto de imagen. Luego, la pipeta se retrae lejos de la superficie(Figura 1C,traza inferior) a una velocidad definida por el usuario, generalmente 700-900 nm / ms. Después de la retracción, la pipeta (o, en nuestro caso, la muestra - ver Figura 1B)se mueve lateralmente al siguiente punto de imagen, se obtiene un nuevo valor de corriente de referencia y la pipeta una vez más se acerca a la muestra, repitiendo el proceso. El movimiento X-Y de la pipeta se prefiere en una configuración de microscopio vertical que se utiliza normalmente para las grabaciones de las corrientes de mecanotransducción de células ciliadas. En este entorno, la sonda HPICM se acerca a los haces de células ciliadas no desde la parte superior, sino en un ángulo32. Sin embargo, la mejor resolución de las imágenes HPICM se logra en una configuración de microscopio invertido(Figura 1A,B),donde el movimiento de la muestra en direcciones X-Y se desacopla del movimiento Z de la nanopipeta, eliminando así los posibles artefactos mecánicos.
Usando HPICM, obtuvimos imágenes topográficas de haces de estereocilios de células ciliadas internas y externas de ratones y ratas, e incluso visualizamos los enlaces entre los estereocilios que tienen aproximadamente 5 nm de diámetro26,27. El éxito de las imágenes de paquetes de células ciliadas con esta técnica se basa en varios factores. En primer lugar, el ruido (varianza) de la corriente de nanopipeta debe ser lo más pequeño posible para permitir el punto de ajuste más bajo posible para las imágenes HPICM. Un punto de consigna bajo permite a la sonda HPICM "detectar" la superficie de los estereocilios a una distancia mayor y en cualquier ángulo con respecto al enfoque de la sonda y, sorprendentemente, mejora la resolución X-Y de las imágenes HPICM (consulte discusión). En segundo lugar, las vibraciones y derivas en el sistema deben reducirse a menos de 10 nm, ya que contribuyen directamente a los artefactos de imagen. Finalmente, a pesar de que la sonda HPICM y la etapa de muestra se mueven en ejes Z y X-Y por los actuadores piezoeléctricos calibrados controlados por retroalimentación que tienen una precisión de un solo nanómetro o mejor, el diámetro de la punta de la nanopipeta determina la propagación de la corriente (volumen de detección) y, por lo tanto, la resolución (Figura 1A). Por lo tanto, antes de obtener imágenes de células ciliadas vivas, es vital tirar de las pipetas adecuadas, alcanzar la resolución deseada con muestras de calibración y lograr un bajo nivel de ruido en el sistema de grabación.
Durante al menos un par de décadas, la técnica SICM no ha estado disponible comercialmente y ha sido desarrollada por solo unos pocos laboratorios en el mundo con el laboratorio líder del Prof. Korchev en el Imperial College (Reino Unido). Recientemente, varios sistemas SICM se pusieron a disposición comercial (ver Tabla de Materiales),todos los cuales se basan en los principios originales de HPICM. Sin embargo, los paquetes de estereocilios de imágenes en las células ciliadas requieren varias modificaciones personalizadas que son técnicamente desafiantes (o incluso imposibles) en los sistemas cerrados "listos para usar". Por lo tanto, se necesita cierta integración de componentes. Dado que la configuración de HPICM representa una plataforma de abrazadera de parche con requisitos de vibración y deriva más estrictos y un movimiento piezoeléctrico de la sonda HPICM y la muestra(Figura 1D),esta integración es relativamente fácil para cualquier investigador, que sea competente en el pinzamiento de parches. Sin embargo, un científico sin la formación adecuada definitivamente necesitaría algo de capacitación en electrofisiología primero. A pesar de los desafíos restantes, como el aumento de la velocidad de las imágenes (ver Discusión),hemos podido obtener imágenes de haces de estereocilios en células ciliadas vivas con resolución a nanoescala sin dañarlas.
Este artículo presenta un protocolo detallado para realizar imágenes HPICM exitosas de los haces de células ciliadas auditivas vivas en explantes cocleares de ratas o ratones jóvenes postnatales utilizando nuestro sistema personalizado. Los componentes integrados se enumeran en la Tabla de Materiales. El documento también describe los problemas comunes que se pueden encontrar y cómo solucionarlos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Analog oscilloscope</td>
			<td>B&#38;K Precision</td>
			<td>2160C</td>
			<td>Analog oscilloscope for real-time monitoring of nanopipette current and Z-axis approach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM calibration standards</td>
			<td>TED PELLA Inc</td>
			<td>HS-100MG; HS-20MG</td>
			<td>These 100 and 20 nm calibration standards are used to test the performance of HPICM system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop vibration Isolator</td>
			<td>AMETEK/TMC</td>
			<td>Everstill K-400</td>
			<td>Active vibration isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>Borosilicate glass capillaries for the nanopipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>To be added to the bath solution to adjust osmolarity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>National Instruments Corporation</td>
			<td>PCI-6221</td>
			<td>Multi-channel input/output digitizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast analog Proportional-Integral-Derivative (PID) control for Z movement</td>
			<td>Standford Research Systems</td>
			<td>SIM900, SIM960, SIM980</td>
			<td>Instrumentation modules integrated in an external PID controller for Z movement. It requires a fast response that is usually not implemented in commercial piezo amplifiers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>AMETEK/TMC</td>
			<td>Type II</td>
			<td>Required to shield electromagnetic interference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td>Used as the dish for the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td>Extracellular (bath) solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrumentation amplifier</td>
			<td>Brownlee Precision</td>
			<td>Model 440</td>
			<td>Instrumentation amplifier provides required offsets, filtering, and secondary magnification or attenuation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-based micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2000/G</td>
			<td>Micropipette puller to fabricate the nanopipettes. Laser is needed for sharp quartz pipettes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lebovitz&#39;s L-15, without phenol red</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td>Extracellular (bath) solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>PatchStar</td>
			<td>Used for &#34;course&#34; positioning of the Z piezo actuator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td>Inverted optical microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td>The patch clamp amplifier measures the current through the nanopipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo amplifier (XY axes)</td>
			<td>Physik Instrumente (PI)</td>
			<td>E-500.00, E-505.00, E-509.C2A</td>
			<td>Amplification and PID control for XY piezo translation stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo amplifier (Z axis)</td>
			<td>Piezosystem jena</td>
			<td>ENT 400 &#38; 800</td>
			<td>Custom amplifier consisting of ENT 400 power supply and two ENT 800 amplifiers in parallel to achieve max current of 1.6 nA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Coverslips</td>
			<td>TED PELLA Inc</td>
			<td>26028</td>
			<td>Used in the fabrication of the chambers for the tissue&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SICM controller &#38; software*</td>
			<td>Ionscope, UK (ionscope.com)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom controller based on SBC6711 digital signal processing board from Innovative Integration Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer (Sylgard)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Used to attach the flexible glass fibers to the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon glue</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>734</td>
			<td>Used to glue the different parts of the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten rod</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>717500</td>
			<td>Used for holding the dental floss strands in the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY piezo nanopositioner</td>
			<td>Physik Instrumente (PI)</td>
			<td>P-733.2DD</td>
			<td>XY translation stage with capacitive sensors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z piezo nanopositioner</td>
			<td>Piezosystem jena</td>
			<td>RA 12/24 SG</td>
			<td>Ring piezoactuator with a strain gage sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">*Ionscope does not sell separate SICM controllers anymore. There are few other commercial systems:&#160; NX12-Bio and NX10 SICM,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Park Systems, Korea and SICM modules from ICAPPIC Limited, UK (icappic.com). All these systems are based on the original&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">HPICM principles. However, imaging stereocilia bundles in the hair cells requires several custom modifications that are technically&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">challenging (or even impossible) in the closed &#8220;ready-to-go&#8221; systems such as Ionscope or NX12-Bio/NX10. Currently, there is only one&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">modular system (ICAPPIC) that has the flexibility to suit any SICM/HPICM experiment but requires some component integration.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereocilia bundle imaging with nanoscale resolution in live mammalian auditory hair cells

Las células ciliadas del oído interno detectan los desplazamientos inducidos por el sonido y transducen estos estímulos en señales eléctricas en un haz de cabello que consiste en estereocilios que están dispuestos en filas de altura creciente. Cuando los estereocilios se desvían, tiran de pequeños enlaces de punta extracelular (~ 5 nm de diámetro) que interconectan estereocilios, que transmiten fuerzas a los canales de transducción mecanosensibles. Aunque la mecanotransducción se ha estudiado en células ciliadas vivas durante décadas, los detalles ultraestructurales funcionalmente importantes de la maquinaria de mecanotransducción en las puntas de los estereocilios (como la dinámica del enlace de la punta o la remodelación de los estereocilios dependientes de la transducción) aún se pueden estudiar solo en células muertas con microscopía electrónica. Teóricamente, las técnicas de sonda de barrido, como la microscopía de fuerza atómica, tienen suficiente resolución para visualizar la superficie de los estereocilios. Sin embargo, independientemente del modo de imagen, incluso el más mínimo contacto de la sonda de microscopía de fuerza atómica con el haz de estereocilios generalmente daña el haz. Aquí presentamos un protocolo detallado para la microscopía de conductancia iónica de sonda de salto (HPICM) de imágenes de células ciliadas auditivas de roedores vivos. Esta técnica de sonda de escaneo sin contacto permite obtener imágenes de lapso de tiempo de la superficie de células vivas con una topografía compleja, como las células ciliadas, con una resolución de nanómetros únicos y sin hacer contacto físico con la muestra. El HPICM utiliza una corriente eléctrica que pasa a través de la nanopipeta de vidrio para detectar la superficie de la célula en las proximidades de la pipeta, mientras que un sistema piezoeléctrico de posicionamiento 3D escanea la superficie y genera su imagen. Con HPICM, pudimos obtener imágenes de paquetes de estereocilios y los enlaces que interconectan estereocilios en células ciliadas auditivas vivas durante varias horas sin daños notables. Anticipamos que el uso de HPICM permitirá la exploración directa de los cambios ultraestructurales en los estereocilios de las células ciliadas vivas para una mejor comprensión de su función.

El protocolo presentado en este artículo se puede utilizar para visualizar cualquier célula viva con topografía compleja. Siguiendo estos pasos, obtenemos rutinariamente imágenes de haces de células ciliadas auditivas de ratas vivas(Figura 6B,D). A pesar de tener una resolución X-Y más baja en comparación con las imágenes SEM, nuestras imágenes HPICM pueden resolver con éxito las diferentes filas de estereocilios, la forma de las puntas de los estereocilios e incl...

Watch this Scientific Journal Video about Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells at JoVE.com

Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells

Aquí presentamos un protocolo para la Microscopía de Conductancia Iónica de Sonda de Salto (HPICM), una técnica de sonda de escaneo sin contacto que permite obtener imágenes a nanoescala de haces de estereocilios en células ciliadas auditivas vivas.

Imágenes de paquetes de estereocilios con resolución a nanoescala en células ciliadas auditivas de mamíferos vivos

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia ...

Esta práctica puede ayudarnos a estudiar los cambios dinámicos de los componentes nano estructurales de la maquinaria de transducción eléctrica mecánica en la superficie de los haces de estereocilios de células ciliadas. La principal ventaja de esta técnica es la obtención de imágenes de lapso de tiempo de la superficie de células vivas con topografía compleja a una resolución de un solo nanómetro, y sin hacer contacto físico con la muestra. Esta técnica se puede aplicar a casi cualquier célula viva.Anteriormente emparejamos la superficie de las líneas celulares epiteliales pulmonares infectadas con virus, células musculares, en My Image Bacteria Soon. Pruebe las nanopipetas al comienzo de cada sesión de imágenes. Después de fabricar una nanopipeta, verifique si hay burbujas, elimine las burbujas si están presentes y monte la nanopipeta en el soporte de pipeta del microscopio de conductancia iónica de la sonda de salto.A cuatro mililitros de baño, la solución a la cámara y colocar la cámara en el escenario HPICM. Introduzca el electrodo de tierra en la solución de baño y asegúrese de que el voltaje que se aplica a la pipeta a través del amplificador de abrazadera de parche sea cero. Después de colocar el micromanipulador en la posición vertical, mueva la pipeta en Z hasta que toque el líquido y ajuste el desplazamiento del amplificador a cero, antes de agregar más 100 milivoltios para verificar la corriente de la pipeta.Utilice pegamento de silicio para conectar el estándar de calibración AFM a la cámara y cubra la muestra con cuatro mililitros de HBSS. Utilice cinta de doble cara para asegurar la cámara a la etapa X Y de la configuración de HPICM y cargue una nueva nanopipeta en el soporte como se ha demostrado. Después de probar la resistencia y el diámetro de la nanopipeta, ajuste la corriente a un nano amperios.Utilice un manipulador de abrazadera de parche grueso para colocar la nanopipeta aproximadamente por encima del centro del estándar de calibración y aumentar el punto de ajuste mientras monitorea la señal del sensor del actuador piezoeléctrico Z en un osciloscopio en tiempo real. Después de establecer un ciclo de aproximación Z repetible estable, disminuya el punto de ajuste al valor justo por encima del punto de inestabilidad y mueva la pipeta hacia abajo a una velocidad de aproximadamente cinco micras por segundo, hasta que llegue a la muestra. El nivel inferior de la señal de posicionamiento Z en tiempo real aumentará, lo que indica que la nanopipeta se retira debido a la detección de la superficie de la muestra.Debido al montaje desigual en el estándar AFM, el punto más alto del área de interés puede ser desconocido. Por lo tanto, establezca la amplitud de la retracción de la pipeta en al menos 200 a 500 nanómetros. Teniendo cuidado de no exceder el límite superior del movimiento del actuador piezoeléctrico Z, comience a tomar imágenes a baja resolución.Una vez que se haya identificado el punto más alto de la muestra en el área de imagen, disminuya la amplitud del salto y retraiga la pipeta aproximadamente 200 micras a lo largo del eje Z para evitar cualquier colisión no deseada con la muestra antes de moverla a una nueva ubicación X Y. Cuando se haya localizado el área de interés, comience a tomar imágenes a una resolución más alta. Para las imágenes auditivas de células ciliadas, asegure firmemente un órgano recién aislado de Corti a una cámara utilizando hilo dental o pipetas de vidrio flexibles.Use cinta adhesiva de doble cara para asegurar firmemente la cámara a la etapa piezoeléctrica X Y y cargue una nueva nanopipeta en el soporte como se ha demostrado. Después de verificar la resistencia de la nanopipeta, use el micromanipulador de abrazadera de parche para colocar la nanopipeta sobre la región de las células ciliadas mientras observa el órgano de la planta Corti X en un microscopio invertido. Registre, la señal de corriente en tiempo real y de posicionamiento Z en el osciloscopio para verificar si el sistema es estable con un punto de ajuste de 0.5%6or inferior, y determinar el punto de ajuste óptimo y acercarse a la muestra como se demuestra.Realice imágenes de baja resolución de la muestra, como se demostró utilizando una amplitud de salto de al menos seis a ocho micras. Si la nanopipeta necesita moverse a una nueva ubicación X Y, retraiga la pipeta unos 500 nanómetros para evitar una colisión con cualquier característica alta dentro del tejido y repita las imágenes HPICM de baja resolución hasta la región de interés donde se encuentran las células ciliadas. A continuación, imagine la región de interés a una resolución más alta en 15 minutos o menos.El protocolo HPICM se puede utilizar para visualizar cualquier célula viva con una topografía compleja, como los haces de células ciliadas auditivas de ratas vivas. A pesar de demostrar una resolución X Y más baja en comparación con las imágenes de microscopía electrónica de barrido, las imágenes HPICM pueden resolver con éxito las diferentes filas de estereocilios. La forma de los estereocilios se inclina e incluso los pequeños enlaces de cinco nanómetros que conectan los estereocilios adyacentes.Dada la naturaleza sin contacto de las imágenes HPICM, se pueden realizar imágenes continuas de lapso de tiempo del mismo haz de células ciliadas durante varias horas sin dañar la cohesión del paquete. Tenga en cuenta que con un punto de ajuste muy bajo, el sistema podría interpretar pequeñas fluctuaciones en la corriente como si se encontraran con la superficie de la celda, lo que provocaría un ruido de puntos blancos en la imagen. Del mismo modo, las grandes amplitudes de salto pueden aumentar la resonancia lateral de la pipeta, lo que también resulta en la producción de píxeles ruidosos.Por el contrario, si la amplitud del salto es demasiado pequeña o el punto de consigna es demasiado alto, la nanopipeta podría colisionar con la muestra, lo que provocaría artefactos de imagen o daños en el haz de pelo. Lo más importante que debe recordar al intentar este procedimiento es pasar menos de 15 minutos por paquete de células ciliadas cuando se trabaja con células vivas. Después de obtener una imagen del paquete de cabello, uno podría intentar obtener grabaciones de un solo canal de ubicaciones específicas en la superficie de los estereocilios para responder preguntas sobre las propiedades del canal de mecanotransducción.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

En vivo de imágenes de la translocación de PKC en células Sf9 y en las neuronas sensoriales Aplysia

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Investigación

Neurociencias

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Time-lapse de imágenes en vivo de la relación clonal con células progenitoras neurales en el cerebro anterior El desarrollo de pez cebra

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Células vivas imágenes de células de los órganos sensoriales Precursor en Intacto Drosophila Las pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

De alta resolución Magnética Funcional por imágenes de los métodos de resonancia cerebro medio humano

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Imágenes de alta resolución en vivo del comportamiento de las células en el desarrollo de neuroepitelio

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Grabaciones de patch clamp en Inner células del oído pelo Aislado de pez cebra

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Imágenes funcionales de la corteza auditiva en los gatos adultos el uso de alto campo fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Super-resolución de imagen de Neuronales vesículas de núcleo denso

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

Alta resolución<em&gt; En Vivo</em&gt; Protocolo Segmentación Manual for Human hipocampo subcampos Usando 3T Imágenes por Resonancia Magnética

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Estimulación Optogenética del nervio auditivo

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...