Name: stereocilia bundle imaging with nanoscale resolution in live mammalian auditory hair cells
Uploaded: 2021-01-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells at JoVE.com

Vi tackar prof. Yuri Korchev (Imperial College, Storbritannien) för det långsiktiga stödet och råden i alla skeden av projektet. Vi tackar också Drs. Pavel Novak och Andrew Shevchuk (Imperial College, Storbritannien) samt Oleg Belov (National Research Centre for Audiology, Ryssland) för deras hjälp med mjukvaruutveckling. Studien stöddes av NIDCD/NIH (R01 DC008861 och R01 DC014658 till G.I.F.).

Studien utfördes i enlighet med rekommendationerna i guiden för vård och användning av laboratoriedjur vid National Institutes of Health. Alla djurförsök godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Kentucky (protokoll 00903M2005).
1. Tillverkning och testning av nanopipetter
<ol><li>Skapa ett program i mikropipettens puller för att erhålla pipetter med ett motstånd mellan 200 och 400 MΩ, vilket motsvarar innerspetsdiametrar p...

<ol>
	<li>Beurg, M., Fettiplace, R., Nam, J. H., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+inner+hair+cell+mechanotransducer+channels+using+high-speed+calcium+imaging.">Localization of inner hair cell mechanotransducer channels using high-speed calcium imaging.</a> Nature Neuroscience. 12 (5), 553-558 (2009).</li><li>Effertz, T., Becker, L., Peng, A. W., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositol-4,5-bisphosphate+regulates+auditory+hair-cell+mechanotransduction-channel+pore+properties+and+fast+adaptation.">Phosphoinositol-4,5-bisphosphate regulates auditory hair-cell mechanotransduction-channel pore properties and fast adaptation.</a> The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (48), 11632-11646 (2017).</li><li>Peng, A. W., Gnanasambandam, R., Sachs, F., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+independent+modulation+of+auditory+hair+cell+mechanotransduction+channel+open+probability+implicates+a+role+for+the+lipid+bilayer.">Adaptation independent modulation of auditory hair cell mechanotransduction channel open probability implicates a role for the lipid bilayer.</a> The Journal of Neuroscience the Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (10), 2945-2956 (2016).</li><li>Engstr&#246;m, H., Engstr&#246;m, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+hairs+on+cochlear+sensory+cells.">Structure of the hairs on cochlear sensory cells.</a> Hearing research. 1 (1), 49-66 (1978).</li><li>Conchello, J. A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+microscopy.">Optical sectioning microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 920-931 (2005).</li><li>Sigal, Y. M., Zhou, R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+and+discovering+cellular+structures+with+super-resolution+microscopy.">Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy.</a> Science. 361 (6405), 880-887 (2018).</li><li>W&#228;ldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy.">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348 (2015).</li><li>Pickles, J. O., Comis, S. D., Osborne, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-links+between+stereocilia+in+the+guinea+pig+organ+of+Corti,+and+their+possible+relation+to+sensory+transduction.">Cross-links between stereocilia in the guinea pig organ of Corti, and their possible relation to sensory transduction.</a> Hearing Research. 15 (2), 103-112 (1984).</li><li>Furness, D. N., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-links+between+stereocilia+in+the+guinea+pig+cochlea.">Cross-links between stereocilia in the guinea pig cochlea.</a> Hearing Research. 18 (2), 177-188 (1985).</li><li>Jacobs, R. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+correlates+of+mechanoelectrical+transduction+in+hair+cells+of+the+bullfrog&#8217;s+internal+ear.">Ultrastructural correlates of mechanoelectrical transduction in hair cells of the bullfrog&#8217;s internal ear.</a> Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 55, 547-561 (1990).</li><li>Goodyear, R. J., Marcotti, W., Kros, C. J., Richardson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+properties+of+stereociliary+link+types+in+hair+cells+of+the+mouse+cochlea.">Development and properties of stereociliary link types in hair cells of the mouse cochlea.</a> The Journal of Comparative Neurology. 485 (1), 75-85 (2005).</li><li>Kachar, B., Parakkal, M., Kurc, M., Zhao, Y., Gillespie, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+structure+of+hair-cell+tip+links.">High-resolution structure of hair-cell tip links.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (24), 13336-13341 (2000).</li><li>V&#233;lez-Ortega, A. C., Freeman, M. J., Indzhykulian, A. A., Grossheim, J. M., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanotransduction+current+is+essential+for+stability+of+the+transducing+stereocilia+in+mammalian+auditory+hair+cells.">Mechanotransduction current is essential for stability of the transducing stereocilia in mammalian auditory hair cells.</a> eLife. 6, 1-22 (2017).</li><li>Ivanchenko, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+scanning+electron+microscopy+of+anti-PKHD1L1+immuno-gold+labeled+mouse+hair+cell+stereocilia+bundles.">Serial scanning electron microscopy of anti-PKHD1L1 immuno-gold labeled mouse hair cell stereocilia bundles.</a> Scientific Data. 7 (1), 182 (2020).</li><li>Hadi, S., Alexander, A. J., V&#233;lez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-XVa+controls+both+staircase+architecture+and+diameter+gradation+of+stereocilia+rows+in+the+auditory+hair+cell+bundles.">Myosin-XVa controls both staircase architecture and diameter gradation of stereocilia rows in the auditory hair cell bundles.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology JARO. 21 (2), 121-135 (2020).</li><li>Metlagel, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryo-tomography+of+vestibular+hair-cell+stereocilia.">Electron cryo-tomography of vestibular hair-cell stereocilia.</a> Journal of Structural Biology. 206 (2), 149-155 (2019).</li><li>Langer, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+of+individual+stereocilia+of+living+cochlear+hair+cells+by+atomic+force+microscopy.">Mechanical stimulation of individual stereocilia of living cochlear hair cells by atomic force microscopy.</a> Ultramicroscopy. 82 (1-4), 269-278 (2000).</li><li>Dufr&#234;ne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+nanomicrobiology+using+atomic+force+microscopy.">Towards nanomicrobiology using atomic force microscopy.</a> Nature Reviews Microbiology. 6 (9), 674-680 (2008).</li><li>Putman, C. A., van der Werf, K. O., de Grooth, B. G., van Hulst, N. F., Greve, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelasticity+of+living+cells+allows+high+resolution+imaging+by+tapping+mode+atomic+force+microscopy.">Viscoelasticity of living cells allows high resolution imaging by tapping mode atomic force microscopy.</a> Biophysical journal. 67 (4), 1749-1753 (1994).</li><li>Gavara, N., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncontact+microrheology+at+acoustic+frequencies+using+frequency-modulated+atomic+force+microscopy.">Noncontact microrheology at acoustic frequencies using frequency-modulated atomic force microscopy.</a> Nature Methods. 7 (8), 650-654 (2010).</li><li>Cartagena-Rivera, A. X., Van Itallie, C. M., Anderson, J. M., Chadwick, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+surface+supracellular+mechanical+properties+in+polarized+epithelium+using+noninvasive+acoustic+force+spectroscopy.">Apical surface supracellular mechanical properties in polarized epithelium using noninvasive acoustic force spectroscopy.</a> Nature Communications. 8 (1), 1030 (2017).</li><li>Katsuno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRIOBP-5+sculpts+stereocilia+rootlets+and+stiffens+supporting+cells+enabling+hearing.">TRIOBP-5 sculpts stereocilia rootlets and stiffens supporting cells enabling hearing.</a> JCI Insight. 4 (12), (2019).</li><li>Hansma, P. K., Drake, B., Marti, O., Gould, S. A., Prater, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+scanning+ion-conductance+microscope.">The scanning ion-conductance microscope.</a> Science. 243 (4891), 641-643 (1989).</li><li>Korchev, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+scanning+ion-conductance+microscope+for+imaging+of+living+cells.">Specialized scanning ion-conductance microscope for imaging of living cells.</a> Journal of Microscopy. 188 (Pt 1), 17-23 (1997).</li><li>Shevchuk, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+proteins+in+membranes+of+living+cells+by+high-resolution+scanning+ion+conductance+microscopy.">Imaging proteins in membranes of living cells by high-resolution scanning ion conductance microscopy.</a> Angewandte Chemie (International ed in English. 45 (14), 2212-2216 (2006).</li><li>Novak, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+live-cell+imaging+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy.">Nanoscale live-cell imaging using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Nature Methods. 6 (4), 279-281 (2009).</li><li>V&#233;lez-Ortega, A. C., Frolenkov, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+live+cochlear+stereocilia+at+a+nanoscale+resolution+using+hopping+probe+ion+conductance+microscopy.">Visualization of live cochlear stereocilia at a nanoscale resolution using hopping probe ion conductance microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 1427, 203-221 (2016).</li><li>Gu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+scanning+patch-clamp:+new+insights+into+cell+function.">High-resolution scanning patch-clamp: new insights into cell function.</a> FASEB Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (7), 748-750 (2002).</li><li>Frolenkov, G. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-channel+recordings+from+the+apical+surface+of+outer+hair+cells+with+a+scanning+ion+conductance+probe.">Single-channel recordings from the apical surface of outer hair cells with a scanning ion conductance probe.</a> Association for Research in Otolaryngology. Abs. 444, (2004).</li><li>S&#225;nchez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncontact+measurement+of+the+local+mechanical+properties+of+living+cells+using+pressure+applied+via+a+pipette.">Noncontact measurement of the local mechanical properties of living cells using pressure applied via a pipette.</a> Biophysical Journal. 95 (6), 3017-3027 (2008).</li><li>Korchev, Y. E., Negulyaev, Y. A., Edwards, C. R., Vodyanoy, I., Lab, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+localization+of+single+active+ion+channels+on+the+surface+of+a+living+cell.">Functional localization of single active ion channels on the surface of a living cell.</a> Nature Cell Biology. 2 (9), 616-619 (2000).</li><li>Shevchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angular+approach+scanning+ion+conductance+microscopy.">Angular approach scanning ion conductance microscopy.</a> Biophysical Journal. 110 (10), 2252-2265 (2016).</li><li>Furness, D. N., Katori, Y., Nirmal Kumar, B., Hackney, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dimensions+and+structural+attachments+of+tip+links+in+mammalian+cochlear+hair+cells+and+the+effects+of+exposure+to+different+levels+of+extracellular+calcium.">The dimensions and structural attachments of tip links in mammalian cochlear hair cells and the effects of exposure to different levels of extracellular calcium.</a> Neuroscience. 154 (1), 10-21 (2008).</li></ol>

För att få framgångsrika HPICM-bilder måste användarna upprätta ett system med lågt brus och låg vibration och tillverka lämpliga pipetter. Vi rekommenderar starkt användning av AFM-kalibreringsstandarder för att testa systemets stabilitet innan du försöker utföra någon live cellavbildning. När systemets upplösning har testats kan användare överväga att avbilda fast organ av Corti-prover för att bekanta sig med bildinställningarna innan de försöker någon live-cellavbildning.
<p class="jove_co...

Trots det faktum att stereocilia buntar i hörselhårcellerna är tillräckligt stora för att visualiseras av optisk mikroskopi och avledas i levande celler i ett patch clamp experiment, de väsentliga strukturella komponenterna i återgivningsmaskineriet såsom spetslänkar kunde endast avbildas med elektronmikroskopi i döda celler. I däggdjurssalongens hörselhåriga hårceller är givaren placerad i de nedre ändarna av spetslänkarna, dvs. vid spetsarna på den kortare radstereocilia1 och regleras lokalt genom signalering vid spetsarna av stereocilia2,3. Ändå är etikettfri avbildning av ytstrukturerna på denna plats i levande hårceller inte möjlig på grund av de små storlekarna av stereocilia.
Däggdjurs cochlea har två typer av auditiva sensoriska celler: inre och yttre hårceller. I de inre hårcellerna är stereocilia längre och tjockare jämfört med dem i de yttre hårcellerna4. Den första och andra raden av stereocilia har en diameter på 300-500 nm i mus- eller råtta inre hårceller. På grund av ljusets diffraktion är den maximala upplösningen som kan uppnås med en etikettfri optisk mikroskopi cirka 200 nm. Därför är visualisering av enskilda stereocilier inom första och andra raden i det inre hårcellspaketet relativt enkelt med optisk mikroskopi. Däremot har kortare radstereocilier i de inre hårcellerna och all stereocilia i de yttre hårcellerna diametrar runt 100-200 nm och kan inte visualiseras med optisk mikroskopi5. Trots de senaste framstegen inom superupplösning imaging, denna grundläggande begränsning kvarstår i alla optiska etikett-fria imaging. Alla nuvarande kommersiellt tillgängliga superupplösningstekniker kräver någon form av fluorescerande molekyler6, vilket begränsar deras applikationer. Förutom begränsningar på grund av behovet av specifika fluorescerande märkta molekyler har exponering för intensiv ljusbestrålning visat sig inducera cellskador och kan påverka cellulära processer, vilket är en stor nackdel när man studerar levande celler7.
Vår nuvarande kunskap om de strukturella detaljerna i hårcellstereocilia buntar har erhållits mestadels med olika elektronmikroskopi (EM) tekniker, såsom scanning elektronmikroskopi (SEM), transmission elektronmikroskopi (TEM), frys-fraktur EM, och nyligen med 3D-tekniker såsom seriell sektionering med fokuserad jonstråle eller kryo-EM-tomografi8,9,10,11,12,13, 14,15,16. Tyvärr kräver alla dessa EM-tekniker kemisk eller kryofixering av provet. Beroende på fenomenens tidsskala gör detta krav en studie av de dynamiska processerna vid spetsarna av stereocilia antingen omöjligt eller mycket arbetsintensivt.
Begränsade ansträngningar har gjorts för att avbilda hår buntar av levande hårceller med atomkraftmikroskopi (AFM)17,18. Eftersom AFM arbetar i fysiologiska lösningar kan det i teorin visualisera dynamiska förändringar i stereociliabuntarna av levande hårceller över tid. Problemet ligger i principerna för högupplöst AFM, vilket innebär viss fysisk kontakt mellan AFM-sonden och provet, även i det minst skadliga "tappning" -läget19. När AFM-sonden stöter på ett stereocilium kraschar den vanligtvis mot den och skadar hårbuntens struktur. Som ett resultat är denna teknik inte lämplig för att visualisera levande, eller ens fasta, hårceller buntar17,18. Problemet kan delvis lindras genom att använda en stor kulformad AFM-sond som endast inför hydrodynamiska krafter påprovytan 20. Även om en sådan sond är idealisk för att testa prov21mekaniska egenskaper, ger den dock endast en submikrometerupplösning vid avbildning av corti22-organet och gäller fortfarande för provet en kraft som kan vara betydande för de mycket känsliga stereociliabuntarna.
Scanning jonledningsmikroskopi (SICM) är en version av scanning sondmikroskopi som använder en glaspipett sond fylld med en ledande lösning23. SICM detekterar ytan när pipetten närmar sig cellen och den elektriska strömmen genom pipetten minskar. Eftersom detta händer långt innan du rör vid cellen är SICM idealisk för beröringsfri avbildning av levande celler i fysiologisk lösning24. Den bästa upplösningen av SICM är i ordningen av enstaka nanometer, vilket gör det möjligt att lösa enskilda proteinkomplex vid plasmamembranet i en levande cell25. Men i likhet med andra skanningssondtekniker kan SICM endast avbilda relativt plana ytor. Vi övervann denna begränsning genom att uppfinna hoppningssondjonledningsmikroskop (HPICM)26, där nanopipetten närmar sig provet vid varje bildpunkt (figur 1A). Med hjälp av HPICM kunde vi avbilda stereocilia-buntar i levande hörselhårceller med nanoupplösning27.
En annan grundläggande fördel med denna teknik är att HPICM inte bara är ett bildverktyg. I motsats till andra skanningssondtekniker är HPICM/ SICM-sonden en elektrod som ofta används i cellfysiologi för elektriska inspelningar och lokal leverans av olika stimuli. Jonkanalaktivitet stör vanligtvis inte HPICM-avbildning, eftersom den totala strömmen genom HPICM-sonden är flera storleksordningar större än den extracellulära strömmen som genereras av de största jonkanalerna25. HPICM tillåter dock exakt positionering av nanopipetten över en struktur av intresse och efterföljande enkanalig patchklämmainspelning från denna struktur28. Så här fick vi de första preliminära inspelningarna av enkanalsaktivitet vid spetsarna på den yttre hårcellen stereocilia29. Det är värt att nämna att även en stor ström genom nanopipetten inte kan producera betydande förändringar av potentialen över plasmamembranet på grund av enorm elektrisk shunt av det extracellulära mediet. Enskilda jonkanaler kan dock aktiveras mekaniskt genom vätskeflöde genom nanopipetten30 eller kemiskt genom lokal applicering av en agonist31.
I HPICM genereras bilden när en nanopipette sekventiellt närmar sig provet vid en punkt, drar sig tillbaka och sedan rör sig i lateral riktning för att upprepa tillvägagångssättet (figur 1A). En patchklämmaförstärkare applicerar konstant spänning på en AgCl-tråd i pipetten(figur 1B) för att generera en ström på ~1 nA i badlösningen. Värdet på denna ström när pipetten är borta från cellens yta bestäms som en referensström (Iref, figur 1C). Pipetten flyttas sedan i Z-axeln för att närma sig provet tills strömmen minskas med en mängd som fördefinierats av användaren (börvärde), vanligtvis 0,2%-1% av Iref (bild 1C, toppspårning). Systemet sparar sedan Z-värde just nu som provets höjd, tillsammans med X- och Y-koordinater för denna bildpunkt. Därefter dras pipetten bort från ytan (bild 1C, bottenspår) med en hastighet som definieras av användaren, vanligtvis 700-900 nm/ms. Efter återkallelse flyttas pipetten (eller i vårt fall provet - se figur 1B) i sidled till nästa bildpunkt, ett nytt referensströmvärde erhålls och pipetten närmar sig återigen provet och upprepar processen. Pipettens X-Y-rörelse föredras i en upprätt mikroskopinställning som vanligtvis används för inspelningar av hårcellens mekanotransduktionsströmmar. I den här inställningen närmar sig HPICM-sonden hårcellsbuntarna inte uppifrån utan i en vinkel32. Den bästa upplösningen av HPICM-avbildning uppnås dock i en inverterad mikroskopinställning (figur 1A, B), där provets rörelse i X-Y-riktningar kopplas bort från nanopipettens Z-rörelse, vilket eliminerar potentiella mekaniska artefakter.
Med hjälp av HPICM fick vi topografiska bilder av mus och råtta inre och yttre hårcell stereocilia buntar, och även visualiserade länkarna mellan stereocilia som är ca 5 nm i diameter26,27. Framgången för hårcell bunt imaging med denna teknik beror på flera faktorer. För det första bör nanopipetströmmens brus (varians) vara så litet som möjligt för att möjliggöra lägsta möjliga börvärde för HPICM-avbildning. Ett lågt börvärde gör det möjligt för HPICM-sonden att "känna" stereociliaytan på ett större avstånd och i vilken vinkel som helst mot sondens tillvägagångssätt och förbättrar överraskande X-Y-upplösningen av HPICM-avbildning (se Diskussion). För det andra bör vibrationerna och drivorna i systemet minskas till mindre än 10 nm, eftersom de bidrar direkt till bildföremålen. Slutligen, även om HPICM-sonden och provstadiet flyttas i Z- och X-Y-axlar av de kalibrerade återkopplingskontrollerade piezo-ställdonen som har en noggrannhet på en enda nanometer eller bättre, bestämmer nanopipettspetsens diameter spridningen av strömmen (avkänningsvolymen) och därmed upplösningen (figur 1A). Därför, innan du avbildar levande hårceller, är det viktigt att dra lämpliga pipetter, nå önskad upplösning med kalibreringsprover och uppnå lågt brus i inspelningssystemet.
Under minst ett par decennier har SICM-tekniken inte varit kommersiellt tillgänglig och den har utvecklats av endast få laboratorier i världen med det ledande labbet av Prof. Korchev i Imperial College (UK). Nyligen blev flera SICM-system kommersiellt tillgängliga (se Materialförteckningen), som alla är baserade på de ursprungliga HPICM-principerna. Att avbilda stereociliabuntar i hårcellerna kräver dock flera anpassade modifieringar som är tekniskt utmanande (eller till och med omöjliga) i de slutna "ready-to-go"-systemen. Därför behövs viss komponentintegration. Eftersom HPICM-installationen representerar en patchklämma med strängare vibrations- och driftkrav och en piezodriven rörelse av HPICM-sonden och provet (figur 1D), är denna integration relativt enkel för alla forskare, som är skickliga på patchklämmor. Men en forskare utan ordentlig bakgrund skulle definitivt behöva lite utbildning i elektrofysiologi först. Trots återstående utmaningar som att öka hastigheten på avbildning (se Diskussion) har vi kunnat avbilda stereocilia-buntar i levande hårceller med upplösning i nanoskala utan att skada dem.
Detta dokument presenterar ett detaljerat protokoll för att utföra framgångsrika HPICM imaging av levande auditiva hår cell buntar i unga postnatala råtta eller mus cochlear explants med hjälp av vårt anpassade system. De integrerade komponenterna listas i tabellen över material. I dokumentet beskrivs också vanliga problem som kan uppstå och hur du felsöker dem.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Analog oscilloscope</td>
			<td>B&#38;K Precision</td>
			<td>2160C</td>
			<td>Analog oscilloscope for real-time monitoring of nanopipette current and Z-axis approach</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM calibration standards</td>
			<td>TED PELLA Inc</td>
			<td>HS-100MG; HS-20MG</td>
			<td>These 100 and 20 nm calibration standards are used to test the performance of HPICM system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop vibration Isolator</td>
			<td>AMETEK/TMC</td>
			<td>Everstill K-400</td>
			<td>Active vibration isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td>Borosilicate glass capillaries for the nanopipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>To be added to the bath solution to adjust osmolarity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitizer</td>
			<td>National Instruments Corporation</td>
			<td>PCI-6221</td>
			<td>Multi-channel input/output digitizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast analog Proportional-Integral-Derivative (PID) control for Z movement</td>
			<td>Standford Research Systems</td>
			<td>SIM900, SIM960, SIM980</td>
			<td>Instrumentation modules integrated in an external PID controller for Z movement. It requires a fast response that is usually not implemented in commercial piezo amplifiers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faraday cage</td>
			<td>AMETEK/TMC</td>
			<td>Type II</td>
			<td>Required to shield electromagnetic interference</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>FD5040-100</td>
			<td>Used as the dish for the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td>Extracellular (bath) solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrumentation amplifier</td>
			<td>Brownlee Precision</td>
			<td>Model 440</td>
			<td>Instrumentation amplifier provides required offsets, filtering, and secondary magnification or attenuation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-based micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>P-2000/G</td>
			<td>Micropipette puller to fabricate the nanopipettes. Laser is needed for sharp quartz pipettes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lebovitz&#39;s L-15, without phenol red</td>
			<td>Gibco, Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21083027</td>
			<td>Extracellular (bath) solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>PatchStar</td>
			<td>Used for &#34;course&#34; positioning of the Z piezo actuator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Eclipse TS100</td>
			<td>Inverted optical microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patch amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>Axopatch 200B</td>
			<td>The patch clamp amplifier measures the current through the nanopipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo amplifier (XY axes)</td>
			<td>Physik Instrumente (PI)</td>
			<td>E-500.00, E-505.00, E-509.C2A</td>
			<td>Amplification and PID control for XY piezo translation stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piezo amplifier (Z axis)</td>
			<td>Piezosystem jena</td>
			<td>ENT 400 &#38; 800</td>
			<td>Custom amplifier consisting of ENT 400 power supply and two ENT 800 amplifiers in parallel to achieve max current of 1.6 nA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Coverslips</td>
			<td>TED PELLA Inc</td>
			<td>26028</td>
			<td>Used in the fabrication of the chambers for the tissue&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SICM controller &#38; software*</td>
			<td>Ionscope, UK (ionscope.com)</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Custom controller based on SBC6711 digital signal processing board from Innovative Integration Ltd</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone elastomer (Sylgard)</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>SYLG184</td>
			<td>Used to attach the flexible glass fibers to the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon glue</td>
			<td>The Dow Chemical Company</td>
			<td>734</td>
			<td>Used to glue the different parts of the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten rod</td>
			<td>A-M Systems</td>
			<td>717500</td>
			<td>Used for holding the dental floss strands in the chamber for the tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY piezo nanopositioner</td>
			<td>Physik Instrumente (PI)</td>
			<td>P-733.2DD</td>
			<td>XY translation stage with capacitive sensors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z piezo nanopositioner</td>
			<td>Piezosystem jena</td>
			<td>RA 12/24 SG</td>
			<td>Ring piezoactuator with a strain gage sensor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">*Ionscope does not sell separate SICM controllers anymore. There are few other commercial systems:&#160; NX12-Bio and NX10 SICM,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Park Systems, Korea and SICM modules from ICAPPIC Limited, UK (icappic.com). All these systems are based on the original&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">HPICM principles. However, imaging stereocilia bundles in the hair cells requires several custom modifications that are technically&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">challenging (or even impossible) in the closed &#8220;ready-to-go&#8221; systems such as Ionscope or NX12-Bio/NX10. Currently, there is only one&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">modular system (ICAPPIC) that has the flexibility to suit any SICM/HPICM experiment but requires some component integration.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereocilia bundle imaging with nanoscale resolution in live mammalian auditory hair cells

Innerörat hårceller upptäcker ljudinducerade förskjutningar och omvandlar dessa stimuli till elektriska signaler i ett hårpaket som består av stereocilia som är ordnade i rader med ökande höjd. När stereocilia avböjs rycker de på små (~ 5 nm i diameter) extracellulära spetslänkar som förbinder stereocilia, som förmedlar krafter till de mekanosensitiva flyttningskanalerna. Även om mekanotransduktion har studerats i levande hårceller i årtionden, kan de funktionellt viktiga strukturella detaljerna i mekanotransduktionsmaskineriet vid spetsen av stereocilia (såsom tip link dynamics eller transduction-dependent stereocilia remodeling) fortfarande studeras endast i döda celler med elektronmikroskopi. Teoretiskt sett har skanningssondtekniker, såsom atomkraftmikroskopi, tillräckligt med upplösning för att visualisera ytan av stereocilia. Men oberoende av bildframställningsläge skadar även den minsta kontakten av atomkraftmikroskopisonden med stereocilia-bunten vanligtvis bunten. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för hopping sond jonledning mikroskopi (HPICM) imaging av levande gnagare auditiva hårceller. Denna beröringsfria skanningssondteknik möjliggör tidsfördröjning av ytan av levande celler med en komplex topografi, som hårceller, med en enda nanometerupplösning och utan att göra fysisk kontakt med provet. HPICM använder en elektrisk ström som passerar genom glasnanopipetten för att upptäcka cellytan i närheten av pipetten, medan ett 3D-positionerande piezoelektriskt system skannar ytan och genererar dess bild. Med HPICM kunde vi avbilda stereocilia buntar och länkarna sammankopplade stereocilia i levande auditiva hårceller i flera timmar utan märkbar skada. Vi förväntar oss att användningen av HPICM kommer att möjliggöra direkt utforskning av strukturella förändringar i stereocilia av levande hårceller för bättre förståelse av deras funktion.

Protokollet som presenteras i detta dokument kan användas för att visualisera alla levande celler med komplex topografi. Efter dessa steg får vi rutinmässigt bilder av levande råtta auditiva hårcellsbuntar(Figur 6B, D). Trots att vi har lägre X-Y-upplösning jämfört med SEM-bilder kan våra HPICM-bilder framgångsrikt lösa de olika raderna av stereocilia, formen på stereociliaspetsarna och till och med de små länkarna (~ 5 nm i diameter) som förbinder intilligg...

Watch this Scientific Journal Video about Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells at JoVE.com

Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells

Här presenterar vi ett protokoll för Hopping Probe Ion Conductance Microscopy (HPICM), en beröringsfri skanningssondteknik som möjliggör nanoskala av avbildning av stereocilia-buntar i levande hörselhårceller.

Stereocilia Bundle Imaging med upplösning i nanoskala i levande däggdjurs auditiva hårceller

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia ...

Detta praktiska kan hjälpa oss att studera dynamiska förändringar av nanostrukturkomponenterna i den mekaniska elektriska flyttningsmaskineriet vid ytan av hårcellsstereociliabuntar. Den största fördelen med denna teknik är tidsfördröjningsavbildningen av ytan av levande celler med komplex topografi vid en enda nanometerupplösning och utan att få fysisk kontakt med provet. Denna teknik kan tillämpas på nästan alla levande celler.Vi matchade tidigare ytan av lung epitelial cellinjer infekterade med virus, muskelceller, i Min bild bakterier snart. Testa nanopipetterna i början av varje bildbehandlingssession. Efter att ha tillverkat en nanopipette, kontrollera om det finns bubblor, ta bort eventuella bubblor om det finns och montera nanopipetten på hoppsondjonledningsmikroskoppipettens hållare.Vid fyra milliliter badlösning till kammaren och placera kammaren på HPICM-scenen. Introducera jordelektroden till badlösningen och se till att spänningen som appliceras på pipetten genom plåsterklämmaförstärkaren är noll. När du har placerat mikromanipulatorn i vertikalt läge, flytta pipetten i Z tills den vidrör vätskan och ställ in förstärkarens förskjutning till noll, innan du lägger till plus 100 millivolt för att kontrollera pipettströmmen.Använd silikonlim för att fästa AFM-kalibreringsstandarden i kammaren och täck provet med fyra milliliter HBSS. Använd dubbelhäftande tejp för att fästa kammaren i X Y-stadiet i HPICM-installationen och ladda en ny nanopipett på hållaren enligt vad som visas. Efter att ha testat nanopipettens motstånd och diameter ställer du in strömmen på en nanoförstärkare.Använd en manipulator för grov plåsterklämma för att placera nanopipetten ungefär ovanför kalibreringsstandardens mittpunkt och öka intningen samtidigt som du övervakar signalen från Z piezo-ställdonets sensor på ett oscilloskop i realtid. Efter att ha etablerat en stabil repeterbar Z-inflygningscykel, minska börvärdet till värdet strax ovanför instabilitetspunkten och flytta pipetten ner med en hastighet av cirka fem mikron per sekund tills den når provet. Bottennivån för Z-positioneringssignalen i realtid kommer att öka, vilket indikerar att nanopipetten dras tillbaka på grund av att provytan känner av.På grund av ojämn montering på AFM-standarden kan den högsta punkten i intresseområdet vara okänd. Ställ därför in amplituden för pipettens upprullning på minst 200 till 500 nanometer. Var försiktig så att du inte överskrider den övre gränsen för Z piezo-ställdonsrörelsen, börja avbilda vid låg upplösning.När provets högsta punkt i bildområdet har identifierats, minska humleamplituden och dra tillbaka pipetten cirka 200 mikron längs Z-axeln för att förhindra oönskad kollision med provet innan du flyttar den till en ny X Y-plats. När intresseområdet har lokaliserats, börja avbildning med högre upplösning. För auditiv hårcellsavbildning, säkra fast ett nyisolerat organ av Corti till en kammare med antingen tandtråd eller flexibla glaspipetter.Använd dubbelhäftande tejp för att ordentligt fästa kammaren på X Y piezo-scenen och ladda en ny nanopipett på hållaren enligt vad som visas. Efter att ha kontrollerat nanopipettens motstånd, använd patchklämma mikro manipulatorn för att placera nanopipetten över hårcellsregionen medan du observerar Corti X-växtens organ i ett inverterat mikroskop. Registrera, realtidsströmmen och Z-positioneringssignalen på oscilloskopet för att kontrollera om systemet är stabilt med en börspunkt på 0,5%6or lägre och bestämma den optimala börspunkten och närma sig provet enligt vad som visas.Utför lågupplöst avbildning av provet enligt en humle amplitud på minst sex till åtta mikron. Om nanopipetten behöver flyttas till en ny X Y-plats, dra tillbaka pipetten ca 500 nanometer för att undvika en kollision med några höga funktioner i vävnaden och upprepa den lågupplösta HPICM-avbildningen tills den region av intresse där hårcellerna är belägna. Avbilda sedan den intressanta regionen med en högre upplösning på 15 minuter eller mindre.HPICM-protokollet kan användas för att visualisera alla levande celler med en komplex topografi, till exempel levande råtta auditiva hårcellsbuntar. Trots att hpicm-bilder visar en lägre X Y-upplösning jämfört med att skanna elektronmikroskopibilder kan hpicm-bilder framgångsrikt lösa de olika raderna av stereocilia. Formen på stereociliaspetsarna och till och med de små fem nanometerlänkarna som förbinder den intilliggande stereocilia.Med tanke på hpicm-avbildningens kontaktfria karaktär kan kontinuerlig tidsfördröjning av samma hårcellsbunt utföras i flera timmar utan att skada buntsammanhållningen. Observera att systemet med en mycket låg börspunkt kan tolka små fluktuationer i strömmen som att de stöter på cellytan, vilket leder till vitt punktbrus i bilden. På samma sätt kan stora humleamplituder öka pipettens laterala resonans, vilket också resulterar i produktion av bullriga pixlar.Om humleamplitituden däremot är för liten eller börvärdet är för högt, kan nanopipetten kollidera med provet, vilket resulterar i bildetefakter eller hårbuntsskador. Det viktigaste att komma ihåg när du försöker denna procedur är att spendera mindre än 15 minuter per hårcellsbunt när du arbetar med levande celler. Efter att ha fått en bild av hårbunten kan man försöka få inspelningar med en kanal från specifika platser på ytan av stereocilia för att svara på frågor om egenskaper hos mekanotransduktionskanaler.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Live-avbildning av PKC translokation hos Sf9 celler och i Aplysia sensoriska neuroner

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Time-lapse Live avbildning av kloner som är närbesläktade neurala stamceller i utvecklingsländerna Zebrafish framhjärnan

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell imaging av sensoriska celler orgel Precursor i intakt Drosophila Puppor

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Högupplösta functional magnetic resonance imaging metoder för Human mitthjärnan

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Högupplöst Live avbildning av cellens beteende i utvecklingsländerna neuroepitelet

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp inspelningar i Inre celler öronhår isolerad från Zebrafish

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Funktionell avbildning av hörselbarken hos vuxna katter med hjälp av hög-fält fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Super-upplösning avbildning av neurala Tät-core Blåsor

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

High-resolution In Vivo Manual Segmentation Protocol for Human Hippocampal Subfields Using 3T Magnetic Resonance Imaging

Hög upplösning<em&gt; In Vivo</em&gt; Manuell segmente Protocol for Human hippocampus delområden Använda 3T Magnetic Resonance Imaging

The human hippocampus has been broadly studied in the context of memory and normal brain function and its role in different neuropsychiatric disorders has ...

Optogenetic Stimulation of the Auditory Nerve

Optogenetic Stimulering av hörselnerven

Direct electrical stimulation of spiral ganglion neurons (SGNs) by cochlear implants (CIs) enables open speech comprehension in the majority of implanted ...