Name: optimized incorporation of alkynyl fatty acid analogs for the detection of fatty acylated proteins using click chemistry
Uploaded: 2021-04-09T14:00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل من قبل المجلس الوطني لبحوث العلوم والهندسة (NSERC; RGPIN-2019-04617). تم تمويل لوسيا لياو من قبل منحة رام وليخا تومكور التذكارية من خلال قسم علم الأحياء في جامعة واترلو ، ومنحة لوسي موريسون التذكارية من خلال IODE Ontario ، بالإضافة إلى تمويل أبحاث الدراسات العليا من جامعة واترلو التي تضم منحة أبحاث الدراسات العليا (50503-11072) ، وجائزة الدراسات العليا للعلوم ، ومساعدة تدريس الدراسات العليا. يود المؤلفون أن يشكروا جميع أعضاء مختبر مارتن على دعمهم في إعداد هذه المخطوطة، وخاصة ستيفاني ريال، وهارلين جيل، وساديا خان الذين ساعدوا في البداية في إنشاء مختبر مارتن استعدادا لهذه الدراسات. يود المؤلفون أيضا أن يشكروا الدكتور لوك بيرثيوم على الهدية الكريمة لهياكل ctHTT-GFP والدكتور شون ساندرز على المدخلات النقدية في إعداد المخطوطة. تم إنشاء الشكل 3 باستخدام BioRender.com.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

يمكن أن تؤدي الإضافة المباشرة للأحماض الدهنية إلى الخلايا في الثقافة إلى عدم الذوبان ، وهطول الأمطار من الدهون ، والسمية الشحمية40. وبالتالي ، فإن إضافة الأحماض الدهنية مباشرة إلى الخلايا قد لا يؤدي فقط إلى ضعف امتصاص الخلايا وانخفاض توافر ملصق الأحماض الدهنية ، ولكن أيضا انخفاض عدد الخلايا القابلة للحياة للتحليل النهائي ، وكذلك تنشيط المسارات خارج الهدف. ومع ذلك ، فإن العديد من بروتوكولات وضع العلامات الأيضية للكشف عن كيمياء النقر تتضمن إضافة مباشرة للأحماض الدهنية وعدد كبير من دراسات بالميتويل بروتينيوم باستخدام الكشف عن كيمياء النقر حتى الآن نادرا ما تصبن ملصقات الأحماض الدهنية أو تحتضنها باستخدام BSA8,36. من المهم النظر في حقيقة أن كفاءة وحساسية الكشف عن كيمياء النقر للبروتينات الدهنية الأسيلات تعتمد على امتصاص خلوي كاف لنظائرها من الأحماض الدهنية. لذلك ، من المعقول التكهن بأن العديد من البروتينات الأسيلية S قد تكون قد أفلتت من الكشف عنها في الدراسات البروتينية بسبب انخفاض توافر ملصقات الأحماض الدهنية من ضعف الدمج في الخلايا ، خاصة عند استخدام الحمض الدهني ذي السلسلة الأطول 17-ODYA. 17-ODYA، أو ألكينيل ستيرات، كانت العلامة المفضلة على نطاق واسع للعديد من الدراسات بسبب توافرها تجاريا واستخدامها في وقت مبكر8،36. ومع ذلك ، تظهر نتائج هذا البروتوكول أن تصبن 17-ODYA يؤدي إلى أكبر زيادة في الكشف عن بروتينات S-acylated ، مقارنة بالأحماض الدهنية ذات السلسلة الأقصر مثل Palmitate أو myristate. لذلك ، قد يؤدي تكرار هذه التجارب باستخدام ملصقات التصبن إلى ظهور ركائز إضافية من S-acylation التي ربما تم تجاهلها سابقا. علاوة على ذلك ، في حين أن معظم بالميتويل أسيل ترانسفيراز تفضل البالميتات ل S-acylation ، فإن البعض لديهم تفضيلات لأطوال أخرى من الأحماض الدهنية مثل ستيرات15،38،44. بالإضافة إلى ذلك ، تفضل بعض البروتينات أو حتى مواقع محددة داخل البروتينات حمضا دهنيا واحدا على آخر15,45. لذلك ، قد يكون للدراسات التي تستخدم 17-ODYA تحيز نحو البروتينات S-acylated مع ستيرات ، وليس بالميتات ، في حين أن تمثيل تلك البروتينات أقل بسبب انخفاض الكشف.
تعتمد كفاءة وضع العلامات الأيضية المحسنة لكيمياء النقر على تصبن الدهون والحضانة بخطوات FAFBSA ، بالإضافة إلى FBS المنزوع الدهون. يجب أن تكون جميع الأحماض الدهنية مصابنة تماما في KOH مع عدم وجود مواد صلبة مرئية متبقية قبل الشروع في الحضانة مع FAFBSA. يمكن أن تكون هذه خطوة صعبة والتوقيت أمر بالغ الأهمية. بعد أن تدخل الأحماض الدهنية الصابونية في محلول عند 65 درجة مئوية ، أضف BSA الدافئ على الفور لأن المزيد من التسخين سيؤدي إلى تبخر DMSO من الأحماض الدهنية. بالإضافة إلى ذلك ، سيبدأ الملصق الصابوني في إعادة التصلب بمجرد أن يبدأ في التبريد. لذلك ، يجب أن يكون FAFBSA دافئا ويضاف بسرعة بعد أن يصبح الملح قابلا للذوبان. قوارير التفاعل الزجاجية ، وشكلها مهمة لهذه الخطوة. فهي تسمح للدهون الصابونية بأن تكون دافئة بما يكفي لتظل قابلة للذوبان ، بينما تكون باردة بما يكفي لضمان عدم احتكاك FAFBSA. يعد الخلط الكافي عن طريق السحب مهما أيضا في هذه الخطوة لضمان حل متجانس لوضع العلامات.
يجب تخزين كواشف كيمياء النقر بشكل صحيح ، عادة مع المجففات أو تحت غاز N2 أو Ar عند -20 درجة مئوية إلى -80 درجة مئوية. قد يكون عدم وجود إشارة أسيلات أو إشارة ضعيفة بسبب الكواشف غير المستقرة ، وخاصة حلول TBTA و azide الأقدم للمخزون. علاوة على ذلك ، يجب توخي الحذر مع حلول مخزون أزيد الفلورسنت ، والتي تحتاج إلى الحماية من الضوء قدر الإمكان. بالإضافة إلى ذلك ، قد تحتاج المتغيرات مثل طريقة الحرمان من الدهون ووقت وضع العلامات إلى الاختبار لتحديد الظروف المثلى اعتمادا على نوع الخلية المستخدمة. على سبيل المثال ، قد تحتاج الخلايا العصبية إلى أوقات أطول لوضع العلامات لأن تغيرات الوسائط والحرمان من الدهون صعبة (غير منشورة).
فائدة هذا البروتوكول هي الأكثر دراماتيكية عند استخدامها للأحماض الدهنية طويلة السلسلة. بالنسبة للسلاسل الأقصر ، تصبح الزيادة في شدة الإشارة أقل دراماتيكية ، ولكنها لا تزال على الأرجح واقية للخلايا. في حين أن التعديلات المقترحة ستحسن الكشف عن أسيل البروتين بشكل عام، إلا أن كيمياء النقر لا تزال تعتبر طريقة تتمحور حول الدهون1 تقتصر على الكشف عن البروتينات الأسيلية S-acylated ديناميكيا وليس بشكل ثابت1. وتشمل القيود الأخرى التي يجب مراعاتها شرط الحرمان من الأحماض الدهنية لتعزيز وضع العلامات، ونطاقه المحدود نسبيا من أنواع الخلايا المتوافقة عند مقارنته بالكشف عن تبادل الأسيل والبيوتين (ABE) ل S-acylation16. على الرغم من هذه القيود ، فإن اكتشاف كيمياء النقر أسرع من معظم اختبارات تبادل الأسيل وهو أكثر ملاءمة للكشف عن البروتينات التي لا تتسامح مع خطوات هطول الأمطار المتكررة للبروتين المطلوبة لاختبارات تبادل الأسيل . بالإضافة إلى ذلك، يمكن دمج هذا النهج مع وضع العلامات في وقت واحد باستخدام مقايسات نقر أخرى مثل تحليل مطاردة النبض38.
أدى استخدام هذا التعديل لوضع العلامات الأيضية لكيمياء النقر إلى زيادة الكشف الكلي عن البروتينات الأسيلية ، وخاصة S-acylated ، مع مجموعة متنوعة من التقنيات البروتينية التي تستخدم بالاقتران مع كيمياء النقر. كما هو موضح ، يمكن استخدام الكشف الفلوروجيني كبديل للبيوتين (الشكل 1) 28. هذا مفيد بشكل خاص لأنه لا توجد بروتينات فلورية داخلية في الليزات الخلوية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الفلوروفورات التي يتم تنشيطها فقط بعد كيمياء النقر46. يمكن أن يساعد الأحماض الدهنية الصابونية والمرتبطة ب FAFBSA لوضع العلامات على كيمياء النقر في التغلب على الصعوبات في اكتشاف البروتينات ذات الأهمية بسبب الزيادة الإجمالية في كمية الملصق المتاحة في الخلية وعن طريق الحد من الآثار السامة لإضافة الأحماض الدهنية مباشرة إلى الوسائط. كما يمكن استخدامه بالاقتران مع قياس الطيف الكتلي27 لزيادة الكشف عن البروتينات منخفضة الوفرة، خاصة عندما تؤخذ جنبا إلى جنب مع التقدم الأخير باستخدام خوارزميات التعلم الآلي التي تمنع القياسات الزائدة عن الحاجة لزيادة الحساسية للبروتينات منخفضة الوفرة، بدلا من الاكتساب الحالي المعتمد على البيانات الذي يفضل الكشف عن البروتينات الأكثر وفرة47 . بالإضافة إلى ذلك، يمكن دمج كيمياء النقر مع وضع العلامات المستقرة على النظائر مع الأحماض الأمينية في زراعة الخلايا (SILAC) وطرق مطاردة النبض لإنتاج بيانات قابلة للقياس الكمي عن البروتين الديناميكي S-acylation27. وأخيرا، جمعت مجموعة حنوش بين كيمياء النقر وفحص ربط القرب (PLA) للسماح بالتصور أحادي الخلية والفحوصات في التوزيع تحت الخلوي للبروتينات النخيلية43,48.

يتضمن الأسيل الدهني الإضافة التساهمية للأحماض الدهنية إلى البروتينات وهو معروف جيدا بأهميته في تعزيز التفاعلات بين البروتين والغشاء ولكن ثبت أيضا أنه يعزز التفاعلات بين البروتين والبروتين ، والتغيرات التوافقية ، وينظم المواقع الحفازة للإنزيمات1،2،3،4،5،6،7 . وقد برز الأسيل الدهني كهدف دوائي محتمل في عدد لا يحصى من الأمراض، بما في ذلك العدوى والسرطان والالتهابات والتنكس العصبي، حيث تم توثيق الاضطرابات في بالميتويلاتيون8،9،10،11،12،13. وقد حفز ذلك في المقام الأول تطوير طرق جديدة للكشف عن المواد الكيميائية، مما مكن من تحديد أهداف البروتين الأسيل S على نطاق واسع.
يمكن أن يشمل الأسيل الدهني مجموعة متنوعة من التعديلات التي تنطوي على إضافة تساهمية للأحماض الدهنية المشبعة وغير المشبعة ، ولكنها تشير عادة إلى N-myristoylation و S-acylation. يشير N-myristoylation إلى إضافة حمض الميريستيك إلى الجلايسينات الطرفية N إما بشكل مشترك على الببتيدات المتعددة الناشئة أو بعد الترجمة على الجلايسينات N-terminal المكشوفة حديثا بعد الانقسام البروتيني 2,14. N-myristoylation يحدث من خلال رابطة أميد لا رجعة فيها. من ناحية أخرى ، يشير S-acylation عادة إلى الإضافة القابلة للانعكاس للأحماض الدهنية طويلة السلسلة إلى بقايا السيستين عبر رابطة الثيوستر. يتضمن الشكل الأكثر شيوعا لهذا التعديل دمج البالميتات ، وبالتالي ، يشار إليه عادة باسم S-palmitoylation ، أو ببساطة palmitoylation11,15. من نواح كثيرة ، يشبه S-palmitoylation الفسفرة. إنه ديناميكي ، منظم إنزيميا ، ويثبت أنه قابل للسحب للغاية.
حتى العقد الماضي ، كانت دراسة الأسيل الدهني تعوقها طرق الكشف المحدودة ، والتي تتطلب الأحماض الدهنية المصنفة إشعاعيا. كان لهذا العديد من العيوب ، بما في ذلك التكلفة وقضايا السلامة وأوقات الكشف الطويلة جدا. عادة ، تم استخدام إما بالميتات مثلثة أو باليود للكشف عن S-acylation16. يتطلب البالميتات المثلثة فترات كشف طويلة باستخدام فيلم التصوير الشعاعي الذاتي ، والذي يمكن أن يستغرق أسابيع إلى أشهر. في حين أن نظائر الأحماض الدهنية اليودو [125I] قصرت أوقات الكشف ، إلا أنها قدمت خطرا أعلى بكثير على السلامة وتطلبت مراقبة الغدة الدرقية عن كثب من المجربين. بالإضافة إلى ذلك ، كانت هذه الطرق غير كمية ، وبالتالي ، تحد من القدرة على قياس النخيل الديناميكي ، وكذلك تستغرق وقتا طويلا في الإعداد والتنظيف بسبب معدات الحماية الشخصية الإضافية والمراقبة الإشعاعية. وأخيرا، لم تكن الملصقات المشعة مناسبة تماما للدراسات البروتينية وتقتصر عادة على الكشف عن انخفاض الإنتاجية لبروتينات معينة ذات أهمية. مع اكتشاف المزيد من الركائز ، وحتما تم تحديد الإنزيمات التي تتوسط في كل تعديل ، كان من الواضح أن هناك حاجة إلى طرق كشف جديدة17،18،19،20،21. في وقت واحد تقريبا ، نشأت عدة طرق جديدة للكشف عن البروتينات الأسيلية الدهنية. الأول يستغل انعكاس وتفاعل رابطة الثيوستر ل S-acylation. يستبدل اختبار تبادل الأسيل والبيوتين (ABE) كيميائيا البالميتات بالبيوتين للسحب اللاحق للبروتينات الأسيلية باستخدام حبات أغاروز أفيدين والكشف المباشر عن طريق اللطخة الغربية22،23،24. بعد ذلك ، تم تطوير وضع العلامات الحيوية المتعامدة للأحماض الدهنية والإضافة الانتقائية الكيميائية إلى العلامات أو المقابض التي تضمنت استخدام ربط Staudinger وكيمياء النقر25،26،27،28،29،30،31،32،33 . وأخيرا، وعلى غرار ABE، يستبدل الالتقاط بمساعدة راتنج الأسيل (RAC) بشكل أساسي المواقع ذات الأسيل S-acylated بحبات ثيول التفاعلية لالتقاط واكتشاف البروتينات الأسيلية S-acylated34,35. وقد وفرت الفحوصات القائمة على التبادل وكيمياء النقر معا طرقا أكثر كفاءة وحساسية للكشف عن الأسيل وتنقية التقارب للتحليل النهائي وأدت لاحقا إلى اكتشاف الآلاف من البروتينات الأسيلية S-acylated8,36.
يشمل مصطلح كيمياء النقر مجموعة من التفاعلات الكيميائية، ولكنه يشير بشكل شائع إلى آلية تفاعل الأزيدو-ألكين المحفزة Cu(I) [3+2] بين مجموعة ألكينيل ومجموعة أزيدو27،28،37. على وجه الخصوص ، في حالة الأسيل الدهني ، تتضمن كيمياء النقر الكشف عن S-palmitoylation أو N-myristylation من خلال دمج ألكينيل بالميتات الحيوي المتعامد 16-carbon (15-حمض سداسي أديسينويك ؛ 15-HDYA) أو ألكينيل ميريستات 14 كربون (13-tetradecynoic acid ؛ 13-TDYA) ، على التوالي ، في الخلايا لتسمية البروتينات الأسيلية الذاتية المنشأ28 . بعد تحلل الخلايا والترسيب المناعي للبروتين محل الاهتمام ، يتم إجراء تفاعل كيمياء نقرة (ارتباط تساهمي بين الألكين والأزيد) لربط مسبار تقارب ، عادة البيوتين ، للكشف عنه بواسطة اللطخة الغربية28,37. بدلا من ذلك ، يمكن إجراء كيمياء النقر على إجمالي محللات الخلايا ويمكن تنقية البروتينات الأسيلية الدهنية لتحديد الهوية عن طريق قياس الطيف الكتلي. زاد تفاعل كيمياء النقر الأولي مع أزيدو البيوتين من انتقائية وحساسية الكشف أكثر من مليون مرة مقارنة بالنشاط الإشعاعي2. ميزة أخرى لكيمياء النقر هي أنه يمكن دمجها مع طرق وضع العلامات الكلاسيكية الأخرى ، مثل تحليل مطاردة النبض لدوران البروتين باستخدام azido-homoalanine للتحليل الكمي38. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام مجسات الفلورسنت بدلا من البيوتين أو غيرها من المجسات الكيميائية الحيوية ، مثل علامات FLAG أو Myc ، من أجل فحص توطين البروتين16،28،39.
على الرغم من السهولة النسبية لاستخدام كيمياء النقر، يمكن أن يكون الكشف محدودا بسبب انخفاض قابلية الذوبان والسمية المحتملة لاستخدام الأحماض الدهنية الحرة طويلة السلسلة في زراعة الخلايا40. على وجه الخصوص ، على الرغم من تفضيل البالميتات أثناء S-acylation لغالبية البروتينات ، فقد استخدمت العديد من الدراسات ستيرات الكربون 18 (حمض 17-octadecynoic - 17-ODYA) بدلا من البالميتات (15-HDYA) للكشف عن بروتينات S-acylated بسبب توافرها التجاري وتكلفتها المنخفضة نسبيا. ومع ذلك ، فإن 17-ODYA غير قابل للذوبان للغاية ويتطلب اهتماما خاصا عند استخدامه. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تتطلب كيمياء النقر بعض التحضير الدقيق وتخزين المواد الكيميائية. هنا ، يصف البروتوكول نهج وضع العلامات ، الذي يحسن التسليم باستخدام تصبن الأحماض الدهنية ، والتسليم باستخدام BSA الخالي من الأحماض الدهنية ، ومصل البقر الجنيني الخالي من الدهون (FBS) لزيادة قابلية الذوبان وتجاوز الآثار السامة المحتملة لإضافة الأحماض الدهنية الحرة إلى الخلايا 28. تعمل هذه الطريقة في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا وقد استخدمت حتى في الحيوانات الحية28.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>13-tetradecynoic acid (alkynyl myristic acid) (25mM)</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-hexadecynoic acid (alkynyl palmitic acid) (100mM)</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>17-octadecynoic acid (alkynyl stearic acid) (100 mM)</td>
			<td>Cayman Chemical Company</td>
			<td>90270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% acrylamide/bis solution 29:1</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate reader</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFDye 647 azide plus</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GAPDH hFAB Rhodamine</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>12004167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-rabbit Alexa 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tubulin hFAB Rhodamine</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>12004166</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin Azide</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-tris, ultrapure</td>
			<td>VWR</td>
			<td>715</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>1332-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 16,000xg, 4&#176;C</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charcoal STRP FBS One Shot (DCC-FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A3382101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChemiDoc Imager</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate (1 mM)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxycholic acid sodium salt monohydrate</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>102906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent compatible (DC) assay</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0231-500 mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, 1x</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>319015CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, anhydrous</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fatty Acid Free BSA</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>219989950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Blot Turbo Semi-dry transfer</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane</td>
			<td>Pall Life Sciences</td>
			<td>BSP0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]-ethanesulfonic) acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humidified Incubator at 37&#176;C and 5% CO2</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J61055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Lab Software</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine supplement solution</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>609-065-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH1135</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myristic Acid (25 mM)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>M0476-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Palmitic acid (100 mM)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>P0002-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin, 10x</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>450201EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepstatin A (synthetic)</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-260-085-M005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-270-184-G005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 10x, pH 7.4</td>
			<td>VWR</td>
			<td>75801-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Goat antibody to GFP (Affinity Purified)</td>
			<td>Eusera</td>
			<td>EU4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroTrans W PVDF (polyvinylidene fluoride) transfer membrane</td>
			<td>Pall Life Sciences</td>
			<td>BSP0161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide</td>
			<td>Ward&#39;s Science</td>
			<td>470302-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit polyclonal antibody to GFP</td>
			<td>Eusera</td>
			<td>EU1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0241-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP166-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>600-110-EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Alexa Fluor 680 conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>S21378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-(benzyltriazolylmethyl)amine (TBTA) (100 uM)</td>
			<td>Click Chemistry Tools</td>
			<td>1061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-(2-carboxyethyl)phosphine HCl (TCEP) (1mM)</td>
			<td>Soltec Ventures</td>
			<td>M115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Wisent Inc</td>
			<td>325-043-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20 Reagent Grade 1L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WHEATON NextGen V Vials 3 mL</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89085-424</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized incorporation of alkynyl fatty acid analogs for the detection of fatty acylated proteins using click chemistry

الأسيل الدهني ، الإضافة التساهمية للأحماض الدهنية المشبعة إلى ركائز البروتين ، مهم في تنظيم عدد لا يحصى من الوظائف الخلوية بالإضافة إلى آثاره في السرطان والأمراض التنكسية العصبية. وقد مكنت التطورات الأخيرة في أساليب الكشف عن الأسيل الدهني من الكشف الفعال وغير الخطير عن البروتينات الأسيلية الدهنية، لا سيما من خلال استخدام كيمياء النقر مع وضع العلامات الحيوية المتعامدة عليها. ومع ذلك ، يمكن أن يكون الكشف عن كيمياء النقر محدودا بسبب ضعف الذوبان والآثار السامة المحتملة لإضافة الأحماض الدهنية طويلة السلسلة إلى مزرعة الخلايا. الموصوف هنا هو نهج وضع العلامات مع التسليم الأمثل باستخدام الأحماض الدهنية الصابونية في تركيبة مع BSA الخالية من الأحماض الدهنية ، وكذلك الوسائط الخالية من الدهون ، والتي يمكن أن تحسن الكشف عن البروتينات الأسيلية الدهنية التي يصعب اكتشافها. كان هذا التأثير أكثر وضوحا مع التناظرية ألكينيل ستيرات ، 17-ODYA ، والتي كانت التناظرية الأحماض الدهنية الأكثر استخداما في الكشف عن كيمياء النقر للبروتينات الأسيلاتية. سيؤدي هذا التعديل إلى تحسين الدمج الخلوي وزيادة الحساسية للكشف عن البروتين الأسيلي. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تطبيق هذا النهج في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا ودمجه مع اختبارات أخرى مثل تحليل مطاردة النبض ، ووضع العلامات المستقرة على النظائر مع الأحماض الأمينية في زراعة الخلايا ، وقياس الطيف الكتلي للتنميط الكمي للبروتينات الأسيلات الدهنية.

يمكن تصور الفرق في كفاءة وضع العلامات بين أحماض الألكنيل الدهنية الصابونية وغير الصابونية (غير النسغ) للكشف عن كيمياء النقر ومقارنتها بكثافة إشارة البروتينات الأسيلية الدهنية من خلال اللطخة الغربية (الشكل 1). لوحظ تأثير ملحوظ مع زيادة طول سلاسل الأسيل . في الخلايا الموسومة بستيرات الألكينيل (alk-stear) ، زاد تصبن الأحماض الدهنية والتسليم مع BSA لوضع العلامات الأيضية بشكل كبير من اكتشاف إشارة البروتين S-acylated من خلال كيمياء النقر والكشف عن طريق مسبار azido الفلورسنت (الشكل 1 ، على اليمين) ، مما يشير إلى زيادة عامة في الدمج الخلوي لتسمية الأحماض الدهنية alkynyl. على العكس من ذلك ، لم يلاحظ أي اختلاف ملحوظ في الخلايا المعالجة بأقصر الأحماض الدهنية وأكثرها قابلية للذوبان ، alkynyl-myristate (alk-myr ؛ 13-tetradecynoic acid أو 13-TDYA). أظهرت الخلايا الموسومة بألكينيل بالميتات (الشكل 1 ، الوسط) زيادة متوسطة في التسمية مقارنة بألكينيل ميريستات (13-TDYA) ، ولكن أقل من ستيرات الألكينيل.
الأهم من ذلك ، أن معالجة أغشية PVDF مع 0.1 M KOH أزالت إلى حد كبير ملصقات الأحماض الدهنية من الخلايا المحتضنة مع ألكينيل بالميتات وستيرات الألكينيل ، مما يؤكد أن غالبية الإشارة كانت من خلال رابطة استر أو ثيوستر (الشكل 1 ، الوسط واليمين ، الألواح السفلية). كما هو متوقع ، كان دمج ألكينيل ميريستات مقاوما في الغالب للقلويات (الشكل 1 ، اليسار ، الألواح السفلية) ، بسبب ارتباط الميريستات بالبروتينات من خلال رابطة أميد.
يوضح الشكل 2 براعة وحساسية كيمياء النقر للكشف عن الأسيل الدهني للبروتينات المناعية. تم نقل خلايا HEK293T مع الهنتينجتين الطرفي C (HTT) الذي تم دمجه في GFP (myr-ctht-GFP) وتم تصنيفه مع ألكينيل ميريستات ، كما هو موضح سابقا18. بعد هطول الأمطار المناعية ، تم إطلاق ctHTT-GFP من الخرز وخضع لكيمياء النقر إلى جانب lysates. لم يتم اكتشاف myristoylation of wildtype (WT) myr-cthtt-GFP في الرواسب المناعية فحسب ، بل تم اكتشافه بقوة في lysates ، في حين أن طفرة G2A منعت تماما myristoylation من ctHTT-GFP (الشكل 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig01.jpg"> الشكل 1: الكشف عن البروتينات الأسيلية الدهنية باستخدام كيمياء النقر. تم احتضان خلايا HEK293T بالأحماض الدهنية المشار إليها مباشرة (غير النسغ) أو بعد التصبن (النسغ) والحضانة مع البروتين الناقل BSA ، كما هو موضح في البروتوكول 2.1-2.7. تم ربط أحماض الألكينيل الدهنية بأزيد الفلورسنت عن طريق إخضاع 100 ميكروغرام من محللات البروتين للكيمياء النقرية ، مفصولة بواسطة SDS-PAGE ، ونقلها إلى أغشية PVDF. بعد العلاج باستخدام 0.1 M Tris pH 7.0 أو 0.1 M KOH ، لعكس روابط الثيوستر ، تم الكشف عن الأسيل الدهني باستخدام أزيد الفلورسنت. تم استخدام GAPDH كعنصر تحكم في التحميل. مكافحة GAPDH رودامين (1:5000). Alk-myr = 13-TDYA ، alk-pal = 15-HDYA ، alk-ste = 17-ODYA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig2v3.jpg"> الشكل 2: الكشف عن N-myristoylated ctHTT-GFP باستخدام كيمياء النقر. تم نقل خلايا HEK293T مع C-terminally مبتورة (ct) وشكل myristoylatable من HTT (myr-ctHTT-GFP) وتم تصنيفها مع ألكينيل ميريستات. تم تضمين شكل غير myristoylatable مع استبدال الجلايسين الأساسي بألانين (G2A). بعد الحصاد والتحلل ، تم ترسيب ctHTT-GFP المناعي باستخدام الماعز المضاد ل GFP. تعرضت Lysates لتفاعل كيمياء النقر (يسار) وكذلك الرواسب المناعية بعد إطلاقها من الخرز. تم الكشف عن Myristoylation باستخدام Streptavidin Alexa 680 (SA680). تم الكشف عن GFP باستخدام الأرنب المضاد GFP في تركيبة مع مكافحة الأرانب Alexa 488. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62107/62107fig3v4.jpg"> الشكل 3: مخطط سير العمل للبروتوكول التجريبي. مخطط سير العمل للخطوات التجريبية الرئيسية في البروتوكول. ويلاحظ عدة نقاط يمكن فيها إيقاف البروتوكول مؤقتا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62107/62107fig3v3large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry at JoVE.com

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

دراسة الأسيل الدهني لها آثار مهمة في تفاعلات البروتين الخلوي والأمراض. يظهر هنا بروتوكول معدل لتحسين الكشف عن كيمياء النقر للبروتينات الأسيلية الدهنية ، والتي يمكن تطبيقها في أنواع مختلفة من الخلايا ودمجها مع فحوصات أخرى ، بما في ذلك مطاردة النبض وقياس الطيف الكتلي.

الدمج الأمثل لنظائر الأحماض الدهنية ألكينيل للكشف عن البروتينات الأسيلات الدهنية باستخدام Click Chemistry

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

تعمل هذه الطريقة على تحسين توصيل الأحماض الدهنية إلى الخلايا وحمايتها من الآثار السامة لتوصيل الأحماض الدهنية المجانية ، وبالتالي ضمان وضع علامات أكثر اتساقا. تعتمد حساسية وكفاءة الكشف عن كيمياء النقر على الامتصاص الفعال لملصق الأحماض الدهنية. وقد أظهرنا أن هذا يمكن تحسينه إلى حد كبير.هناك عدة خطوات من البروتوكول محددة للغاية ويجب اتباعها عن كثب. يمكن أن يوضح العرض المرئي ويظهر ، على سبيل المثال ، كيفية تجنب تكوين المواد الصلبة في مزيج وضع العلامات. لتحضير وسائط وضع العلامات ، استكمل DMEM ب 5٪ dextran / الفحم المطلي FBS ، و 1X البنسلين الستربتومايسين ، واثنين من المليمولار L-glutamine ، و 100 ملليمولار بيروفات الصوديوم ، ثم قم بتسخينه إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.اغسل بلطف الخلايا التائية HEK-293 المطلية قبل يوم واحد في طبق زراعة الأنسجة المكون من ستة آبار مع PBS ، ثم استبدل PBS بوسائط وضع العلامات. احتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 45 دقيقة تقريبا قبل الشروع في وضع العلامات الأيضية بالأحماض الدهنية. لتصبن نظائر الأحماض الدهنية ، ماصة ما لا يقل عن ميكرولترين من الأحماض الدهنية ألكينيل التناظرية مباشرة في الجزء السفلي من قارورة تفاعل مخروطية ثلاثة ملليلترات.ماصة كمية متساوية من هيدروكسيد البوتاسيوم المخفف بالقرب من الجزء السفلي من قارورة التفاعل على حافة الزجاج بحيث يختلط الحجم المستغنى عنه من هيدروكسيد البوتاسيوم مع الأحماض الدهنية. أغلق غطاء القارورة واضغط برفق لخلط المحاليل. سخني قارورة التفاعل عند 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق تقريبا أو حتى يصبح المحلول واضحا ، مما يشير إلى أن الحمض الدهني قد تم دمجه.ومع ذلك ، احرص على ألا يتبخر السائل كثيرا. بعد ذلك ، قامت الماصة بتسخين BSA الخالي من الأحماض الدهنية بنسبة 20٪ مسبقا بحيث تكون نسبة حجم الأحماض الدهنية إلى هيدروكسيد البوتاسيوم إلى BSA الخالية من الأحماض الدهنية هي 1-1-50 ، مما يحقق تركيزا نهائيا من أحماض الألكنيل الدهنية المرتبطة ب 20X BSA. امزج المحلول عن طريق السحب لأعلى ولأسفل ، ثم احتضنه لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.قم بتسمية الخلايا التائية HEK-293 عن طريق إضافة الأحماض الدهنية 20X BSA المترافقة مباشرة إلى وسائط التجويع لتحقيق تركيز نهائي بنسبة 1٪ BSA في 25 ميكرومولار ألكينيل ميريستات أو 100 ميكرومولار ألكينيل بالميتات وستيرات ألكينيل. للمقارنة، أضف سوائل غير صابونية عن طريق سحب ميكرولترين من الأحماض الدهنية غير المصنفة مباشرة إلى وسائط التجويع، ثم ضع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة لمدة ثلاث إلى ست ساعات. بعد اكتمال الحضانة ، اغسل الخلايا بلطف باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة ، ثم قم بحصاد الخلايا وتحليلها بإضافة 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت المعدل RIPA الخالي من EDTA وتدوير الليزات لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.قم بالطرد المركزي للليزات عند 16،000 مرة G لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية ، ثم جمع supernatant في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.7 ملليلتر وتخزينها عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. أحضر 50 إلى 100 ميكروغرام من محللات البروتين في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.7 ملليلتر إلى حجم متساو باستخدام مخزن RIPA المعدل الخالي من EDTA. حافظ على حجم التفاعل صغيرا قدر الإمكان.أضف STS إلى كل عينة لتحقيق تركيز نهائي قدره 1٪ قم بإعداد مزيج رئيسي من كواشف النقر وإضافة وحدات تخزين مناسبة إلى lysates ، ثم اخلطها عن طريق السحب لأعلى ولأسفل. احتضن الليزات في الظلام لمدة 30 دقيقة في حمام مائي 37 درجة مئوية مع خلط من حين لآخر. لهطول الأمطار المناعية ، امزج الليزات مع الأرانب المضادة ل GFP واحتضنها بين عشية وضحاها مع الدوران عند أربع درجات مئوية.أضف 15 إلى 20 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المتوازن مسبقا مع 0.1٪ SDS RIPA إلى كل أنبوب واسمح له بالتفاعل من النهاية إلى النهاية عند أربع درجات مئوية لمدة ثلاث ساعات. اغسل الخرز بمخزن مؤقت للتحلل وأعد تعليقه في 45 ميكرولتر من مخزن HEPES العازل 50 مللي مول الذي يحتوي على 1٪ SDS. سخني الخرز على حرارة 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.أثناء الحضانة ، قم بعكس أو تحريك الأنابيب كل خمس دقائق تقريبا ، ثم قم بتدوير جميع الأنابيب لفترة وجيزة. في حين أن العينات لا تزال دافئة ، اجمع supernatant الذي يحتوي على البروتينات. اجمع 43 ميكرولترا من السوبرناتانت مع سبعة ميكرولترات من المزيج الرئيسي لكواشف النقر واسمح لها بالتفاعل في الظلام لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.على قطعة غربية ، لوحظ تأثير ملحوظ في وضع العلامات على كفاءة الكشف عن كيمياء النقر بين أحماض الألكنيل الدهنية التصبونية وغير الصابونية مع زيادة طول سلاسل الأسيل . في الخلايا المصنفة بستيرات الألكنيل ، زاد تصبن الحمض الدهني والتسليم مع BSA لوضع العلامات الأيضية بشكل كبير من اكتشاف إشارة البروتين الأسيل S من خلال كيمياء النقر والكشف عن طريق مسبار أزيتوبروب الفلورسنت ، مما يشير إلى زيادة عامة في الدمج الخلوي لعلامة الأحماض الدهنية ألكينيل. على العكس من ذلك ، لم يلاحظ أي اختلاف ملحوظ في الخلايا المعالجة بأقصر الأحماض الدهنية وأكثرها قابلية للذوبان ألكينيل ميريستات.أظهرت الخلايا الموسومة ببالميتات ألكينيل زيادة متوسطة في التسمية مقارنة بميريستات ألكينيل ، ولكن أقل من ستيرات ألكينيل. الأهم من ذلك ، أن معالجة أغشية PVDF مع 0.1 هيدروكسيد البوتاسيوم المولي أزالت إلى حد كبير ملصقات الأحماض الدهنية من الخلايا المحتضنة بالميتات الألكنيل وستيرات الألكنيل ، مما يؤكد أن غالبية الإشارة كانت من خلال رابطة استر أو ثيوستر. كما هو متوقع ، كان دمج الميريستات الألكينيل مقاوما للقلويات في الغالب بسبب ارتباط الميريستات بالبروتينات من خلال رابطة أميد.بعد كيمياء النقر، تم الكشف عن myristoylation من النوع البري C-terminal Huntington GFP في الرواسب المناعية، وكذلك الليسات، في حين أن طفرة G2A منعت تماما myristoylation من C-terminal Huntington GFP. بعد كيمياء النقر، يمكننا إجراء تنقية التقارب للبروتينات الأسيلية الدهنية لقياس الطيف الكتلي. هذا قد يؤدي إلى ملف تعريف مختلف من البروتينات الأسيل الدهنية عن طريق حماية الخلايا من السمية.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

Identification of Fatty Acids in Bacillus cereus

تحديد الأحماض الدهنية في<em&gt; العصوية الشمعية</em

The Bacillus species contain branched chain and unsaturated fatty acids (FAs) with diverse positions of the methyl branch (iso or anteiso) and of the ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

التحلل من شيف-قاعدة ني مجمع الظروف عن طريق مناسبة للاحتباس حماية المجموعات حمض عطوب

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Optimized Protocol for the Extraction of Proteins from the Human Mitral Valve

بروتوكول محسن لاستخراج البروتينات من صمام ميترال الإنسان

Analysis of the cellular proteome can help to elucidate the molecular mechanisms underlying diseases due to the development of technologies that permit ...

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

Fatty Acid 13C Isotopologue Profiling Provides Insight into Trophic Carbon Transfer and Lipid Metabolism of Invertebrate Consumers

13ج الأحماض الدهنية إيسوتوبولوجوي التنميط يوفر نظرة ثاقبة نقل الكربون التغذوية والايض الدهني للمستهلكين اللافقاريات

Fatty acids (FAs) are useful biomarkers in food web ecology because they are typically assimilated as a complete molecule and transferred into consumer ...

Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) and Its Application to Protein Conjugation

Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine DOPA and Its Application to Protein Conjugation

إدراج الوراثية بيوسينثيسيزيد لديهيدروكسيفينيلالانيني (دوبا) وتطبيقه على تصريف البروتين

L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) is an amino acid found in the biosynthesis of catecholamines in animals and plants. Because of its particular biochemical ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

التقاط وتحديد البروتينات الحمض النووي الريبي ملزم باستخدام نقرة الكيمياء-وساعدت الجيش الملكي النيبالي-إينتيراكتومي التقاط استراتيجية (كاريك)

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

عزل جزيئات البروتين الدهني من صفار بيض الدجاج لدراسة دمج الأحماض الدهنية المسببة للأمراض البكتيرية في الدهون الفوسفاتية الغشاء

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

الفحص الحركي للنشاط النواسي باستخدام مجسات الحمض النووي

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

الفحص الفلوري القائم على كيمياء النقر ل Apolipoprotein N-acyltransferase من توصيف الإنزيم إلى الفحص عالي الإنتاجية

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support